Resumo As técnicas de cultura in vitro são reconhecidas como eficientes estratégias para a produção de plantas em grande escala, oferecendo também alternativas para a conservação vegetal. Neste trabalho foi estabelecida a micropropagação de Tarenaya rosea utilizando explantes de pecíolo e lâmina foliar cultivados em meio MS contendo 6-benziladenina (BA) e/ou 6-furfurilaminopurina (KIN). Foram avaliadas a taxa de regeneração de brotos obtidos diretamente a partir dos explantes foliares, após 30 dias de cultivo, e a taxa de proliferação após quatro subculturas realizadas a intervalos de 30 dias. A propagação ocorreu tanto por organogênese direta (OD) como indireta (OI). As maiores taxas de regeneração por OD (50% a 100%) foram alcançadas na presença de BA, enquanto que calos morfogênicos (OI) foram formados principalmente em BA+KIN. Explantes cultivados em meio com BA apresentaram a formação de pequenos nódulos enegrecidos na superfície e as análises histológicas revelaram a presença de tricomas glandulares contendo antocianina. O alongamento e o enraizamento dos brotos foram obtidos em meio MS sem suplementação com reguladores de crescimento. As plantas transferidas para condições ex vitro foram aclimatizadas com sucesso, alcançando taxas de 80% de sobrevivência. Os resultados demonstraram o expressivo potencial morfogenético dos explantes foliares de T. rosea, principalmente quando cultivados na presença de 4,4 µM de BA, constituindo nova fonte de material para estudos biotecnológicos e de conservação in vitro.

Abstract In vitro culture techniques are recognized as efficient strategies for large-scale plant production, as well as providing alternatives for plant conservation. In this study the micropropagation of Tarenaya rosea was established using petiole and foliar blade segments cultivated on MS medium with 6-benzyladenine (BA) and/or 6-furfurylaminopurine (KIN). The regeneration rate from explants was evaluated after 30-days in culture, as well as the proliferation rate from explant-derived shoots, reached after four subcultures performed at 30-days in culture. In vitro propagation occurred by both direct (DO) and indirect (IO) organogenesis. The highest regeneration rates by DO (50% to 100%) were reached on media containing only BA, while morphogenic calluses (IO) were mainly formed with BA+KIN. Explants on media with BA showed the presence of small black nodules on their surface, and histological analysis revealed the presence of trichomes with anthocyanin content. Elongation and rooting were reached on growth regulator-free MS. Acclimatization rates around 80% were achieved and the in vitro-regenerated plants were successfully maintained under field conditions. Results show significant morphogenetic potential of T. rosea from leaf explants, mainly when cultivated in the presence of 4.4 µM BA, providing a new alternative source of plant material for biotechnological and in vitro conservation studies.

Abstract Hovenia dulcis is a plant commonly used as a pharmaceutical supplement, having displayed important pharmacological properties such antigiardic, antineoplastic and hepatoprotective. The purpose of this work was investigate the cytotoxic, genotoxic and mutagenic potential from fractions of Hovenia dulcis ethanolic extract on Saccharomyces cerevisiae strains FF18733 (wild type) and CD138 (ogg1). Ethanolic extract from Hovenia dulcis leaves was fractioned using organic solvents according to increasing polarity: Hexane (1:1), dichlorometane (1:1), ethyl acetate (1:1) and butanol (1:1). Three experimental assays were performed, such as (i) inactivation of cultures; (ii) mutagenesis (canavanine resistance system) and (iii) loss of mitochondrial function (petites colonies). The findings shown a decrease in cell viability in FF18733 and CD138 strains; all fractions of the extract were mutagenic in CD138 strain; only ethyl acetate and butanol fractions increased the rate of petites colonies for CD138 strains. Ethyl acetate and n-butanol fractions induces mutagenicity, at the evaluated concentrations, in mitochondrial and genomic DNA in CD138 strain, mediated by oxidative lesions. In conclusion, it is possible to infer that the lesions caused by the extract fractions could be mediated by reactive oxygen species and might reach multiple molecular targets to cause cellular damage.

Resumo Plantas medicinais são uma importante opção terapêutica para uma grande parte da população mundial. A fim de se estabelecer um sistema in vitro para a produção de metabólitos secundários de Hovenia dulcis, foram estudados os efeitos de auxinas, citocininas, ausência de luz e nitrato de prata no desenvolvimento de calos friáveis. Culturas de calos friáveis foram estabelecidas pela primeira vez para a espécie e usadas na obtenção de culturas de células em suspensão. A suplementação com KIN (Cinetina) produziu calos com regiões compactas e friáveis, enquanto a adição do TDZ (Thidiazuron) produziu somente calos compactos. A manutenção das culturas no escuro induziu o aumento da friabilidade quando a auxina PIC (picloram) estava presente no meio de cultura. A adição do nitrato de prata promoveu a formação de calos friáveis. A análise do peso fresco não demonstrou diferença significativa na produção de biomassa e por essa razão 2.0 mg.L-1 foi considerada a concentração mais apropriada. A presença do nitrato de prata não foi necessária para o estabelecimento de culturas de células em suspensão, e a análise do peso seco das culturas demonstrou maior acúmulo de biomassa na ausência dessa substância. O uso de PIC (picloram) na menor concentração (0.625 mg.L-1) promoveu 100% de formação de culturas de células em suspensão na ausência de nitrato de prata com a maior produção de biomassa. Não foram observadas diferenças morfológicas nas diferentes concentrações de PIC. A análise fitoquímica demonstrou a presença de saponinas, flavonoides, flavonóis e catequinas nos extratos obtidos a partir de calos de H. dulcis. Estes resultados demonstram que as culturas de células aqui estabelecidas são potenciais fontes de produção de metabólitos secundários de H. dulcis.

Abstract Medicinal plants are an important therapeutic option for a large share of the world’s population. To establish an in vitro culture system for the production of secondary metabolites from Hovenia dulcis, we studied the effect of auxins, cytokinins, absence of light, and silver nitrate on the development of friable callus. Callus cultures were established for the first time and used to obtain cell suspension cultures. Supplementation with KIN (Kinetin) produced calli with both compact and friable areas, while the addition of TDZ (Thidiazuron) only produced compact callus. The maintenance of cultures in the dark induced a slight enhancement on friability when the auxin PIC (Picloram) was present in the culture medium. The addition of silver nitrate promoted the formation of friable calli. Dry weight analysis showed no significant differences in biomass growth, and, therefore, 2.0 mg.L-1 was considered the most suitable treatment. The presence of silver nitrate was not required for the establishment of cell suspension cultures. Dry weight analysis of cell suspensions showed higher biomass production in the absence of silver nitrate. PIC promoted 100% of cell suspension culture formation in the absence of silver nitrate, and higher biomass production was observed with the lowest concentration (0.625 mg.L-1). No morphological differences were observed among the different concentrations of PIC. Phytochemical screening showed the presence of saponins, flavonoids, flavonols and catechins in the extracts obtained from H. dulcis calli. These results show that the cell cultures herein established are potential sources for the production of H. dulcis secondary metabolites of medicinal interest.

RESUMO A exposição a contaminantes orgânicos como os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos tem atraído considerável atenção devido aos efeitos dessas substâncias sobre a saúde humana, o ambiente e o desenvolvimento vegetal. O presente estudo objetivou avaliar a influência do fenantreno e do benzo[a]pireno sobre a germinação e o desenvolvimento pós-seminal in vitro de R. graveolens. Sementes comerciais descontaminadas foram inoculadas em tubos de ensaio com meio MS suplementado com 0 (controle); 1,0; 5,0 e 10,0 mg L-1 de fenantreno e 0 (controle); 0,001; 0,01 e 0,1 mg L-1 de benzo[a]pireno. Foram avaliados a porcentagem de sementes germinadas, o índice de velocidade de germinação e a entropia. Após dois meses, avaliou-se o comprimento da parte aérea e radicular e contabilizou-se o número de folhas desenvolvidas. Durante o primeiro mês, a presença do fenantreno não alterou o processo germinativo, enquanto que o benzo[a]pireno na concentração de 0,01 mg L-1 proporcionou aumento significativo da germinação (p≤0,05). Durante o segundo mês, as concentrações de 5,0 mg L-1 de fenantreno e de 0,001 mg L-1 benzo[a]pireno resultaram em desenvolvimento radicular significativamente superior. Não foram detectadas diferenças significativas quanto à fitomassa, ao desenvolvimento da parte aérea e número de folhas por plântulas. Tais resultados sugerem potencial para o cultivo de R. graveolens em áreas contaminadas, nos níveis investigados.

ABSTRACT Exposure to organic contaminants, such as polycyclic aromatic hydrocarbons, has attracted considerable attention due to the effects of these substances on human health, the environment and plant development. This study aimed to evaluate the influence of phenanthrene and benzo[a]pyrene on the germination and post-seminal in vitro development of R. graveolens. Decontaminated commercial seeds were inoculated in test tubes with an MS medium supplemented with 0 (control), 1.0, 5.0 and 10.0 mg L-1 phenanthrene and 0 (control), 0.001, 0.01 and 0.1 mg L-1 benzo[a]pyrene. The percentage of germinated seeds, germination speed index and entropy were evaluated. After two months, shoot and root length were all evaluated, and the number of developed leaves was counted. During the first month, the presence of phenanthrene did not alter the germination process, whereas benzo[a]pyrene at a concentration of 0.01 mg L-1 gave a significant increase in germination (p≤0.05). During the second month, the concentrations of 5.0 mg L-1 phenanthrene and 0.001 mg L-1 benzo[a]pyrene resulted in significantly greater root development. No significant differences were found in biomass, shoot development or number of leaves per seedling. Such results suggest the potential for growing R. graveolens in contaminated areas at the levels studied.

Brazilian flora includes numerous species of medicinal importance that can be used to develop new drugs. Plant tissue culture offers strategies for conservation and use of these species allowing continuous production of plants and bioactive substances. Annona mucosa has produced substances such as acetogenins and alkaloids that exhibit antimicrobial activities. The widespread use of antibiotics has led to an increase in multidrug-resistant bacteria, which represents a serious risk of infection. In view of this problem, the aim of this work was to evaluate the antibacterial potential of extracts of A. mucosa obtained by in vitro techniques and also cultured under in vivo conditions. Segments from seedlings were inoculated onto different culture media containing the auxin picloram and the cytokinin kinetin at different concentrations. The calluses obtained were used to produce cell suspension cultures. The materials were subjected to methanol extraction and subsequent fractionation in hexane and dichloromethane. The antimicrobial activity against 20 strains of clinical relevance was evaluated by the macrodilution method at minimum inhibitory and minimum bactericidal concentrations. The extracts showed selective antimicrobial activity, inhibiting the growth of Streptococcus pyogenes and Bacillus thuringiensis at different concentrations. The plant tissue culture methods produced plant materials with antibacterial properties, as well as in vivo grown plants. The antibacterial activity of material obtained through biotechnological procedures of A. mucosa is reported here for the first time.

O gênero Cleome encontra-se distribuído em áreas tropicais e subtropicais do mundo. Cleome dendroides é uma espécie endêmica de Mata Atlântica do estado do Rio de Janeiro, enquanto C. rosea é uma espécie nativa que ocorre principalmente em restingas, ambos ecossistemas que sofrem constante impacto antrópico. Cleome spinosa é frequentemente encontrada em áreas urbanas. Muitas espécies de Cleome têm sido utilizadas na medicina tradicional, como C. spinosa. No presente trabalho, avaliou-se a influência do substrato, da temperatura e da luz sobre a germinação in vivo das três espécies, bem como determinaram-se as condições para germinação in vitro e as etapas do desenvolvimento pós-seminal. Observaram-se que apenas sementes de C. spinosa apresentam dormência fisiológica, a qual é superada utilizando-se temperaturas alternadas. O substrato influenciou significativamente a germinação de C. rosea e as sementes de C. dendroides apresentaram alta porcentagem de germinação nas diferentes condições avaliadas. As etapas do desenvolvimento pós-seminal sob condições in vivo e in vitro foram definidas. Observou-se que o desenvolvimento sob condições in vitro foi mais acelerado que in vivo. Uma eficiente metodologia para germinação in vitro foi estabelecida para C. dendroides e C. spinosa, fornecendo material juvenil em condições assépticas para futuros experimentos de cultura de tecidos vegetais.

The genus Cleome is widely distributed in drier areas of the tropics and subtropics. Cleome dendroides and C. rosea are Brazilian native species that occur mainly in Atlantic Forest and sandy coastal plains, respectively ecosystems negatively affected by human impacts. Cleome spinosa is frequently found in urban areas. Many Cleome species have been used in traditional medicine, as C. spinosa. In the present work, was investigated C. dendroides, C. rosea and C. spinosa germinative behavior under in vivo conditions, as well as was established suitable conditions to in vitro germination and seedling development. The in vivo germination was performed evaluating the influence of temperature, substrate and light. It was observed that only C. spinosa seeds presents physiological dormancy, which was overcome by using alternate temperatures. The substrate influenced significantly the germination of C. rosea and the seeds of C. dendroides showed the highest germination percentages in the different conditions evaluated. The post-seminal development stages under in vivo and in vitro conditions were defined. It was observed that the development was faster under in vitro than in vivo conditions. An effective methodology for in vitro germination, enabling the providing of material to experiment on plant tissue culture was established to C. dendroides and C. spinosa.

O trabalho descreve um protocolo para a propagação in vitro de Cleome rosea por embriogênese somática. Explantes foliares e caulinares, obtidos de plantas germinadas sob condições in vivo, foram cultivados em meio de Murashige and Skoog (MS) suplementado com ácido 3-indolacético (AIA), ácido naftalenoacético (ANA), ácido 4-amino-3,5,6-tricloropicolínico (picloram) ou ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D). Calos de aspecto nodular foram produzidos a partir de ambos os tipos de explante na presença de 4,5 e 9,0 μM de 2,4-D. O desenvolvimento e a maturação de embriões somáticos foram alcançados quando calos obtidos de explantes caulinares foram transferidos para meio de cultura suplementado com uma concentração de 2,4-D dez vezes menor do que aquelas utilizadas na indução do processo de calogênese (0,45 e 0,90 μM). Calos derivados de explantes foliares não produziram embriões ao serem submetidos a estes mesmos tratamentos. Os maiores valores de freqüência de calos embriogênicos (85%) e número médio de embriões por calo (13,45±2,8) foram alcançados durante a primeira subcultura em meio suplementado com 0,90 μM de 2,4-D. O processo de conversão dos embriões somáticos em plantas foi observado após transferência dos embriões para meio MS sem suplementação hormonal solidificado com 2 g.L-1 de fitagel. Três meses após a transferência para condições ex vitro a taxa de aclimatização alcançada foi de 53% e as plantas apresentavam um aspecto fenotípico normal.

This paper describes a protocol for the efficient vegetative propagation of Cleome rosea by somatic embryogenesis. Leaf and stem explants from nursery-grown seedlings of C. rosea were cultivated on Murashige and Skoog (MS) medium supplemented with indole-3-acetic acid (IAA), a -naphthaleneacetic acid (NAA), 4-amino-3,5,6-trichloropicolinic acid (picloram) or 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D). Nodular calli were produced from both explant types in the presence of 4.5 and 9.0 µM 2,4-D. Embryo development and maturation were achieved when calli from stem explants were transferred to media containing a ten-fold reduction of 2,4-D concentration initially used (0.45 and 0.90 µM). Leaf-derived calli did not form embryos with the same treatments. The highest frequency of embryogenic callus formation (85%) and number of embryo per callus (13.45 ± 2.8) were achieved during the first subculture on medium supplemented with 0.90 µM 2,4-D. Embryo conversion into plantlets was achieved following transfer to growth regulator-free MS medium solidified with 2 g.L-1 phytagel. An acclimatization rate of 53% was found three months after transfer to ex vitro conditions and the recovered plants presented a normal phenotypic aspect.

O presente trabalho apresenta características morfológicas do pseudofruto, fruto e semente de Hovenia dulcis, e etapas do desenvolvimento pós-seminal de plântulas obtidas a partir da germinação sob condições in vivo e in vitro. Avaliou-se a influência da interação temperatura (20, 25, 30, 35ºC, 15-25, 20-30ºC) x substrato (papel germitest, areia, vermiculita), determinando-se as condições mais adequadas para a condução do teste de germinação in vivo. O processo germinativo foi acompanhado durante 60 dias, determinando-se a porcentagem, o índice de velocidade e tempo médio de germinação. Avaliou-se, ainda, a metodologia mais eficiente para superação da dormência das sementes submetendo-as a doze tratamentos. Os pseudofrutos de forma irregular são adocicados e comestíveis. Os frutos são esquizocárpicos, de forma globosa. As sementes orbiculares apresentam variações na coloração e no tamanho, ocorrendo com maior freqüência as sementes castanho-claras grandes. O tegumento é constituído por uma camada de macroesclereídeos, que lhe confere dureza e um certo grau de impermeabilidade. A germinação é epígea fanerocotiledonar. Os cotilédones são orbiculares foliáceos e as folhas membranáceas. A interação temperatura x substrato mais adequada para a germinação sob condições in vivo é 20-30 ºC, em vermiculita, com taxas de 70 % de germinação. Os métodos de superação de dormência mais eficientes são a escarificação mecânica associada ou não à imersão em AG3 e o armazenamento à 10 ºC por 7 dias seguido de escarificação mecânica, obtendo-se de 90 a 97 % de germinação. As plantas provenientes de sementes germinadas in vitro possuem características morfológicas semelhantes àquelas germinadas in vivo, apresentando maior desenvolvimento do sistema radicular e do epicótilo, e maior número de folhas, aos 60 dias da semeadura.

The present study provides information on the morphology of the pseudofruit, fruit and seed of Hovenia dulcis. Some aspects of germination stages and features of the seedlings developed from in vivo and in vitro conditions were also studied. The effect of interaction between temperature (20, 25, 30, 35ºC, 15-25, 20-30ºC) and substrate (germitest paper, sand, vermiculite) was also evaluated in order to determine appropriate conditions to lead the in vivo experiments. The germination process was evaluated during 60 days, by determining percentages of normal seedlings, speed germination and mean time to germination. Treatments to overcome dormancy were examined. The pseudofruits are sweetened and edibles. Fruits are schizocarps and globe-shaped. The orbicular seeds presents a variation in size and colouration and frequently they are big and have light brown coloration. The seed coating is composed of a layer of macrosclereids which confer hardness and impermeability characteristics. The germination is epigeous-phanerocotylar. The cotyledon are orbicularis and foliaceous, and the leaves are membranaceous. The best in vivo conditions to germination has been on vermiculite, at alternating temperature of 20-30ºC, with 70 % of germination. The more efficients treatments of dormancy breaking were mechanical scarification joined or not with gibberellic acid (GA3) and mechanical scarification after seven days on storage (10oC), where 90 to 97 % of germination was achieved. Plants from in vitro germination have morphological features similar in vivo ones, nevertheless, in vitro seedlings present a great root system, more leafs and a developed epycotyl too, after 60 days of the test start.

Este estudio proporciona información sobre las características morfológicas de pseudofrutos, frutos y semillas de Hovenia dulcis. Fueron estudiados algunos aspectos del desarrollo pos-seminal de plántulas obtenidas a partir de germinación in vivo e in vitro. Fue estudiado el efecto de la interacción entre la temperatura (20,25,30,35 oC, 15-20, 20-30 oC ) y el sustrato ( papel para probar la germinación, arena, vermiculita) para determinar las condiciones más apropiadas para realizar los experimentos de germinación in vivo. El proceso de germinación fue evaluado durante 60 días y se determinó el porcentaje, índice de velocidad y tiempo promedio de germinación. Además, fue evaluada una metodología más eficiente para acelerar el período previo a la germinación de las semillas sometidas a estos tratamientos. Los pseudofrutos son dulces y comestibles. Los frutos son esquizocárpicos, de forma globosa. Las semillas orbiculares presentan variaciones en color y tamaño, con mayor frecuencia se encontraron semillas grandes de color castaño claro. El tegumento está constituido por una capa de macroesclereidos que le confieren dureza y cierto grado de impermebilidad a las semillas. Los cotiledones son orbiculares y foliados y las hojas, membranosas. Las mejores condiciones para la germinación in vivo fue en vermiculita con temperaturas entre 20-30 oC , con tasas de geminación de 70 %. Los métodos más eficiente para acelerar el período previo a la germinación fue la escarificación mecánica asociada o no a la inmersión en AG3 o el almacenamiento a 10 oC por 7 días seguido de escarificación mecánica, se obtiene entre 90 y 97 % de germinación. Las plantas provenientes de semillas germinadas in vitro, poseen características morfológicas semejantes a aquellas germinadas in vivo, sin embargo, las primeras tienen un mayor sistema radicular y epicotilo y mayor número de hojas, después de 60 días de iniciado el experimento.

Muitas são as substâncias do metabolismo vegetal que têm despertado grande interesse, principalmente no setor de fármacos. No presente estudo, foram avaliadas as atividades antineoplásica e tripanocida de extratos vegetais de Hovenia dulcis (Rhamnaceae) cultivada sob condições in vivo e in vitro. Extratos metanólicos das folhas de material jovem desenvolvido in vivo e in vitro, exibiram altas porcentagens na inibição do crescimento de todas as linhagens de células tumorais testadas, enquanto extratos etanólicos do pseudofruto mostraram seletividade com elevado percentual de inibição do crescimento celular nas linhagens SP2/0 e BW. Quanto à atividade tripanocida, os extratos aquoso do pseudofruto e metanólico das folhas das plantas germinadas in vivo, apresentaram percentual de inibição em 48 h, de 95% e 100%, respectivamente.

Plants produce a wide range of secondary metabolites, many of which are pharmaceutically important. In this paper were evaluated anti-cancer and trypanocidal activities from Hovenia dulcis (Rhamnaceae) in vivo and in vitro propagated plants. Methanolic extracts of young leaves from in vivo and in vitro material were remarkably active for all tumor cells lines tested, while ethanolic extracts of pseudofruit showed high degree of selectivity against to SP2/0 and BW cells in culture. Mortality of 95 and 100% (48 h) on Trypanosoma cruzi were observed on the aqueous extract of pseudofruit and methanolic extracts of leaves from seedlings.