Resumen Los oosporangios y anteridios de Charophyceae son los órganos de reproducción sexual femeninos y masculinos respectivamente. Estas estructuras se caracterizan por su complejidad morfológica y utilidad en taxonomía y sistemática. En el presente trabajo se describen los detalles estructurales y ultraestructurales de la gametogénesis en Chara hydropitys. El material fértil del alga se recolectó en una quebrada tributaria del Río Meléndez en la ciudad de Cali, Colombia (3º21´23´´N - 76º32´5.2´´W). Los especímenes fueron fijados y procesados de acuerdo a los protocolos estándar para la inclusión en resina y obtención de secciones finas que se colorearon con toluidina O (0.3-0.7 μm) para su observación en microscopía fotónica y secciones ultrafinas (60-90 nm) para microscopía electrónica de transmisión (MET). Además, se procesaron muestras para microscopio electrónico de barrido (MEB). Los oosporangios están recubiertos por las células espirales que forman de 10-12 circunvoluciones y terminan en cinco células coronulares. La pared de los oosporangios inmaduros está formada por dos capas que corresponden a la pared de las células espirales y de la oosfera. Al madurar la pared del oosporangio tiene seis capas adicionales, tres de las cuales son aportadas por la oospora y las tres restantes por las células espirales. La oosfera aumenta progresivamente de tamaño a medida que las células espirales crecen y se dividen. En el citoplasma de la oosfera inmadura no se aprecian inclusiones citoplasmáticas conspicuas, pero con la maduración el número de gránulos de almidón aumenta llegando a ocupar la mayor parte del volumen celular. En las células espirales del oosporangio maduro se observan numerosos cloroplastos con prominentes depósitos de almidón entre las lamelas tilacoidales y una vacuola que ocupa casi toda la célula. En las observaciones con MEB se aprecia que la pared externa de la oospora, sobre la zona de la fosa presenta microornamentaciones de tipo verrucado. En los anteridios maduros las células del escudo están fuertemente pigmentadas de color naranja por la presencia de numerosos plastoglóbulos entre las lamelas tilacoidales. De las células del capítulo secundario se desarrollan los filamentos espermatógenos que por divisiones mitóticas unidireccionales y sincrónicas forman los espermatocitos. A partir de estas células haploides por espermiogénesis se desarrollarán los anterozoides biflagelados. Los eventos subcelulares relacionados con estos procesos de división y diferenciación celular incluyen inicialmente cambios en la condensación de la cromatina, pérdida del nucléolo y mayor actividad de los dictiosomas. Posteriormente, el citoplasma se retrae y los orgánulos se alinean a lo largo del núcleo condensado y del aparato flagelar. Los anterozoides maduros emergen a través de un poro lateral de la pared de los espermatocitos. Todos los eventos descritos indican que los procesos de gametogénesis y los detalles estructurales de los gametos son por lo general características ampliamente conservadas en este grupo de algas.

Abstract InCharophyceae, the oosporangia and antheridia are the respective female and male structures of sexual reproduction. These organs are characterized by their morphological complexity and usefulness in taxonomy and systematics. Here we described the structural and ultraestructural details of Chara hydropitys gametogenesis. The fertile material from the algae was collected in a tributary stream of the Río Meléndez in Cali, Colombia (3º21´23´´N - 76º32´5.2´´W) in March 2011. The specimens were fixed and processed following the standard protocols for inclusion in resin. Thin sections (0.3-0.5 μm) were stained with toluidine O, and were observed by photonic microscopy, and additional ultrathin sections (60-90 nm) were observed by transmission electron microscopy (TEM); other samples were processed and observed by scanning electron microscopy (SEM). We found that the oosporangia are covered with spiral cells, forming 10-12 convolutions and ends in five coronula cells. The immature oosporangia wall is formed by two layers that correspond to the wall of the spiral cells and to the oosphere. In mature stages, the oosporangia wall is composed by six additional layers, three of them are provided by the oosphere and the other three are provided by the spiral cells. Oosphere size increases progressively while the spiral cells grow and divide. The cytoplasm of the immature oosphere does not exhibit conspicuous cytoplasmic inclusions, nevertheless, with the maturation, the number of starch granules increases, occupying most of the cell volume. In the spiral cells of the mature oosporangia we observed large number of chloroplast with starch accumulations, between thylakoid lamellae and a vacuole that occupies almost the entire cell. By using SEM it was possible to appreciate, that the external wall of the oospore, more accurately, on the fossa area, shows verrucose micro-ornamentations with verrucae elevations. In mature antheridia, shield cells are strongly pigmented orange due to the presence of a large number of plastoglobules between thylakoid lamellae. The spermatogenous filaments are developed from cells of the secondary capitulum; those, by unidirectional and sincronic mitotic divisions develop the spermatocytes. The biflagellate antherozoids are developed from the haploid cells by spermiogenesis. The subcellular events related with these division and differentiation processes, include first, chromatin condensation, loss of nucleoli and more activity in dictyosomes. Subsequently, retracts the cytoplasm and the organelles are aligned along the condensed nucleus and flagellar apparatus. Mature antherozoids emerge through a side wall pore of the spermatocytes. All the described events showed that the gametogenesis processes and the gametes structural details in general, are widely conserved in this algae group.

Estudios sobre aspectos reproductivos, morfología y ultraestructura de las esporas de Lycopodiaceae no son abundantes en la literatura científica y constituyen información esencial para apoyar las relaciones taxonómicas y sistemáticas en el grupo. Con el fin de completar la información existente, añadiendo contribuciones nuevas y más amplias sobre estos temas, se realizó un análisis comparado de la ultraestructura de la esporogénesis, con énfasis en aspectos citológicos que tienen que ver con la formación de la cubierta de los esporocitos, el tapete, las meiosis monoplastidial y poliplastidial, la ontogenia del esporodermo y la ornamentación de las esporas maduras en 43 táxones de ocho géneros de Lycopodiaceae: Austrolycopodium, Diphasium, Diphasiastrum, Huperzia (incluyendo Phlegmariurus), Lycopodium, Lycopodiella, Palhinhaea y Pseudolycopodiella que crecen en los Andes de Colombia y el Neotrópico. Para estudios con microscopía electrónica de trasmisión (MET) las muestras se recolectaron en los departamentos de Cauca y Valle del Cauca, mientras que la mayoría de las muestras para microscopía electrónica de barrido (MEB) provienen de material herborizado de colecciones. Para la observación de las muestras con MET y MEB se utilizaron protocolos estándar para el procesamiento de esporas. La cubierta de los esporocitos está formada por pared primaria; los esporocitos invierten gran parte de su actividad metabólica en la producción de esa cubierta, que es mantenida hasta la liberación de las esporas y tiene funciones de protección de las células que harán meiosis. La abundancia de dictiosomas en los esporocitos se relacionó con la formación y desarrollo de la cubierta. Además de la actividad de los microtúbulos, la presencia de sinuosidades y plegamientos asociados con material electro denso en la membrana de los esporocitos determinarían tempranamente los patrones de ornamentación de las esporas. La condición monoplastidial es común en Lycopodium s.l.y la poliplastidial se observó en Huperzia y Lycopodiella s. l. En especies monoplastidiales el tapete presenta abundantes cuerpos plurivesiculares, en las poliplastidiales la actividad secretora del tapete es menos intensa. El desarrollo del esporodermo es centrípeto, el exosporio se forma primero, seguido del endosporio y el perisporio, si está presente, se deposita de último. En las esporas adultas de Lycopodiaceae se encontraron dos patrones de ornamentación: negativo o caviforme (esporas foveoladas) y positivo o muriforme (esporas rugadas y reticuladas). Las esporas foveoladas son características de Huperzia; las rugadas de unas pocas especies de Huperzia y las especies de Lycopodiella s. l., mientras que las reticulada son típicas de Lycopodium s. l.. Numerosos caracteres de la ornamentación resultan diagnósticos en el nivel específico. Los tipos principales no apoyan la extrema fragmentación reciente de la familia en varios géneros, aunque podría coincidir, a priori, con la idea de tres subfamilias. Los hallazgos de la esporogénesis, extremadamente similar en todos los táxones estudiados, apuntan más a la unificación de los géneros en la familia que a su segregación.

Studies on reproductive aspects, spore morphology and ultrastructure of Lycopodiaceae are not very common in the scientific literature, and constitute essential information to support taxonomic and systematic relationships among the group. In order to complete existing information, adding new and broader contributions on these topics, a comparative analysis of the sporogenesis ultrastructure, with emphasis on cytological aspects of the sporocyte coat development, tapetum, monoplastidic and polyplastidic meiosis, sporoderm ontogeny and ornamentation of the mature spores, was carried out in 43 taxa of eight genera of the Lycopodiaceae: Austrolycopodium, Diphasium, Diphasiastrum, Huperzia (including Phlegmariurus), Lycopodium, Lycopodiella, Palhinhaea and Pseudolycopodiella growing in the Andes of Colombia and the Neotropics. For this study, the transmission electron microscopy (TEM) samples were collected in Cauca and Valle del Cauca Departments, while most of the spores for scanning electron microscopy (SEM) analysis were obtained from herbarium samples. We followed standard preparation procedures for spore observation by TEM and SEM. Results showed that the sporocyte coat is largely composed by primary wall components; the sporocyte develop much of their metabolic activity in the production of their coat, which is retained until the spores release; protective functions for the diploid cells undergoing meiosis is postulated here for this layer. The abundance of dictyosomes in the sporocyte cytoplasm was related to the formation and development of the sporocyte coat. Besides microtubule activity, the membrane of sporocyte folds, associated with electrodense material, and would early determine the final patterns of spore ornamentation. Monoplastidic condition is common in Lycopodium s.l., whereas polyplastidic condition was observed in species of Huperzia and Lycopodiella s. l.. In monoplastidic species, the tapetum presents abundant multivesicular bodies, while in polyplastidic species, the secretory activity of the tapetum is less intense. Sporoderm development is centripetal, exospore is the first formed layer, then the endospore and, if present, perispore is the final deposited layer. Adult spores of the Lycopodiaceae showed two patterns of ornamentation: negative or caviform (foveolate spores) and positive or muriform ornamentation, the latter with two subtypes (rugate and reticulate spores). The spores of Huperzia are characteristically foveolate, the rugate spores were found in a few species of Huperzia and in all of the Lycopodiella s. l. taxa studied, while Lycopodium s.l. spores bear reticulate ornamentation. Numerous ornamentation traits are diagnostic at the specific level. The types of ornamentation found do not support the recent extreme fragmentation of the family in several genera, but could match, a priori, with the idea of three subfamilies. The findings of sporogenesis, extremely similar in all taxa studied, point more to consider fewer genera, more comprehensive, than the recent, markedsplitting of the family. Rev. Biol. Trop. 62 (3): 1161-1195. Epub 2014 September 01.

Los estudios sobre aspectos reproductivos no son muy abundantes en la literatura científica sobre los taxones de Lycopodiaceae y constituyen información esencial para apoyar la taxonomía y relaciones sistemáticas en el grupo. Por lo tanto, se presenta aquí un análisis detallado de la ontogenia de los esporangios y esporogénesis, así como determinaciones químicas de varios compuestos generados durante la formación de las esporas. Los análisis se llevaron a cabo en 14 taxones de seis géneros de la familia: Diphasiastrum, Diphasium, Huperzia (un género que se trata aquí, incluyendo Phlegmariurus), Lycopodiella, Lycopodium y Palhinhaea. Las muestras fueron recolectadas en tres departamentos de los Andes de Colombia entre 1 454-3 677m de altitud. La ontogenia se estudió en trozos de estróbilos y ejes, de 1cm de largo, que se fijaron en glutaraldehido o FAA, se deshidrataron en alcohol, se incluyeron en LR White, se seccionaron en cortes de 0.2-0.5μm y se colorearon con azul de toluidina (TBO), un colorante metacromático que permite detectar tanto esporopolenina como lignina o sus precursores. Para estudios adicionales, secciones de 3-5μm de material incluido en paraplast plus se colorearon con safranina-verde rápido y azul alciánhematoxilina. Las pruebas químicas se llevaron a cabo en secciones de esporangios sin fijar en diferentes etapas de madurez utilizando azul alcián (mucopolisacáridos), solución de Lugol (almidón), Sudán III (lípidos), fluoroglucinol (lignina) y orceína (cromosomas). Las observaciones se efectuaron con microscopio fotónico equipado con contraste diferencial de interferencia (DIC) y microscopía de fluorescencia (para esporas y pared de los esporangios sin colorear). Para observaciones con microscopía electrónica de barrido (MEB), los estróbilos y esporangios se deshidrataron con 2,2 dimetoxipropano, se desecaron a punto crítico y se metalizaron con oro. Los resultados indican que la ontogenia de los esporangios y esporogénesis es muy similar a la observada previamente en Huperzia brevifolia. En las primeras etapas de desarrollo, las paredes celulares de la epidermis del esporangio se cutinizan y en las finales se lignifican. En el desarrollo del esporodermo, la primera capa que se forma es el exosporio, compuesto por esporopolenina. El endosporio es una capa interna delgada compuesta de celulosa, pectina y polisacáridos carboxilados. El perisporio, si está presente, es la última capa que se deposita. Los mucopolisacáridos se encontraron en la cubierta del esporocito, son abundantes en la cavidad esporangial hasta la etapa de tétradas inmaduras y luego desaparecen. Los lípidos son abundantes en esporocitos, tétradas y esporas, y representan la principal fuente de energía de estas. En contraste, el almidón no se detecta en las esporas pero es abundante en esporocitos premeióticos y tétradas inmaduras, ambos con gran actividad metabólica. La fluorescencia intrínseca corrobora la presencia de lignina y cutina en la pared del esporangio, mientras que la esporopolenina se limita al exosporio. Las células de transfusión y el perisporio no siempre están presentes. Sin embargo, los procesos de la ontogenia y esporogénesis son extremadamente similares en todos los taxones estudiados, lo que sugiere que representan rasgos típicos de familia, no específicos ni genéricos.

Studies on reproductive aspects of Lycopodiaceae are not very abundant in the scientific literature, and constitute essential information to support taxonomic and systematic relationships among the group. Here we present a detailed study of the ontogeny of sporangia and sporogenesis, and the chemical determination of several compounds generated during spore formation. The analyses were performed in 14 taxa of six genera of the family, Diphasiastrum, Diphasium, Huperzia (a genus which is treated here including Phlegmariurus), Lycopodiella, Lycopodium and Palhinhaea. Specimens were collected in three departments from the Colombian Andes between 1 454-3 677m altitude. Ontogeny was studied in small, 1cm long pieces of strobili and axis, which were fixed in glutaraldehyde or FAA, dehydrated in alcohol, embedded in LR White, sectioned in 0.2-0.5μm and stained with toluidine blue (TBO), a metachromatic dye that allows to detect both sporopollenin and lignin or its precursors, during these processes. For other studies, paraplast plus-embedded sections (3-5μm) were stained with safranin-fast green and alcian blue-hematoxylin. Chemical tests were also conducted in sections of fresh sporangia at different stages of maturity using alcian blue (mucopolysaccharides), Lugol solution (starch), Sudan III (lipids), phloroglucinol (lignin) and orcein (chromosomes). Sections were observed with photonic microscope equipped with differential interference contrast (DIC) and fluorescence microscopy (for spore and sporangium walls unstained). Strobili and sporangia were dehydrated with 2.2 dimethoxypropane, critical point dried and coated with gold for scanning electron microscopy (SEM). Our results indicated that the ontogeny of sporangia and sporogenesis were very similar to the previously observed in Huperzia brevifolia. Cutinisation occurs in early stages of development of sporangium cell walls, but in their final stages walls become lignified. As for the sporoderm development, the exospore is the first layer formed, composed by sporopollenin. The endospore deposits as a thin inner layer composed of cellulose, pectin and carboxylated polysaccharides. The perispore, if present, deposits at last. Mucopolysaccharides were found on the sporocyte coat and its abundance in sporangial cavity persists up to the immature tetrads stage, and then disappears. The lipids were abundant in the sporocytes, tetrads and spores, representing the main source of energy of the latter. In contrast, starch is not detected in the spores, but is abundant in premeiotic sporocytes and immature tetrads, developmental stages of high cellular metabolic activity. Intrinsic fluorescence corroborates the presence of lignin and cutin in the sporangium wall, while the sporopollenin is restricted to the exospore. The transfusion cells and the perispore are not always present. However, the processes of ontogeny and sporogenesis are extremely similar throughout the taxa studied, suggesting that they represent conservative family traits, nonspecific or generic.

Los estudios sobre aspectos reproductivos son escasos en Equisetum. Por eso, hemos realizado un análisis detallado del proceso de esporogénesis, desarrollo de las esporas, ultraestructura de procesos que tienen lugar durante la meiosis, formación de la pared esporal, orbículas y eláteres de E. bogotense, en especímenes procedentes del Cauca, Colombia. Los estudios se efectuaron mediante microscopía fotónica, electrónica de transmisión (TEM) y de barrido (SEM). Los estróbilos llevan numerosos esporangióforos maduros, cada uno con un escutelo peltado, unido al eje del estróbilo por el manubrio y portador de 5-6 esporangios sésiles. Los esporocitos experimentan meiosis dando origen a tétradas de esporas. El tapete pierde la integridad histológica en las primeras etapas de esporogénesis y rodea los esporocitos premeióticos, posteriormente a las tétradas y finalmente las esporas inmaduras, que experimentan cambios citológicos y de tamaño antes de alcanzar la etapa adulta. El esporodermo de las esporas adultas de E. bogotense consiste de seudoendosporio, exosporio y perisporio. Vistos con MEB, el exosporio de las esporas adultas es liso a rugulado con microperforaciones y el perisporio es muriforme, rugado, con pliegues delicados, estrechos, discontinuos, que se distribuyen al azar y delimitan aréolas incompletas. Externamente el perisporio está cubierto por orbículas, que se forman también en la cara externa y los márgenes de los eláteres. Vistos con TEM, el exosporio es una capa de material granular fino y el perisporio, una capa mucho más delgada con orbículas discretas. Los eláteres están formados por dos capas de naturaleza fibrilar, orientadas longitudinalmente y transversalmente. La esporogénesis en E. bogotense es sincrónica, similar a la de E. giganteum, otra especie de distribución tropical que también crece en Colombia.

Studies on some reproductive traits in Equisetum species are scarce and valuable to understand species distribution. Therefore, a detailed study of the sporogenesis process and spore development in E. bogotense is presented, with an analysis of the main events during meiosis, maturation of spores, spore wall ultrastructure, orbicules and elaters. Specimens were collected from 500 to 4 500m in Cauca, Colombia. Strobili at different maturation stages were fixed, dehydrated, embedded in resin, and ultra-microtome obtained sections were stained with Toluidine blue. Observations were made with optical microscopy with differential interference contrast illumination technique (DIC), transmission and scanning electron microscopy (TEM and SEM). Ultrathin sections (70-80μm) for TEM observations were stained with uranyl acetate and lead citrate; while samples for SEM observations, were fixed, dehydrated in 2.2-dimethoxypropane and dried at critical point as in standard methods. Strobili have numerous mature sporangiophores, each one with a peltate structure, the scutellum, bearing five-six sessile sporangia attached to the axis of strobilus by the manubrium. Immature sporocytes (spore mother cells) are tightly packed within the young sporangia. The sporocytes quickly undergo meiosis, by passing the stage of archesporium and give origin to tetrads of spores. The tapetum loses histological integrity during early stages of sporogenesis, intrudes as a plasmodial mass into the cavity of the sporangium, partially surrounding premeiotic sporocytes, and then, tetrads and adult spores. The tapetum disintegrates towards the end of the sporogenesis, leaving spores free within the sporangial cavity. Spores present several cytological changes that allow them to achieve greater size and increase the number of plastids, before reaching the adult stage. Sporoderm includes three layers external to the cytoplasmic membrane of the spore cell, and they are pseudoendospore, exospore and perispore. Viewed with SEM, the exospore is smooth to rugulate, with micro perforations, while the perispore is muriform, rugate, with narrow, delicate, discontinuous, randomly distributed folds delimiting incomplete, irregular areolae, externally covered by of different size, densely distributed orbicules. These orbicules are also found all over the external face and margins of the elaters, while the internal face is smooth and lack orbicules. Viewed with TEM, the exospore is a thick layer of fine granular material, while perispore is a thinner layer of dense, separate orbicules. The elaters are composed by two layers of fibrillar material: an inner layer with longitudinally oriented fibrils and an outer, thicker and less dense layer with fibrils transversely fibrils and abundant, external orbicules. It is suggested that the processes of ontogeny and characters of the sporoderm are relatively constant in Equisetum; however, sporogenesis in E. bogotense is synchronous and this condition has been observed so far only in E. giganteum, a tropical genus also found in Colombia.