O sequenciamento de Sanger, ou identificação das bases moleculares do DNA por terminação da cadeia, é um dos métodos amplamente utilizados para estudos moleculares. O uso da região citocromo b do DNA mitocondrial como marcador molecular se justifica pela presença de regiões conservadas e variáveis que podem ser sequenciadas e utilizadas em análises filogenéticas em diferentes níveis taxonômicos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a variação do DNA mitocondrial por meio de sequenciamento de Sanger. Para tanto, amostras de tecido sanguíneo de ovinos do grupamento genético Pantaneiro (n=14), Bergamácia (n=4), Dorper (n=5) e Ile de France (n=5) foram utilizadas para extração de DNA. Logo em seguida as amostras foram submetidas a procedimentos de amplificação, purificação e sequenciamento. As análises estatísticas foram realizadas nos programas BioEdit 7.3.1.0 e MEGA 5.10. A utilização de primers internos e externos possibilitou o sequenciamento de 86% da região do citocromo b, o que indicou menor perda de nucleotídeos que acontece na reação de sequenciamento com apenas um par de primers. Os cálculos de diversidade média da região sequenciada permitiram observar baixa variação genética na população, evidenciando a natureza conservada do DNA herdado maternalmente. O sequenciamento parcial da região do citocromo b foi capaz de mostrar a variação do DNA mitocondrial em ovinos de 4 raças diferentes e proporcionou gerar dados para a realização de estudos futuros de origem e evolução dos animais.