Resumen Las enfermedades cardiovasculares representan una de las principales causas de morbilidad y mortalidad a nivel mundial, lo que se traduce en un fuerte impacto económico en el sector salud. El factor VIII (FVIII) es un cofactor esencial en los procesos hemostáticos que participa en la formación del coágulo ante alguna señal de daño vascular. La proteasa trombina es el principal activador fisiológico del FVIII, pero los mecanismos moleculares de reconocimiento del FVIII por la trombina y la formación de los complejos transitorios Michaelis-Menten correspondientes aún no se han descrito en detalle. La cristalografía de rayos X es una técnica que permite resolver la estructura 3D de complejos proteicos, pero requiere la cristalización previa de la muestra a estudiar. Con el objetivo de favorecer la formación de cristales del FVIIIa3 humano (residuos Glu1649-Arg1689) acomplejado con la trombina, se realizó mutagénesis dirigida para generar los doble-mutantes FVIIIa3 (R1689Q, G1690P) y FVIIIa3 (R1689G, G1690P). Estos fragmentos fueron sobreexpresados de forma heteróloga y purificados, obteniendo rendimientos de ~1.5 mg por cada litro de cultivo bacteriano. Esto permitió generar los complejos proteicos FVIIIa3 (R1689Q, G1690P)•trombina y FVIIIa3 (R1689G, G1690P)•trombina en cantidades suficientes para explorar sus espacios de solubilidad de forma extensiva. En total, en cada caso se evaluaron entre 630 y 820 condiciones de cristalización distintas. A partir de esta búsqueda inicial se obtuvo algún tipo de precipitado cristalino en 22 condiciones, 10 de las cuales lograron ser optimizadas para obtener monocristales de alta calidad para posteriores ensayos de difracción con rayos X.

Abstract Cardiovascular diseases are one of the most important causes of morbidity and mortality worldwide, which translates into a strong economic impact in the health sector. Factor VIII (FVIII) is an essential cofactor within the hemostatic processes involved in blood clot formation upon vascular damage. The proteinase thrombin is the most important physiological activator of FVIII, but the molecular mechanisms underlying recognition of FVIII by thrombin and the formation of the corresponding, transient Michaelis-Menten complexes are still only poorly understood. X-ray crystallography allows the resolution of the 3D structure of protein complexes, but a prerequisite is the crystallization of the sample to be analyzed. To grow crystals of the human FVIIIa3 (residues Glu1649-Arg1689) complexed with thrombin, site-directed mutagenesis was performed to generate the double-mutants FVIIIa3 (R1689Q, G1690P) and FVIIIa3 (R1689G, G1690P). Both fragments were overexpressed as heterologous proteins and purified with yields of ~1.5 mg per liter of bacterial culture. Availability of these recombinant proteins allowed in turn generation of FVIIIa3 (R1689Q, G1690P)•thrombin and FVIIIa3 (R1689G, G1690P)•thrombin complexes to perform extensive screenings of their solubility space. Altogether, a total of 630 to 820 different crystallization conditions were evaluated for both complexes. From these initial screen, some sort of crystalline precipitate was obtained in 22 conditions, 10 of which could be optimized to grow high-quality single crystals for subsequent X-ray diffraction analysis.

Resumen A pesar de la relevancia médica y el impacto económico en los sistemas de salud, las enfermedades cardiovasculares, tales como infartos cardíacos y accidentes cerebrovasculares, siguen siendo la principal causa de morbilidad y mortalidad en los países en vías de desarrollo. Esto se debe a que las bases estructurales y funcionales de los procesos de formación de los coágulos sanguíneos o trombos solo se conocen de forma incompleta. La trombina juega un papel esencial en estos procesos y los fundamentos atómico-moleculares de su interacción con otros factores que participan en el proceso de coagulación son poco conocidos, en particular el reconocimiento de importantes sustratos como los factores V y VIII, así como el receptor de plaquetas PAR1. Dada la importancia de estos factores, en esta investigación se produjeron fragmentos del factor VIII humano (FVIII) y se caracterizaron bioquímicamente para realizar ensayos de cristalización de complejos FVIII·Trombina. Para ello, (1) se sobreexpresaron heterólogamente los conectores ácidos entre los dominios del factor VIII (denominados FVIIIa1, FVIIIa2 y FVIIIa3), (2) se purificaron y caracterizaron estos fragmentos recombinantes, (3) se formaron sus complejos con la trombina y (4) se inició la búsqueda de las condiciones de cristalización de estos complejos proteicos. La producción del FVIII, y en particular la determinación de las condiciones en las que crecen cristales del tamaño y calidad apropiados, son un auténtico cuello de botella en los estudios de estructura-función, por ello se considera que la optimización de estos procesos permitirá obtener un mayor número de cristales de proteína de calidad adecuada para futuros estudios de difracción de rayos X.

Abstract In spite of their medical relevance and economic impact on public health service systems, cardiovascular diseases, among them myocardial and cerebral infarctions, remain the main cause of morbidity and mortality in developed and developing countries. One of the main reasons for this situation is the incomplete structural and functional knowledge of the processes that ultimately lead to blood clot formation. Thrombin plays a key role in these processes, but its molecular interactions with other clotting factors are still only poorly understood, in particular those with critically important substrates such as factor VIII and the thrombin receptor on platelets, PAR1. Given the importance of these clotting factors, we have produced and characterized factor VIII fragments (FVIII) to search for crystallization conditions of FVIII·Thrombin complexes. To achieve our aims, we (1) overexpressed the acidic inter-domain linkers of human factor VIII (FVIIIa1, FVIIIa2 and FVIIIa3), as heterologous proteins; (2) purified and characterized these recombinant forms, (3) formed the binary protein complexes between thrombin and these recombinant fragments, and (4) started crystallization trials of these complexes. The FVIII production, and in particular, the identification of conditions in which crystals of appropriate size and quality for structure determination grow, are a “bottleneck” in structure-and-function projects. Therefore, the optimization of these processes will allow us to obtain well-ordered protein crystals for X-ray diffraction studies.