RESUMO: Haemophilus parasuis é o agente etiológico da doença de Glässer (GD), um processo infeccioso que acomete suínos e que se caracteriza por poliserosites fibrinosas sistêmicas, poliartrites e meningites. O uso intensivo de agentes antimicrobianos na produção de suínos, durante os últimos anos, tem disparado a seleção de cepas bacterianas resistentes a antibióticos. Desta maneira, a avaliação rotineira de susceptibilidade torna-se crucial para assegurar a correta seleção de um antimicrobiano eficaz contra este patógeno. Neste estudo, analisou-se a susceptibilidade antimicrobiana de 50 isolados clínicos de H. parasuis procedentes de granjas localizadas na região sul do Brasil. A identificação e tipificação dos isolados clínicos foi realizada através de uma PCR multiplex combinada com o teste de hemaglutinação indireta modificada. A susceptibilidade de cada isolado foi analisada pelo método de microdiluição em caldo utilizando-se um painel composto por 21 agentes antimicrobianos. Os resultados deste estudo indicam que as cepas clínicas de H. parasuis apresentam alta resistência à gentamicina, bacitracina, lincomicina e tiamulina, no entanto, são susceptíveis a ampicilina, clindamicina, neomicina, penicilina, enrofloxacina e danofloxacina. A análise de susceptibilidade realizada dentro de cada grupo de cepas de um mesmo sorovar indicou que a enrofloxacina é o antibiótico mais efetivo para tratar todos isolados clínicos com exceção daqueles pertencentes ao sorovar 1. Em termos gerais, neste trabalho, demonstra-se o perfil de susceptibilidade de isolados clínicos de H. parasuis aos antimicrobianos comumente utilizados pelos médicos veterinários especialistas em suínos, e reforça-se a necessidade da realização de testes de susceptibilidade antes do início da terapia com antibióticos durante surtos de DG. Além disso, como somente seis antimicrobianos (28.6%) foram efetivos contra os isolados clínicos, uma vigilância contínua do perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos deve ser de grande preocupação para a indústria de suínos.

ABSTRACT: Haemophilus parasuis is the etiological agent of Glässer’s disease (GD), an ubiquitous infection of swine characterized by systemic fibrinous polyserositis, polyarthritis and meningitis. Intensive use of antimicrobial agents in swine husbandries during the last years triggered the development of antibiotic resistances in bacterial pathogens. Thus, regular susceptibility testing is crucial to ensure efficacy of different antimicrobial agents to this porcine pathogen. In this study, 50 clinical isolates from South Brazilian pig herds were characterized and analyzed for their susceptibility to commonly used antibiotic. The identification and typing of clinical isolates was carried out by a modified indirect hemagglutination assay combined with a multiplex PCR. The susceptibility of each isolate was analyzed by broth microdilution method against a panel of 21 antimicrobial compounds. We found that field isolates are highly resistance to gentamycin, bacitracin, lincomycin and tiamulin, but sensitive to ampicillin, clindamycin, neomycin, penicillin, danofloxacin and enrofloxacin. Furthermore, an individual susceptibility analysis indicated that enrofloxacin is effective to treat clinical isolates with the exception of those classified as serovar 1. The results presented here firstly demonstrate the susceptibility of Brazilian clinical isolates of H. parasuis to antimicrobials widely used by swine veterinary practitioners and strengthen the need to perform susceptibility test prior to antibiotic therapy during GD outbreaks. In addition, because only six antimicrobial drugs (28.6%) were found effective against field isolates, a continuous surveillance of the susceptibility profile should be of major concern to the swine industry.

Resumo: Informações sobre as características das imunoglobulinas (Ig) de peixes e a disponibilidade de anticorpos mono ou policlonais são essenciais para avaliar a resposta imune humoral e a distribuição leucocitária de Igs. Nesse trabalho nós demonstramos que a Ig do soro de jundiás é composta por uma cadeia pesada (H) imunodominante, de aproximadamente 75kDA e de uma cadeia leve (L) de aproximadamente 28 kDa, similar à IgM humana. Anticorpos policlonais produzidos contra a Ig do jundiá reconheceram a cadeia H e L e permitiram o desenvolvimento de um ELISA indireto para mensurar a produção de anticorpos em peixes imunizados com albumina sérica bovina. Estudos de reatividade cruzada, por meio de Dot blot e western blot, indicaram um alto grau de compartilhamento de epitopos entre as Igs de diversos peixes Siluriformes e Caraciformes nativos do Brazil. Nestas espécies de peixes, os anticorpos policlonais reconheceram principalmente a cadeia H. Os resultados deste estudo são fundamentais para o desenvolvimento de ferramentas e estratégias para investigar a produção de anticorpos subsequente à imunização e a distribuição tecidual de Igs em peixes nativos. Além disso, devido ao compartilhamento de epitopos entre as espécies de peixes avaliadas, os anticorpos policlonais anti Ig do jundiá poderão ser usados para desenvolver ensaios imunoenzimáticos para avaliar a resposta imune humoral nestas espécies.

Abstract: Knowledge on fish immunoglobulin (Ig) characteristics and the availability of monoclonal or polyclonal antibodies to fish Igs are essential to evaluate the humoral immune response and the Ig distribution on leukocyte cells. We demonstrated that silver catfish serum Ig is composed of one immunodominant H chain with approximately 75k Da and one L chain with approximately 28 kDa, similar to human IgM. Rabbit polyclonal antibodies to the catfish IgM-like Ig recognized both the H and L chain and were useful in developing an indirect ELISA to measure the production of antibodies in fish immunized with bovine serum albumin. Dot blot and western blot cross-reactivity studies indicated a wide degree of epitope sharing amongst Ig from several Siluriformes and Characiformes fish indigenous to Brazilian rivers. In these fish species, polyclonal antibodies reacted mostly with the H chain. The results presented here are central to the development of tools and strategies to investigate the antibody production to inoculated antigens and tissue distribution of Ig molecules in native fish species. Furthermore, because of the wide range of cross-reactivity, polyclonal antibodies to silver catfish IgM-like Ig might be used to develop immunoassays to measure the humoral immune response in other fish species.

A atividade de três fármacos antivirais (Aciclovir [ACV], Ganciclovir [GCV] e Foscarnet [PFA]) foi testada in vitro frente aos herpesvírus bovino tipos 1 (BoHV-1), 2 (BoHV-2) e 5 (BoHV-5). Para isso, utilizou-se o teste de reducao de placas virais em cultivo celular, testando-se diferentes concentracoes dos farmacos frente a 100 doses infectantes para 50% dos cultivos celulares (DICC50) dos respectivos virus. Pelo teste de MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol- 2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide), verificou-se que concentracoes inferiores a 200ƒÊg/mL dos tres antivirais resultaram em indices de viabilidade de celulas MDBK e Hep2 superiores a 80%. Com base na concentracao citotoxica para 50% das celulas (CC50) e na concentracao dos farmacos efetiva para inibir em 50% o numero de placas virais (EC50), calculou-se o indice de seletividade (IS) dos antivirais para os tres herpesvirus. Assim, o ACV demonstrou ser moderadamente ativo frente ao BoHV-1 (EC50: 112,9ƒÊg/mL e IS: 4,5), ao BoHV-2 (EC50: 114,2 ƒÊg/mL e IS: 4,5) e BoHV-5 (EC50: 96,9ƒÊg/mL e IS: 5,3). O GCV apresentou atividade moderada frente ao BoHV-2 (EC50: 33,5ƒÊg/mL e IS: 16,6) e, em menor grau, contra o BoHV-5 (EC50: 123,2ƒÊg/mL e IS: 4,5), sendo ineficaz frente ao BoHV-1 (EC50: 335,8ƒÊg/mL e IS: 1,7). O PFA apresentou atividade antiviral mais pronunciada, sendo o unico farmaco que, na concentracao de 100ƒÊg/mL, inibiu completamente a producao de placas pelos tres virus testados. O PFA foi o mais efetivo in vitro frente ao BoHV-1 (EC50: 29,5ƒÊg/mL e IS: 42,2), ao BoHV-2 (EC50: 45,2ƒÊg/mL e IS: 27,6) e ao BoHV-5 (EC50: 7,8ƒÊg/mL e IS: 160,6). Portanto, os resultados obtidos indicam que o PFA pode se constituir em um candidato para terapia experimental de infeccoes pelos herpesvirus de bovinos in vivo.

The activity of three anti-herpetic drugs (Acyclovir [ACV], Gancyclovir [GCV] and Foscarnet [PFA]) was tested against bovine herpesvirus 1 (BoHV-1), 2 (BoHV-2) and 5 (BoHV-5) in vitro using the plaque reduction assay. Different drug concentrations were tested against one hundred 50% tissue culture infectious dose (TCID50) of the respective viruses. Drug concentrations lower than 200μg/mL resulted in viability rates of more than 80% for MDBK and Hep2 cells in the MTT test (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide). The selectivity index (IS) of the drugs was calculated dividing the concentration of the drug that is cytotoxic for 50% of the cells (CC50) by the concentration of the drug that was effective in reducing by 50% the number of viral plaques (EC50) for the three herpesviruses. Thus, ACV was shown to be moderately active against BoHV-1 (EC50: 112.9μg/mL; IS: 4.5), BoHV-2 (EC50: 114.2μg/mL; IS: 4.5) and BoHV-5 (EC50: 96.9μg/mL; IS: 5.3). GCV was effective against BoHV-2 (EC50: 33.5μg/mL; IS: 16.6), moderately effective against BoHV-5 (EC50: 123.2μg/mL; IS: 4.5) and poorly active against BoHV-1 (EC50: 335.8μg/mL; IS: 1.7). PFA exhibited the highest antiviral activity, being the only drug that, at concentration of 100μg/mL, completely inhibited plaque formation by all three viruses. PFA was the most effective in vitro against BoHV-1 (EC50: 29.5μg/mL; IS: 42.2), BoHV-2 (EC50: 45.2μg/mL; IS: 27.6) and BoHV-5 (EC50: 7.8μg/mL; IS: 160.6). Thus, the results indicate that PFA is a promising candidate for experimental therapeutic testing in vivo against bovine herpesviruses.