Há poucos estudos sobre aspiração folicular transvaginal guiada por ultrassom na medicina equina abordando complicações futuras na fertilidade das éguas aspiradas. Com o objetivo de avaliar o efeito da aspiração folicular na fertilidade das éguas, foram conduzidos dois experimentos. No experimento I, 15 éguas da raça Crioula foram distribuídas em três grupos de acordo com o diâmetro do folículo aspirado durante o estro: 25-29mm (n=4; grupo 1); 30-34mm (n=6; grupo 2); > 35mm (n=5; grupo 3) e grupo controle (n=15; grupo 4). No experimento II, a aspiração folicular foi realizada em 25 éguas durante o diestro quando pelo menos 4 folículos (>5mm) foram observados na ultrassonografia transretal em ambos os ovários. Foram aspirados todos os folículos visíveis, entre 4 e 8 mm. Trinta e uma éguas serviram como controle. No experimento I, a taxa de prenhez no ciclo seguinte a aspiração foi de 75% (grupo 1), 83,3% (grupo 2), 60% (grupo 3), e 73,3% (grupo 4). No experimento II foi de 76% no grupo aspirado e 77,4% no grupo controle (não aspirado). Em ambos os experimentos, as taxas de prenhez foram similares (P>0,05). Os resultados mostram que a taxa de concepção no primeiro ciclo após a aspiração folicular não é afetada pelo procedimento.

There are few studies about transvaginal ultrasound-guided follicle aspiration in equine medicine regarding potential complications to future fertility of aspirated mares. In order to evaluate the effect of follicular aspiration on subsequent fertility in mares, two experiments were conducted. In Experiment I, fifteen Criollo mares were allocated to one of three groups according to the diameter of the aspirated follicle during estrus: 25-29mm (n=4; Group 1); 30-34mm (n=6; Group 2); > 35mm (n=5; Group 3) and control group (n=15; Group 4). In Experiment II, the follicular aspiration was attempted in twenty-five mares during diestrous, when at least four follicles (> 5mm) were seen in the transrectal ultrasonography of both ovaries. All visible follicles, between 4 and 8 mm, were aspirated. Thirty-one mares served as control. In Experiments I and II, the pregnancy rates in the following cycle after aspiration were 75.0% (Group 1), 83.3% (Group 2), 60.0% (Group 3), and 73.3% (Group 4 - Control); and 76.0% in the aspirated diestrous group and 77.4% in the control group (non aspirated), respectively. On both experiments, pregnancy rates were similar (P>0.05) in treated and control mares. The results of this study show that the conception rates of the first estrus period following follicular aspiration are not affected by the procedure.

The objective of this study was to evaluate the efficacy of cleaning and decontamination procedures in liquid nitrogen tanks. We evaluated 151 canisters and 133 bottoms from 133 nitrogen tanks of companies or farms for the presence of bacteria and fungi. Samples were collected from the canisters and the bottom of tanks containing liquid nitrogen. Tanks were divided into Group 1 (G1): tanks decontaminated with 2% glutaraldehyde - Glutaron® II (n = 16 canisters in 8 tanks); Group 2 (G2): decontamination with 70% ethanol (n = 20 canisters in 10 tanks); and Group 3 (G3): decontamination with 70% ethanol (n = 115 canisters in 115 tanks). Tanks in Groups 1 and 2 belonged to companies; Group 3 tanks belonged to farms. The culture of canisters showed twelve genera of bacteria and five genera of fungi. Bacillus cereuswas the most prevalent bacterial contaminant (42/133) in liquid nitrogen tanks (31.57%). Decontamination by 2% glutaraldehyde plus 70% ethanol was effective and no difference was found between the decontamination methods of Groups 1 and 2. In Group 3 the decontamination method was considered effective. Handling procedures with high hygienic standards should be recommended to avoid contamination of liquid nitrogen tanks on farms.

O índice de prenhez utilizando sêmen criopreservado de garanhões é variável e, além disso, algumas raças apresentam baixa congelabilidade. Foram inseminadas 104 éguas, divididas em dois experimentos, para avaliar a fertilidade do sêmen congelado de garanhões da raça Crioula (n=5), com 5% de dimetilformamida (DMF) ou 5% de glicerol (GLI), como crioprotetores. No Experimento I, as inseminações foram conduzidas pré-ovulação com sêmen fresco e criopreservado com DMF. No Experimento II, as éguas foram inseminadas pós-ovulação com sêmen fresco, DMF e GLI. As inseminações com sêmen congelado foram realizadas no ápice do corno uterino e as éguas do grupo controle foram inseminadas no corpo do útero com sêmen fresco. Para a avaliação dos índices de prenhez dos grupos, utilizou-se um ciclo estral/animal. O diagnóstico de gestação foi realizado por meio de ultrassonografia transretal no 15º dia pós-ovulação. A motilidade média pós-descongelamento foi de 40% e 20%, respectivamente, para o sêmen congelado com DMF e GLI (P<0,05). Todos os garanhões tiveram motilidade superior no pós-descongelamento quando se utilizou a DMF. No Experimento I, o índice de prenhez foi de 12% (5/42) e 62% (20/32), respectivamente, para DMF e sêmen fresco (P<0,0001). No Experimento II, o índice de prenhez foi de 70% (7/10; P<0,05) para o sêmen fresco, 40% para o congelado com DMF (4/10; P<0,05) e 10% com GLI (1/10). A inseminação com sêmen congelado realizada com controle folicular mais frequente apresentou os melhores resultados. A baixa motilidade dos espermatozoides pós-descongelamento foi atribuída ao GLI utilizado no Experimento II. A DMF pode ser utilizada como uma alternativa ao congelamento do sêmen de garanhões da raça Crioula.

Pregnancy rates using stallions's frozen semen are variable; moreover, some breeds present low freezability. One hundred and four (104) mares were inseminated and separeted into two experiments to evaluate fertility of frozen semen's of Criollo stallions (n=5), with 5% of dimethylformamide (DMF) or 5% of glycerol (GLY) as cryoprotectants. In Experiment I, the inseminations were made during pre-ovulation with fresh and frozen semen with DMF. In Experiment II, the mares were inseminated during post-ovulation with fresh semen, DMF and GL. The inseminations with frozen semen were performed deep in the uterine horn ipsilateralis to the dominant follicle. Control mares were inseminated with fresh semen in the uterus. Only one estrus period per mare was used to evaluate the pregnancy rates of the groups. Pregnancy diagnosis through ultrasonography was performed on the 15th day post-ovulation. The mean post-thawing motility was 40% and 20%, respectively, for frozen semen with DMF and GLY (P<0.05). All stallions had higher post-thawing motility when using DMF. In Experiment I, pregnancy rates were 12% (5/42) and 62% (20/32), respectively for DMF and fresh semen (P<0.0001). In Experiment II, pregnancy rates were 40% (4/10), 10% (1/10) and 70% (7/10), respectively for DMF, GLY (P<0.05) and fresh semen (P 0.0001). Insemination with frozen semen performed with more frequent follicular control showed the best results. The low sperm motility after thawing was attributed to the GLY used in experiment II. The DMF can be used alternatively to Criollos Stallion's semen feezing.

Mil duzentos e setenta e um oócitos foram divididos em 4 tratamentos com a finalidade de se avaliar a influência da adição de LH e FSH na produção in vitro de embriões bovinos com soro de vaca em estro (SVE) ou soro de éguas obtido no 1º dia do estro (SE). Independente do tratamento os oócitos foram maturados com TCM199 + 5,95mg/ml de Hepes, 0,025mg/ml de piruvato de sódio e 2,2mg/ml de bicarbonato de sódio, sendo adicionado 10% de soro de égua (ES), 10% de SVE (VS), 10% de soro de égua + 0,5mg/ml de hormônio luteinizante bovino (LHb) + 0,01UI/ml de hormônio folículo estimulante recombinante humano-rFSHh (EH) e 10% SVE + LHb + rFSHh (VH). Os oócitos assim tratados, foram maturados em estufa com 5% de CO2 a 39ºC sob umidade saturada por 22-24h. Depois, foram fecundados em TALP-FERT por 18-20h e cultivados por 8 dias em meio SOF + 5% de SE (ES e EH) ou SVE (VS e VH). As taxas de clivagem de 72% obtidas no grupo VH (229/316) e 61% no grupo VS (193/315) foram significativamente menores (p<0,05) que as dos grupos ES (80% - 254/317) e EH (80% - 257/323). A produção de embriões (blastocistos iniciais, blastocistos, blastocistos expandidos e eclodidos) no D7 após a inseminação para os grupos ES (32%), EH (28%) e VH (27%), foi significativamente superior aos 20% obtidos no VS (p<0,05). No D9, verificou-se uma diferença significativa (p<0,05) entre os grupos ES (31%) e EH (29%) quando comparados com o grupo VS (22%), mas não houve diferença quando comparamos com o VH (24%). A taxa de eclosão em D9 foi de 11% (ES), 11% (EH), 10% (VS) e 5% (VH). Não houve diferença entre as médias do número de células dos embriões (Blastocistos expandidos e eclodidos) obtidos no D9. Conclui-se, com estes resultados que, para a obtenção de taxas regulares de blastocistos, não seja necessária a adição de hormônios quando se utilize o soro de égua, e que os hormônios devam ser adicionados quando se utilize soro de vaca.

A thousand two hundread and seventy-one oocytes were allocated in four treatments, in order to evaluate the influence of the addition of FSH and LH on in vitro production of bovine embryos, with oestrous cow serum (OCS) or mare´s serum obtained at the first day of estrus (OMS). In all treatments oocytes were matured with TCM199 + 5.95mg/ml Hepes and 0.025mg/ml sodium pyruvate and 2.2mg/ml of sodium bicarbonate, supplemented with 10% OMS (ES), 10% of OCS (VS), 10% of OMS + LHb + rFSHh (EH) and 10% of OCS + LHb + rFSHh (VH). All the treatments groups were matured in a controlled incubator at 39ºC with 5% CO2 and saturated humidity for 22-24h. IVF was performed in TALP-FERT for 18-20h, with a pool of Bos taurus semen selected by swim up procedure in TALP-SPERM with 1x106 spermatozoa/ml dose, and cultured for 8 days under SOF medium + 5% OMS (ES and EH) or OCS (VS and VH). The 72% of cleavage rate obtained for treatment VH and 61% obtained in the VS group were significantly less (p<0.05) than treatments EH (80%), ES (80%). Blastocyst rates at D7 after insemination for treatments ES (32%), EH (28%) and VH (27%) were significantly superior than the 20% obtained on VS group (p<0.05). Evaluations at D9 demonstrated higher blastocyst rates in treatment ES (31%) and EH (29%) when compared with treatment VS (22%), but no differences were detected when compared to the VH (24%). These results suggest that the utilization of OCS, the supplementation with FSH and LH renders an increase on blastocyst rates and, that the utilization of MS, even without FSH and LH, shows similar results as those obtained with OCS plus hormones.

Oócitos (n=1177) bovinos obtidos da aspiração de folículos com diâmetro entre 2 e 8mm, de ovários de matadouro foram divididos aleatoriamente em quatro tratamentos com 11 repetições. Os oócitos foram maturados por 24h em TCM-199 Sais de Earle, acrescido de 25mM de bicarbonato de sódio, 25mM de HEPES, rFHS-h, Soro de Vaca em Estro (SVE) e piruvato, em estufa a 39ºC, com 5% de CO2 em ar e umidade saturada (Grupo Controle, n=296) ou, submetidos ao transporte simulado por 6 (T6, n=286), 12 (T12, n=294) ou 18h (T18, n=301) em meio de maturação TCM+HEPES, em banho-maria a 39ºC, com os mesmos componentes utilizados para o Grupo Controle, porém com apenas 1mM de bicarbonato. Decorrido cada período de transporte, os mesmos foram transferidos para placas com meio de maturação, completando o período de 24h em estufa, nas mesmas condições do Grupo Controle. O período de fecundação foi de 18h em condições semelhantes de temperatura e atmosfera gasosa, em FERT-TALP acrescido de heparina, sendo a dose inseminante de 1x106 espermatozóides/mL, selecionados por migração ascendente. Os prováveis zigotos foram cultivados em meio SOF + 5% SVE por 8 dias, em estufa a 39ºC, em bolsas gaseificadas com 5% CO2, 5% O2 e 90% N2. Na avaliação da clivagem, não houve diferença entre os tratamentos. As taxas de desenvolvimento embrionário no dia 7 foram semelhantes para os grupos Controle (20,9%), T6 (19,2%) e T12 (21,4%), com uma redução (P<0,05) observada no grupo T18 (12,3%), em relação aos grupos Controle e T12. No dia 9, o T18 apresentou uma menor (P<0,05) produção de blastocistos expandidos mais eclodidos, em relação aos demais grupos, embora não tenha sido observada diferença (P>0,05) na taxa de eclosão. O número médio de células dos blastocistos eclodidos não diferiu (P>0,05) entre os grupos Controle (136), T6 (125,5) e T12 (126,8). Esses resultados indicam a possibilidade do transporte de oócitos bovinos em meio de maturação TCM+HEPES, sem controle da atmosfera gasosa, a 39ºC, pelo período de até 12h. Esta técnica oferece uma alternativa prática e eficiente para o transporte dos oócitos bovinos destinados à produção in vitro de embriões bovinos (PIV).

Oocytes (n=1177) aspirated from 2 to 8mm follicles obtained from bovine slaughterhouse ovaries (11 replications) were randomly distributed in four treatments. Oocytes were matured for 24h with modified TCM-199 Earle salts, plus 25mM bicarbonate, 25 mM HEPES, rFSH-h, Estrus Cow Serum (ECS), and piruvate at 39ºC, in incubator with 5% CO2 and saturated humidity (Control Group, n=296) or exposed to a simulated transport for 6 (T6, n=286), 12 (T12, n=294) or 18h (T18, n=301) in maturation medium containing TCM + HEPES, in a 39ºC water bath, with the same components used in the Control Group, but with 1mM bicarbonate. At the conclusion of each transport period, oocytes were transferred to dishes with maturation medium to reach 24h in incubator, under the same conditions described for the Control group. Fertilization was accomplished during 18h, with the same temperature and gaseous atmosphere, in FERT-TALP plus heparin. The insemination dose was 1x106 spermatozoa/mL, sorted by swim-up. Presumptive zygotes were cultured in SOF medium + 5% ECS for 8 days, in incubator at 39ºC using gasified bags with 5% CO2, 5% O2 and 90% N2. Cleavage rates did not differ between treatments. Embryonic development rates at D7 were similar for Control (20.9%), T6 (19.2%) and T12 (21.4%) groups, with a reduction (P<0.05) for group T18 (12.3%) when compared to Control and T12 groups. At D9, there was a lower production of expanded plus hatched blastocysts in T18 (P<0.05), without difference (P>0.05) in hatched blastocyst rate. The average number of cells of hatched blastocysts was similar (P>0.05) in Control (136), T6 (125.5) and T12 (126.8) groups. These results indicate the possibility of transporting bovine oocytes in maturation medium containing TCM + HEPES, without controlled gaseous atmosphere environment, at 39ºC, for up to 12 hours. This technique offers a practical and efficient alternative for the transport of bovine oocytes for in vitro production of bovine embryos (IVP).

As freqüências alélicas de sete sistemas de grupos sangüíneos e oito sistemas protéicos foram determinadas em seis rebanhos de cavalos Crioulos criados no Rio Grande do Sul, Brasil. A análise destas freqüências indicou que os rebanhos apresentaram um significativo componente devido ao isolamento (Fst = 0,0866; p<0,01) e esta diferença foi confirmada a partir do dendograma construído, utilizando-se a distância de Nei. Na medição da variabilidade genética, utilizando os 15 sistemas de tipagem sangüínea, os valores mais altos encontrados foram heterozigose média: 0.4631; número total de alelos :87 e probabilidade de exclusão de um parentesco indicado: 98%. Quando todas os rebanhos foram considerada na análise, o nível de endocruzamento (Fis) foi zero. Estes resultados indicam que os cavalos Crioulos apresentam ampla variabilidade genética.

Allelic frequencies of 7 blood groups and 8 protein systems were determined in 6 herds of Criollo horse breed raised in Rio Grande do Sul, Brazil. Analysis of these frequencies showed a significant isolation component (Fst = 0.0866; p<0.01) and construction of dendogram using Nei´s D confirmed this difference among the 6 herds. The highest values measuring genetic variability on 15 blood types were average heterozygosity: 0.4631; total number of alleles: 87 and probability of exclusion: 98%. When all herds were considered together, the inbreeding level (Fis) was zero. These results indicate that the Criollo horses have a large genetic variability.

Complexos Cumulus-Oócito (CCO) bovinos foram divididos em 4 grupos para avaliar o seu comportamento durante a manutenção em LFb e maturação in vitro (MIV) em TCM-199 com ou sem Hepes. CCO MIV por 24h em TCM-199 em estufa a 39°C com 5,00% de CO2 (Controle) tiveram o seu desenvolvimento comparado ao de CCO MIV em tubos repletos de TCM-HEPES (5,95 mg/mL), em banho-maria (BM) a 39ºC por 24h (Grupo 1 - BM24h), ao de CCO mantidos em líquido folicular bovino (LFb), por 6h a 30ºC seguido de maturação por 18h nas mesmas condições que o grupo Controle (Grupo 2 - LFb6C18h) e ao de CCO mantidos em LFb seguido da maturação por 18h sob as mesmas condições que o grupo 1 (Grupo 3 - LFb6BM18h). A fecundação foi realizada em FERT-TALP por 18h. Os zigotos foram cultivados em SOFaaci, sob óleo mineral, em bolsas plásticas gaseificadas. A taxa de clivagem no Grupo Controle foi superior a do Grupo 3 (P<0,05), mas não houve diferença no percentual de blastocistos no D7 e D9 e no de blastocistos eclodidos entre os 4 grupos. Portanto, oócitos podem ser mantidos por 6h em LFb, a 30ºC, antes da maturação em TCM-HEPES por 18h ou ser maturados por 24h, em TCM-HEPES, em banho-maria a 39ºC, sem atmosfera gasosa controlada. A simplificação da MIV aqui introduzida através do preenchimento de tubos de 1,0mL com TCM-HEPES e manutenção em banho-maria a 39ºC, poderá ser uma opção viável e prática para os programas de OPU/PIV em bovinos.

In order to evaluate the effect of a transport medium on the rate of in vitro embryonic development, 1381 Cumulus-oocyte Complexes (COC) were obtained by aspiration of 2-8mm diameter follicles witch were randomly divided in 4 treatment groups. The Control group was formed by oocytes matured in modified TCM-199 for 24h, incubated at 39°C and 5,00% CO2 with saturated humidity. The group 1 (WB24h), included oocytes matured in 1.0mL tubes containing TCM-HEPES (5.95mg/mL), in water bath (WB) at 39°C for 24h. The group 2 (FFb6C18h), included oocytes kept in bovine follicular fluid (FFb) for 6h at 30°C followed by a period of 18h maturation under the same conditions as the Control group and with the oocytes maintained in FFb followed by 18h IVM under the same conditions as the group 1, group 3 (FFb6WB18h). Fertilization was performed in FERT-TALP for 18h. Zygotes were cultured in SOFaaci under mineral oil within gasified bags. The cleavage rate differed (P<0.05) between the Control and FFb6BM18h groups. However, there was no difference on the D7 and D9 blastocyst rates and on the percentage of blastocyst ecloded. It was concluded that it is possible to maintain the oocytes in FFb for 6h at 30°C before 18h IVM, or to proote the transport and maturation of the oocytes for 24h, in TCM-HEPES and water-bath at 39°C, without compromising embryonic development. The simplification of MIV showed in this experiment through of tubes (1.0mL) replete with TCM-HEPES and holding in water bath at 39°C, could be a viable and practice for the bovine programs of OPU/PIV.

Com a maior utilização da OPU existe a necessidade de encontrar alternativas para iniciar as primeiras fases da PIV sem controle da atmosfera. O desenvolvimento de um método prático e simples de transporte/maturação/fecundação permitiria maior eficiência do laboratório e diminuição dos custos de produção. O objetivo deste estudo foi desenvolver um método de maturação e fecundação para complexos cumulus oócitos (CCO) em tubos de polipropileno sem gaseificação, mantidos em banho-maria. A maturação in vitro em estufa foi conduzida em TCM-199 modificado (controle) enquanto que para os tratamentos em banho-maria, em tubos, o meio foi acrescido de 25mM de N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido etanosulfônico (HEPES). Na fecundação in vitro dos oócitos em tubos, os CCO foram mantidos em banho-maria a 39°C em Talp-Fert, acrescido de HEPES em concentrações entre 10mM a 28,7 mM por 10 a 18 horas, sob óleo mineral. O cultivo realizou-se em placas em bolsas gaseificadas com meio SOFaaci com soro de vaca em estro (SVE), sob óleo mineral, em estufa com 5,00%CO2 , 5,00%O2 e 90,00% de N2 a 39°C, por 9 dias. Verificou-se que CCO maturados por 24h em tubos não gaseificados, mantidos em banho-maria também podem ser fecundados em meio Talp-Fert com 25 mM de HEPES, em tubos não gaseificados, mantidos em banho-maria durante 10 horas. As taxas de clivagem, blastocistos em D7 e D9 em tubos não gaseificados foram semelhantes (P>0,05) aos procedimentos em estufa. A fecundação em Talp-Fert com 10 mM a 28,7 mM de HEPES em tubos mantidos em banho-maria prejudica o desenvolvimento embrionário quando conduzida por 18 horas.

The increase in OPU utilization requires an alternative to start the early phases of PIV without a controlled atmosphere. The development of a practical and simple way to transport/mature/fertilize might enhance the efficiency of the laboratory and consequently decrease its production costs. The aim of this study was to develop a method for cumulus oocytes complexes (CCO) maturation and fertilization in polypropylene tubes without atmosphere control kept in water bath. The in vitro maturation performed with controlled atmosphere was in TCM-199 modified (control group). The water bath treatments in tubes the TCM-199 had a addition of 25 mM of N-2-hidroxyethylpiperazine-N'-2-ethanosulfonic acid (HEPES). The CCO in vitro fertilization was performed in Talp-Fert medium with 10mM a 28.7 mM of HEPES, under mineral oil in tubes kept in water bath at 39°C, during 10 to 18 hours. Zygotes were cultured 4 well dishes, in bag system, with SOFaa medium with 5,00% estrus cow serum, under mineral oil, in incubator with 5,00%CO2, 5,00%O2 and 90,00%N2, at 39°C for 9 days. The results showed that CCO can be matured for 24 hours in tubes kept in water bath and also fertilized during 10 hours in tubes with Talp-Fert medium added of 25mM HEPES. The cleavage, D7 and D9 blastocysts rates in tubes without controlled atmosphere were similar (P>0.05) to those in the incubator procedures. However, the fertilization in Talp-Fert medium added of 10mM a 28.7 mM of HEPES in tubes kept in water bath for 18 hours had a detrimental effect on the embryonic development.

Oócitos bovinos têm sido mantidos em fluido folicular como meio para transporte e para aumento de sua competência, antes da maturação. Oitocentos e oitenta e um (881) oócitos foram aspirados de folículos de 2 a 8mm, de ovários de abatedouro, para avaliar o efeito da manutenção de oócitos bovinos em fluido folicular bovino de folículos de diferentes tamanhos sobre o desenvolvimento embrionário. Os oócitos foram distribuídos aleatoriamente em quatro tratamentos, com sete repetições cada. No grupo controle (n=217), os oócitos foram maturados por 24h em TCM-199 com Soro de Égua em Estro (SEE), piruvato e rFSH-h, em estufa a 39°C, com 5,00% de CO2 e umidade saturada. No tratamento FFpequeno (n=216), os oócitos foram mantidos por 6h em fluido folicular de folículos de 3 a 5mm a 30°C e posteriormente maturados por 18h nas mesmas condições do grupo controle. Os oócitos dos tratamentos FFmédio (n=226) e FFgrande (n=222) foram mantidos em fluido folicular de folículos com 5,1 a 8mm e folículos maiores de 8,1mm, respectivamente e, após, maturados por 18h. Após a fecundação por 18h, os zigotos foram cultivados por 8 dias em SOFaaci com 5,00% de SEE, em estufa a 39°C, em bolsas gaseificadas com 5,00%CO2, 5,00%O2 e 90,00%N2. Oócitos do grupo FFpequeno resultaram em menor (P<0,05) taxa de blastocistos em D7 que os grupos Controle e FFgrande. No D9, as taxas de blastocistos e de eclosão não diferiram (P>0,05) entre os grupos. O fluido folicular de folículos médios e grandes pode ser utilizado para o manutenção de oócitos bovinos por 6h a 30°C, antes da maturação por 18h.

Bovine oocytes have been maintained in the follicular fluid to be transported and to increase their competence, before maturation. Eight hundred eighty-one (881) oocytes, aspirated from bovine slaughterhouse ovaries, were used to evaluate the effect of holding bovine oocytes in follicular fluid (FF) of bovine follicles of different diameters on the rate of embryo development. The oocytes were randomly distributed in four treatments with seven replicates each: The control group (n=217) was constituted by oocytes matured for 24h in modified TCM-199 with Estrus Mare Serum (EMS), pyruvate and rFSH-h in incubator with 5,00% CO2, 39°C and saturated humidity. In the FFsmall group (3 to 5mm follicles; n=216), the oocytes were held for 6h in follicular fluid at 30°C and matured for 18h in the same conditions of the Control-group. The oocytes of the FFmedium group (5,1-8mm follicles; n=226) and of the FFlarge group (>8,1mm follicles; n=222) were held in follicular fluid and matured like FFsmall. Fertilization was accomplished during 18h and, after this, the zygotes were cultured for 8 days in SOFaaci medium + 5,00% EMS in incubator at 39°C using plastic bags gasified with 5,00%CO2, 5,00%O2 and 90,00%N2. FFsmall oocytes produced a lower (P<0,05) blastocyst rate than Control and FFlarge groups, at D7. At D9, blastocyst and hatching rates were similar (P>0,05) between the groups. Follicular fluid of medium and large follicles could be used to hold for 6h at 30°C bovine oocytes before their maturation for 18h.

Foi avaliada a influência da citocalasina B na vitrificação de oócitos e embriões bovinos produzidos in vitro. No Experimento I, 956 oócitos foram maturados por 22h, sendo imediatamente vitrificados (tratamento Vitri) ou expostos por 15 a 20 minutos, à solução com 7,5µg/mL (tratamento CB7,5Vitri) ou 45µg/mL (tratamento CB45Vitri) de citocalasina B, antes da vitrificação. Após 30 segundos de exposição à SV1 [400µl TCM-Hepes com 10% soro fetal (SF), 50µl etilenoglicol (EG) e 50µl DMSO], e 20 segundos à SV2 (300µl trealose 1,0M + 20% SF, 100µl EG e 100µl DMSO), os oócitos foram vitrificados em palhetas estiradas (OPS). O reaquecimento foi realizado a 37-38ºC em duas etapas de 5 minutos cada, em trealose 0,3M e 0,15M. Não houve diferenças (P>0,05) nos percentuais de clivagem e desenvolvimento embrionário entre os tratamentos Vitri, Cito7,5Vitri e Cito45Vitri, os quais foram inferiores (P<0,05) ao controle. No Experimento II, 269 blastocistos expandidos foram distribuídos em 3 tratamentos. No tratamento Vitri, os embriões foram expostos por 1 minuto à SV1 e 20 segundos à SV2, a qual foi modificada pela substituição da trealose por TCM-Hepes. No tratamento CB45Vitri, a vitrificação ocorreu após exposição de 10 minutos à solução com 45µg/mL de citocalasina B. Não foram observadas diferenças (P>0,05) no percentual de re-expansão e eclosão entre os grupos Vitri e CB45Vitri, os quais foram inferiores (P<0,05) ao grupo controle. Os resultados indicam que, independentemente da dose utilizada, a exposição a citocalasina B não produz efeito benéfico na vitrificação de oócitos ou blastocistos bovinos produzidos in vitro.

In this study, the influence of cytochalasin B on the survival and development after vitrification of oocytes and in vitro produced (IVP) bovine blastocysts was evaluated. In the Experiment I, 956 oocytes were matured for 22h and were immediately vitrified (Vitri treatment) or exposed for 15-20 minutes, to 7.5µg/ml (CB7.5Vitri treatment) or 45µg/ml (CB45Vitri treatment) cytochalasin B solutions, before vitrification. After 30 seconds of exposure to SV1 [400µl TCM-Hepes with 10% fetal serum (SF), 50µl ethylene glycol (EG) and 50µl DMSO], and 20 seconds to SV2 (300µl trehalose 1,0M + 20% SF, 100µl EG and 100µl DMSO) solutions, the oocytes were vitrified in Open Pulled Straws (OPS). The rewarming was performed at 37-38ºC in two steps of 5 minutes each, into 0.3 and 0.15M trehalose solutions, respectively. There was no difference (P>0.05) in the cleavage and embryo rates between Vitri, Cito7.5Vitri and Cito45Vitri treatments, which were inferior to control group (P<0.05). In the Experiment II, 269 expanded blastocysts were distributed into three treatments. In the Vitri treatment blastocysts were exposed for 1 minute to SV1 and for 20 seconds to SV2 solution, the later one modified using TCM-Hepes instead of trehalose. In the CB45Vitri treatment, embryos were vitrified after being exposed to a 45µg/ml cytochalasin B solution for 10 minutes. The re-expansion and hatching rates were similar to Vitri and CB45Vitri treatments (P>0.05), which were lower than those observed in the Control group (P<0.05). The results show that, independently of dose studied (7.5 or 45mg/ml), cytochalasin B has not a beneficial effect to the vitrification of oocytes and IVP bovine blastocysts.

Embriões bovinos produzidos in vitro foram cultivados individualmente do D7 ao D9, com o intuito de avaliar o seu desenvolvimento posterior. Quarenta e nove embriões, nos estágios de blastocisto inicial, blastocisto e blastocisto expandido foram cultivados, individualmente, em 50ml de meio SOF + 5% SVE, do D7 ao D9 (D0=fecundação). Entre o D7 e D8, os blastocistos foram cultivados em palhetas (TcP) ou em placas (CP) e, entre o D8 e D9, foram cultivados apenas em placas. O índice de blastocistos que avançaram pelo menos um estágio de desenvolvimento, entre D7 e D8, foi de 71%, 37% e 44% no CP e de 100%, 66% e 36% no TcP, respectivamente para blastocistos iniciais, blastocistos e blastocistos expandidos. O percentual total de embriões que evoluíram do D7 para D8 foi de 50% (12/24) para o CP e de 60% (15/25) para o TcP, os quais não foram significativamente diferentes (P>0,05). Na avaliação efetuada no D9, não foram constatadas diferenças (P>0,05) no percentual de blastocistos eclodidos, entre os dois sistemas de cultivo (29% e 24% para CP e TcP, respectivamente). Após coloração fluorescente dos núcleos, não foi observada diferença (P>0,05) entre o número médio de células dos blastocistos eclodidos (182,66 vs. 202,8) e expandidos (94,5 vs. 88), para o CP e TcP, respectivamente. Blastocistos bovinos produzidos in vitro podem ser cultivados individualmente do D7 ao D9, não havendo efeito do sistema de cultivo empregado (placas ou palhetas) sobre a taxa de eclosão e o número de células.

In vitro produced bovine embryos were individually cultured from D7 to D9 to observe their development. Forty-nine blastocysts (early blastocyst, blastocyst and expanded blastocyst) were individually cultured, from D7 to D9 (D0= fertilization), in 50ml SOF medium plus 5% OCS. Between D7 and D8, blastocysts were cultured in straws (SC) or in plates (PC) and from D8 up to D9, they were cultured on plates. The ratio of early blastocyst, blastocyst, and expanded blastocyst advancing at least one stage of development were, respectively, 71%, 37%, 44% in PC and 100%, 66%, 36% in SC (P>0.05). Overall development rates on D8 were not significantly different (P>0.05) for PC (50%) and SC (60%). At D9, both culture systems produced similar (P>0.05) hatching rates (29% and 24% for PC and SC, respectively). After fluorescent nuclei staining, the average number of cells counted in the hatched (182.7 vs. 202.8) and expanding (94.5 vs. 88.0) blastocysts were similar (P>0.05) for PC and SC, respectively. In vitro produced bovine blastocysts can be individually cultured from D7 to D9, and the culture system employed (dishes or straws) has no effect on hatching rates and cell number of developed blastocysts.

A laparoscopia é uma ferramenta pouco explorada nas técnicas assistidas da reprodução em eqüinos, ao contrário do que já ocorre com o homem, animais de zoológicos e domésticos. Este estudo objetivou verificar a possibilidade de oferecer bases para a canulação do oviduto e sua futura aplicação em programas de transferência de gametas e embriões nesta espécie. Foram realizadas 17 laparoscopias em 10 éguas mantidas em estação onde cada ovário foi abordado pelo flanco ipsolateral. Após identificação da tuba uterina, o infundibulum foi gentilmente tracionado e um cateter avançado em direção ao óstio abdominal da tuba uterina para a ampola, onde foram depositados 250 µl de meio de cultivo (Dulbecco's - PBS). A utilização da técnica laparoscópica em reprodução assistida na égua pode ser considerada pioneira e tem o potencial de diminuir os custos de manutenção de receptoras através do aproveitamento de ciclos repetidos, o que não é possível pela abordagem convencional através de laparotomia. Este custo é um dos principais entraves à aplicação comercial das técnicas assistidas da reprodução em eqüinos.

Laparoscopy is a poorly explored tool for equine assisted reproduction techniques, despite its use in man, zoo and domestic animals. This study had the objective to evaluate the possibility and offer basis for cannulation of the oviduct and its future application in gamete and embryo transfer programs in this species. Seventeen standing laparoscopies were accomplished in ten mares, each ovary approached from its ipsolateral flank. After identification of the uterine tube, the infundibulum was gently tractioned and a catheter advanced in direction of the abdominal ostium of the uterine tube to the ampulla where 250 µL of culture medium (Dulbecco's - PBS) were deposited. The laparoscopic technique associated with assisted reproduction in the mare can be considered pioneer and have the potential of lowering costs with maintenance of receptors by taking advantage of repetitive cycles, which is impossible by means of the conventional approach through laparotomy. This cost is one of the main obstacles for the commercial application of assisted reproduction techniques in horses.

A maturação in vitro, fecundação e as técnicas de cultivo de embriões na espécie eqüina são extremamente importantes e necessárias para se examinar as causas de repetição de cio, redução de concepção em éguas velhas e também para a preservação da espécie eqüina. Para avaliar o efeito das gonadotrofinas na regulação da maturação nuclear de oócitos eqüinos, folículos com diâmetro entre 5 a 20mm foram aspirados de 551 ovários provenientes de matadouro obtendo-se 408 oócitos aptos para cultivo. Após a aspiração, os oócitos foram avaliados no próprio líquido folicular quanto a sua integridade e distribuídos nos diferentes tratamentos. No Tratamento I (T1) - grupo controle - os oócitos (n=92) foram cultivados em TCM-199 modificado (mod.), com 25mM de HEPES, 2,2mg/ml de bicarbonato de sódio, 1 mi g/ml 17-beta estradiol, 250mi M de piruvato de sódio e 0,4% de albumina sérica bovina. No tratamento 2 (T2), os oócitos (n= 108) foram cultivados no mesmo meio TC M-199 mod. acrescido de lug/ml de hormônio luteinizante suíno (LHs). No Tratamento 3 (T3), os oócitos (n=102) também foram cultivados em TCM-199 mod. porém com 0,5mi g/ml de hormônio folículo estimulante suíno (FSHs) e no Tratamento 4 (T4) os oócitos (n= 106) foram cultivados com 1mi g/ml de LHs e 0,5mi g/ml, de FSHs. Os oócitos dos quatros tratamentos foram cultivados em estufa a 39°C com 5% de CO2 , e 95% de umidade relativa no ar, durante 24 h. Após este período, as células do Cumulus oophorus foram removidas e os oócitos fixados em solução de ácido acético glacial-metanol (1:3) em placas de Petri 10 x 35mm por 24h sendo posteriormente corados com aceto-orceína. O percentual de oócitos em telófase I / metáfase II foi de 55,6% (59/106) para o T4 (FSHs/LHs) e de 53,9% (55/102) para o T3 (FSHs), os quais não diferiram significativamente. No entanto, estes percentuais foram significativamente superiores (p<0,05) aos observados no Tratamento 1 (22,8%; 21/92) e no Tratamento 2 (32,4%; 35/108). Estes resultados demonstram que o FSHs estimula a maturação nuclear in vitro pois o percentual de oócitos maturos aumentou quando os mesmos foram tratados com FSHs/LHs ou com FSHs somente. O LHs isoladamente, nas concentrações utilizadas, não estimula a maturação nuclear em oócitos eqüinos.

In vitro maturation, in vitro fertilization and embryo culture in equine are extremely important and necessaries for examining reproductive problems in the mare. The aim of the present study was to determine the effect of gonadotropins on nuclear maturation of equine oocytes. Follicles-smaller than 20mm were aspirated from 551 ovaries obtained at slaughterhouse, 408 oocytes suitable for culture being recovered. After aspiration, oocytes were evaluated in follicular fluid and distributed in four treatments. In the first treatment, control group, oocytes (n=92) were cultured for 24 hours in modifled TCM-199 with 25mM HEPES, 2.2mg/ml sodium bicarbonate, 1mug/ml 17 beta estradiol, 250mu M piruvic acid and 0.4% bovino serum albumin. In the second treatment, oocytes (n=108) were cultured in modified TC M-199 plus 1mu g/ml porcine LH. In the third treatment, 102 oocytes were cultured in modifled TCM-199 with the addition of 0.5mu g/ml porcino FSH and on the fourth treatment oocytes (n=106) were cultured in modifled TC M-199 with 1mu g/ml porcine LH and 0.5mug/ml porcine FSH. All four groups were cultured for 24h in an atmosphere with 5% CO2 at 39°C. Afterwards, cumulus cells were removed and oocytes were fixed in acetic acid-methanol (1:3) solution for 24h and stained with aceto-orcein. A significantly greater percentage of MII was observed in oocytes cultured with FSH/LH 59/106 (55.6%) and with FSH 55/102 (53,9%) than in the other groups. When oocytes were cultured in the presence of porcine LH, only 35/108 (32,4%) reached the MII stage, a similar percentage being obtained with the control group. This results demonstrate that equine oocytes cultured in vitro are stimulated to reach metaphase II when they are cultured in the presence of porcine FSH alone or added with porcine LH. Otherwise, porcine LH alone does not stimulate nuclear maturation beyond that obtained with oocytes cultured in the absence of gonadotropins.

Setecentas e quinze mórulas compactas de Mus musculus da cepa Suíço Albina foram vitrificadas, em dois experimentos, para avaliar, in vitro e in vivo, o efeito do tempo de equilíbrio e do pré-resfriamento da solução de vitrificação na sobrevivência após descongelamento. No experimento I (n =417) as mórulas foram vitrificadas em 4 tratamentos utilizando-se dois tempos de equilíbrio (5 e 10 minutos) na solução de vitrificação intracelular composta por 10% de glicerol + 20% de 1,2 propanediol (SVa) e duas temperaturas (4 e 20° C) na solução de vitrificação extracelular composta por 25% de glicerol + 25% de 1,2 propanediol (SVb). A análise estatística não demonstrou diferenças significativas entre os 4 tratamentos, após o descongelamento e cultivo in vitro aos 15 minutos (TI=97%; TII =92%; TIII=92,8%; TIV=94%), 24 horas (TI =90,2%; TII =84%; TIII =83,5%; TIV=89,2%) e 48 horas (TI =79,4%; TII =75%; TIII =73,2% e TIV=77,4%). No experimento II, 298 mórulas foram vitrificadas em 2 tratamentos. No TI foram utilizados 5 minutos de equilíbrio na SVa e SVb a 20°C e no TII 10 minutos na SVa e SVb a 4° C. Considerando apenas as receptoras prenhes, o índice de implantações foi de 54,2% (TI), 52,7% (TII) e 56,1% (frescos), não diferindo entre os tratamentos. Porém o índice de fetos obtido com o TII (45,9%) foi significativamente maior do que o índice obtido com TI (30,5%). A duração do tempo de equilíbrio e o pré-resfriamento da solução de vitrificação influenciaram o desenvolvimento in vivo das mórulas vitrificadas.

To test in vitro and in vivo the effects of the length of equilibration time and precooling of the vitrification solution, 715 mouse morulae, from strain CF1 Swiss Albino, were cryopreserved by vitrification in 2 Experiments. In Experiment I (n=417) morulae were vitrified in 4 treatments, using 2 equilibration times (5 and 10 min) in the intracellular vitrification solution (VSa) composed of 10% glycerol + 20% 1,2 propanediol and 2 temperatures (4 and 20° C) in the extracellular vitrification solution (VSb) composed of 25% glycerol + 25% 1,2 propanediol. The statistical analysis did not show significative differences among the 4 treatments after thawing and culture in vitro whitin 15 minutes (TI =97%; TII =92%; TIII=92,8%; TIV=94%), 24 hours (TI =90,2%; TII =84%; TIII=83,5%; TIV=89,2%) and 48 hours (TI =79,4%; TII =75%; TIII=73,2%; TIV=77,4%). In Experiment II, 298 Mus musculus morulae were vitrified in 2 treatments. In TI embryos were equilibrated for 5 min in VSa and placed in straws containing the VSb at 20°C. In TII embryos were equilibrated for 10 min in VSa and placed in straws containing the VSb at 4°C. Considering only the pregnant recipients, the implantation rate was 54,2%(TI), 52,7%(TII) and 56,1% (controls), not differing among treatments, although the fetal development rate obtained with TII (45,9%) was significantly higher than TI (30,5%). Data indicate that the lenght of equilibration time and precooling of vitrification solution affected the postthaw in vivo survival of vitrified Mus musculus morulae.

RESUMO Duzentos e vinte e cinco embriões de camundongos foram congelados em vapor de nitrogênio, em quatro diferentes tratamentos. No tratamento I (n=57), os embriões foram submetidos a um pré-tratamento em glicerol 5,0, sendo posteriormente colocados em uma solução de glicerol 5,0M + lactose 0,25M. No tratamento II (n=54), o procedimento foi semelhante, porém com a utilização de 0,5M de lactose. No tratamento III (n=57), os embriões foram colocados diretamente na solução de glicerol 5,0M + lactose 0,25M. No tratamento IV (n=57), o procedimento foi semelhante ao tratamento III, porém com a utilização de lactose 0,5M. Os embriões foram mantidos por 5 minutos em cada solução, sendo em seguida envasados em grupos de 6 a 12, em palhetas de 0,25ml. O descongelamento foi realizado em banho-maria a 3 7 °C e a remoção do crioprotetor realizada pela exposição, por 5 minutos, a uma solução de lactose na mesma concentração utilizada no congelamento. Após 48 horas de cultivo, os melhores resultados foram obtidos com o tratamento IV (80,7%), quando comparados ao tratamento III (66, 7%), tratamento II (66,7%) e tratamento I (31,6%). O pré-tratamento exerceu uma influência negativa, determinando menor viabilidade média (49,2%) em relação aos grupos sem pré-tratamento (73,7%). A concentração de lactose 0,5M proporcionou maior viabilidade média (73,7%) que a lactose 0,25M (49,2%).

SUMMARY Two hundred and twenty five morulae were submitted to a ultra rapid freezing in four different treatments. In treatment I (n=57), the embryos were first exposed to a 5.0M glycerol pre treatment, and later to a glycerol 5.0M + lactose 0.25M freezing solution. In the treatment II (n=54) the procedure was similar to the treatment I, but with 0.5M of lactose instead 0.25M. In the treatment III (n=57), the embryos were exposed directly to a glycerol 5.0M + lactose 0.25M freezing solution. In the treatment IV (n=57) the procedure was similar to the treatment III, but with lactose 0.5M instead 0.25M. The embryos were maintened 5 minutes in each solution, and then loaded in groups of 6 to 12, in 0.25ml plastic straws. After thawing in a water bath at 37 °C, the cryoprotector was removed by five minutes exposure to a lactose solution in the same concentration than that used in the freezing procedure. After 48 hours of culture, the highest viability was observed in treatment IV (80.7%), followed by treatment III (66.7%), treatment II (66.7%) and treatment I (31.6%). Pretreatment determined a decrease in the viability (49.2%) when compared with the viability of groups without pre treatment (73.7%). The embryo viability was higher with lactose 0.5M (73.7%) than with lactose 0.25M (49.2%).