ABSTRACT The inoculation of seeds with associative and growth-promoting bacteria is a prosperous mechanism to achieve high germinability rates and production of well-developed plants, in addition to the aspects related to the rhizogenic process in the clonal propagation of superior genotypes. Consequently, the objective of this work was to isolate endophytic bacteria from Pinus caribaea var. hondurensis plant tissues and evaluate its potential as a promoter in seed germination and rooting of P. taeda mini-cuttings. Hence, endophytic bacteria were isolated from Pinus caribaea var. hondurensis micro-plants grown in vitro and phenotypically characterized. From this collection of formed endophytic isolates, in addition to two Azospirillum brasilense commercial strains, seed germination and rooting tests of Pinus taeda L. mini-cuttings were established. Bacterial inoculation promoted the germination rate, germination speed and vigor of the seedlings. A. brasilense and CNPF 316 promoted an increase in the percentage of rooted mini-cuttings, number and average length of roots. The isolates present characteristics of plant growth-promoting bacteria, as they enhance the development of plant physiological and morphological stages. growthpromoting growth promoting welldeveloped well developed plants genotypes Consequently var P minicuttings. minicuttings mini cuttings. cuttings Hence microplants micro characterized strains L established rate seedlings A 31 minicuttings, cuttings, roots stages 3

Resumo O objetivo deste trabalho foi isolar bactérias endofíticas de pupunheira (Bactris gasipaes var. gasipaes) e avaliar os efeitos da inoculação delas em mudas da planta. As bactérias foram isoladas de folhas e raízes das mudas e de meristemas de pupunheira in vitro. Os isolados foram caracterizados fenotipicamente, e, depois, 15 deles, representando grupos fenotípicos distintos, foram selecionados e identificados por meio do sequenciamento parcial do gene 16S rRNA. Em seguida, esses isolados e duas estirpes comerciais de Azospirillum brasilense (Ab-V5 e Ab-V6) foram inoculados em plântulas de pupunheira. Após 76 dias, as mudas foram avaliadas quanto ao desenvolvimento vegetal. Foram identificados os seis seguintes gêneros com base no sequenciamento: Pseudomonas, Enterobacter, Rhizobium, Stenotrophomonas, Klebsiella e Erwinia. Dos 15 isolados inoculados, 9 tiveram efeito positivo sobre a massa de matéria seca de raízes, com destaque para CNPF 77 (Enterobacter sp.), CNPF 100 (Rhizobium sp.), e CNP 179 e CNPF 277 (Stenotrophomonas sp.). Mudas de pupunheira abrigam bactérias endofíticas capazes de aumentar a matéria seca das raízes.

Abstract The objective of this work was to isolate endophytic bacteria from peach palm (Bactris gasipaes var. gasipaes) plants and to evaluate the effects of their inoculation on the plant seedlings. Bacteria were isolated from the leaves and roots of the seedlings and from the meristems of peach palm plants in vitro. The isolates were characterized phenotypically and, then, 15 of them, representing different phenotypic groups, were selected and identified by partial sequencing of the 16S rRNA gene. Afterward, these isolates and two commercial strains of Azospirillum brasilense (Ab-V5 and Ab-V6) were inoculated in the peach palm seedlings. After 76 days, the seedlings were evaluated for plant development. The following six genera were identified based on the sequencing: Pseudomonas, Enterobacter, Rhizobium, Stenotrophomonas, Klebsiella, and Erwinia. Out of the 15 inoculated isolates, 9 had a positive effect on the root dry mass of palm peach, with CNPF 77 (Enterobacter sp.), CNPF 100 (Rhizobium sp.), and CNP 179 and CNPF 277 (Stenotrophomonas sp.) standing out. Peach palm seedlings harbor endophytic bacteria which are able to increase root dry matter.

Resumo: Elaeis oleifera é uma palmeira oleaginosa nativa da América. O fruto contém ácido graxo insaturado, extraído do mesocarpo. A espécie é explorada principalmente em programas de melhoramento genético de E. guineensis, no desenvolvimento de híbridos interespecíficos com maior produtividade de óleo e resistência ao amarelecimento fatal. A propagação de E. oleifera é realizada via semente que requer a adoção de metodologias para superação da dormência, e aumento da taxa de germinação. No entanto, não há estudos sobre a morfologia e anatomia da semente e suas substâncias ergásticas, conhecer a estrutura permite aprimorar e tornar efetivas as metodologias de plantio. O presente trabalho teve como objetivo descrever a morfologia, anatomia e histoquímica da semente caracterizando-a e contribuindo com informações que auxiliem na compreensão da dormência. Em sementes coletadas na área experimental da Embrapa Amazônia Ocidental (Amazonas), foram realizados estudos morfoanatômicos e histoquímicos para detecção de metabólitos (amido, proteína, lipídeo, carboidrato e compostos fenólicos). As sementes apresentaram variação na forma, oblongas e ovadas. O embrião apresenta eixo embrionário obliquo composto por polo radicular e caulinar com três primórdios foliares. No tegumento verificou-se a presença de compostos fenólicos em toda extensão, no embrião e endosperma há presença de lipídeo, proteína e pectina.

Abstract: Elaeis oleifera is an oleaginous palm tree native to America. The fruit contains unsaturated fatty acid extracted from the mesocarp. The species is mainly used in breeding programs of E. guineensis in development of interspecific hybrids with higher oil yield and resistance to lethal yellowing. E. oleifera is propagated by seed, which requires the adoption of methods for breaking dormancy and increasing the germination rate. However, there are no studies on the morphology and anatomy of the seed and its ergastic substances; knowing its structure makes it possible to improve planting methods and make them more effective. The aim of the present study was to describe the morpho-anatomy and histochemistry of the seed, characterizing it and contributing information that assists in understanding dormancy. In seeds collected in the experimental area of Embrapa Amazônia Ocidental (Amazonas), morpho-anatomical and histochemical analysis was conducted to detect metabolites (starch, protein, lipids, carbohydrates, and phenolic compounds). The seeds vary in shape, oblong and ovate. The embryo has an oblique embryonic axis, composed of root apical meristem and shoot apical meristem with three leaf primordia. Phenolic compounds were found throughout the seed coat; there are lipids, protein, and pectin in the embryo and endosperm.

RESUMO O híbrido interespecífico BRS Manicoré (E. guineensis x E. oleifera), tem características agronômicas superiores. Porém, a taxa de germinação é baixa (30%) e o processo demorado quando as sementes são semeadas de forma convencional. O objetivo deste trabalho foi otimizar a germinação in vitro de embriões zigóticos desse híbrido comparando os lotes de sementes. A viabilidade dos embriões zigóticos foi avaliada pelo teste de tetrazólio (0,075%) durante 4 horas. Os embriões foram cultivados nos meios de cultura MS e Y3, com e sem a adição de NaH2PO4, assim como MS, MS 1/2 e N6. No meio MS contendo NaH2PO4, a taxa de germinação é aumentada de 40 a 70% em comparação com o meio sem fosfato. A comparação entre os meios de cultura MS, MS 1/2, N6 e Y3 mostraram que 75% dos embriões zigóticos cultivados no meio Y3 formaram plantas completas (raiz e parte aérea definida), uma porcentagem maior que dos embriões cultivados nos meios MS, MS 1/2 e N6 (46; 35 e 17% respectivamente). No mesmo meio de cultura Y3, os embriões apresentaram tamanho maior (36% ≥ 2 cm e 30% ≥ 5 cm) que nos outros meios. Resultados obtidos pelo teste de tetrazólio foram semelhantes aos de germinação, mostrando o efeito do genótipo de cada lote de sementes. A adição de NaH2PO4 é fundamental para a germinação e o desenvolvimento das plântulas nos meios de cultura que não contêm fosfato ou com baixa concentração de fosfato.

ABSTRACT The interspecific oil palm hybrid BRS Manicoré (E. guineensis x E. oleifera) has superior agronomic characteristics. However, the germination rate is low (30%) and the process is slow when the seeds are sown in a conventional form. The purpose of this study was to optimize the in vitro germination of zygotic embryos of this hybrid comparing seed lots. The viability of zygotic embryos was evaluated by the tetrazolium test (0.075%) for 4 h. The embryos were cultured on MS and Y3 culture media, with and without the addition of NaH2PO4, as well as on MS, MS1/2 and N6 medium. In MS medium containing NaH2PO4, the germination rate was increased from 40 to 70% in comparison with the medium without sodium phosphate. The comparison between the culture media MS, MS 1/2, N6 and Y3 showed that 75% of zygotic embryos cultured in the Y3 medium formed whole plants (with roots and shoots defined), a higher percentage than embryos cultured on MS, MS 1/2 and N6 media (46, 35 and 17% respectively). In the same Y3 culture medium, the embryos were larger (36% ≥ 2 cm and 30% ≥ 5 cm) than in the other media. Results obtained by the tetrazolium test were similar to those of germination, showing the effect of the genotype of each seed lot. For the germination and development of plantlets it is essential to add NaH2PO4 to a culture medium containing no phosphate or with a low phosphate concentration.

Elaeis guineensis es el productor de aceite más eficaz en toneladas por hectárea, su cultivo, cada vez mayor en América Latina, se ha visto perjudicado por el “amarilleamiento letal”. La resistencia genética a esta anomalía se puede encontrar en el germoplasma de la palma aceitera americana o caiaué (E. oleifera), una especie nativa de la selva amazónica. Sin embargo, los procedimientos adoptados para inducir la germinación de las semillas de E. guineensis frecuentemente produce resultados modestos para híbridos interespecíficos. El cultivo de embriones in vitro puede ser una opción viable. En este trabajo se probó el medio líquido MS complementado con diferentes concentraciones de glucosa o sacarosa en el cultivo in vitro de embriones cigóticos de E. guineensis x E. oleifera originados de polinización controlada. Además se investigaron diferentes mezclas de compost para aclimatar los híbridos regenerados. Las concentraciones de 10, 20 y 30 g/L de ambos azúcares se probaron en frascos que contenían cinco embriones cigóticos maduros, con 15 repeticiones por tratamiento y un total de 450 explantes. El número de embriones que muestran brotes y radículas de al menos 2mm de longitud por unidad experimental se evaluó durante la primera fase de cultivo in vitro. Las plántulas que mostraron brotes y radículas fueron trasladadas a la segunda fase de cultivo in vitro y, posteriormente, se aclimataron, por debajo de 70% de sombra con el suministro manual de agua. Los experimentos de aclimatación se llevaron a cabo con 130 plántulas distribuidas al azar en el compost hortícola puro, compost 3:1 o 1:1: mezclas de arena y cada plántula se definió como una unidad experimental. Los datos fueron sometidos a un análisis de varianza, prueba t y análisis de correlación (p≤0.05). Las tasas más altas de emergencia fueron 97% y 73% para brotes y radículas respectivamente, en el medio MS complementado con 20g/L (110mM) de glucosa. Este azúcar en concentraciones de 20 o 30g/L permitió un desarrollo balanceado de brotes/desarrollo de raíces, que fue considerado como una de las razones de la alta frecuencia de establecimiento de las plántulas. El porcentaje de supervivencia fue de un 55% después de los primeros 43 días de aclimatación y por el cuarto mes, 66 plantas desarrollaron simultáneamente hojas largas y un sistema radical en el compost hortícola puro. En conclusión, el desarrollo radicular fue un impedimento para el establecimiento de plántulas y se superó en el medio con glucosa por encima de 110mM. La aclimatación podría beneficiarse con un largo período de desarrollo in vitro.

The African oil palm (Elaeis guineensis) is the most effective oil producer in tons per hectare. Nevertheless, its increasing cultivation in Latin America is harmed by the “lethal yellowing”. Genetic resistance to this anomaly can be found in the germplasm of American oil palm or caiaué (E. oleifera), a native species from the Amazon rainforest. However, the procedures adopted to induce seeds of E. guineensis to germination frequently result mild for interespecific hybrids. Embryo in vitro cultivation can be a viable option. This work was aimed initially to test liquid MS medium supplemented with different glucose or sucrose concentrations for the in vitro cultivation of zygotic embryos from E. guineensis x E. oleifera controlled pollinations. Additionally we investigated different compost mixtures to acclimatize the regenerated hybrid plantlets. Concentrations of 10, 20 and 30g/L of both sugars were tested on flasks containing five mature zygotic embryos, with 15 repetitions per treatment in a total of 450 explants. The number of embryos displaying shoots and radicles at least 2mm in length per experimental unit was evaluated during phase one of in vitro cultivation. Plantlets displaying shoots and radicles were transferred to phase two of in vitro cultivation and subsequently to acclimatization, under 70% shading with manual water supply. The experiments of acclimatization were conducted with 130 plantlets randomly distributed in pure horticultural compost, 3:1 or 1:1 compost:sand mixtures and each plantlet was defined as an experimental unit. Data were submitted to ANOVA, t test and analyzes of correlation (p≤0.05). Highest emergence rates were 97% for shoots and 73% for radicles, observed in MS medium supplemented with 20g/L (110mM) of glucose. This sugar in concentrations of 20 or 30g/L provided balanced shoot/root development, and this was considered one of the reasons for the higher frequency of plantlet establishment. The survival percentage was 55% after the first 43 days of acclimatization and by the fourth month, 66 plants developed simultaneously longer shoot and root systems in pure horticultural compost. in conclusion, radicle development was an impairment to plantlet establishment and was overcame under media with glucose above 110mM. Acclimatization could benefit from an extended period of in vitro development. Rev. Biol. Trop. 59 (3): 1081-1088. Epub 2011 September 01.

Este trabalho teve como objetivo a obtenção de plantas de Eucalyptus camaldulensis a partir de folhas cotiledonares e o estudo da anatomia dos tecidos durante a calogênese e organogênese para determinar a origem das gemas. Folhas cotiledonares foram cultivadas em meios de cultura MS, WPM e JADS suplementados com 2,7 µM de ANA e 4,44 µM de BAP. Os melhores resultados para a regeneração de gemas foram obtidos com os meios MS e WPM. Para o alongamento e enraizamento, o meio de cultura MS/2 contendo 0,2% de carvão ativado apresentou-se eficiente para ambas as etapas. A aclimatização foi realizada mediante a abertura dos frascos na sala de crescimento por 48 horas, seguido da transferência para casa-de-vegetação com nebulização intermitente. Estudos histológicos foram conduzidos e revelaram que a calogênese teve início nas células do parênquima paliçádico e que as gemas adventícias formaram-se a partir dos calos, indicando a organogênese indireta.

The present work aimed at regenerating plants of Eucalyptus camaldulensis from the cotyledonary explants and describing the anatomy of the tissues during callogenesis and organogenesis processes, in order to determine the origin of the buds. The cotyledonary leaves of E. camaldulensis were cultured in Murashige and Skoog (MS), WPM and JADS media supplemented with 2.7 µM NAA and 4.44 µM BAP. The best results for bud regeneration were obtained on MS and WPM media (57.5 and 55% of calluses formed buds, respectively). Shoot elongation and rooting (80%) were obtained on MS/2 medium (with half-strength salt concentration) with 0.2% activated charcoal. Acclimatization was performed in the growth chamber for 48 h and then the plants were transferred to a soil:vermiculite mixture and cultured in a greenhouse. Histological studies revealed that the callogenesis initiated in palisade parenchyma cells and that the adventitious buds were formed from the calluses, indicating indirect organogenesis.

O presente trabalho teve como objetivos determinar o tipo e a concentração de antibióticos adequados para a eliminação de Agrobacterium tumefaciens de explantes inoculados e estabelecer a dose letal mínima do agente seletivo canamicina (Km), sem interferir com o potencial regenerativo do explante cotiledonar de E. camaldulensis. Para a avaliação da eficiência dos antibióticos, cotilédones infectados com A. tumefaciens foram cultivados em meio MS N/2 com BAP, ANA, canamicina e cefotaxima ou AugmentinaÒ . Foi observada a maior média de brotos regenerados por explante (5,4) na presença de 300 mg.L-1 de AugmentinaÒ /15 dias, seguido por 150 mg.L-1/30 dias, e 100 mg.L-1/30 dias. Explantes cotiledonares não transformados foram cultivados em meio de cultura suplementado com antibiótico canamicina onde a concentração adequada para a seleção de células transformadas foi de 9 mg.L-1.

The objectives of the present work were to establish the minimal lethal dose of the selective agent to determine the type and concentration of appropriate antibiotics for the elimination of Agrobacterium tumefaciens inoculated explants, without interfering with the regenerative potential of the E. camaldulensis cotyledonary explants. Non-transformed explants were cultivated in medium supplemented with kanamycin. The results showed that the antibiotic was suitable for the selection of transformed cells in the concentration of 9 mg L-1 as it inhibited the growth of non-transformed cells. Cotyledons infected with A. tumefaciens were cultivated in MS N/2 medium supplemented with BAP, ANA, Km and cefotaxime or AugmentinÒ . The highest average of regenerated shoots by explant (5,4) was observed in the presence of 300 mg L-1 of AugmentinÒ /15 days, followed by 150 mg L-1/15 days and 100 mg L-1/30 days.

O Pau-rosa (Aniba rosaeodora Ducke, Lauraceae) é uma árvore amazônica fonte do mais puro linalol, o qual é o principal componente do seu óleo essencial e muito valioso no mercado internacional de perfumaria. Após várias décadas de intensa exploração, a espécie foi levada à categoria de ameaçada de extinção. Quatro populações naturais distribuídas na bacia Amazônia Central foram avaliadas quanto ao nível e a distribuição da diversidade genética. Trinta e cinco marcadores RAPD reprodutíveis foram gerados, dos quais 32 foram polimórficos (91,4%). A diversidade foi maior dentro das populações (76,5%; p < 0,0001) e a distribuição geográfica contribuiu para a diferenciação entre as populações (23,4%; p < 0,0001). A AMOVA indicou que pode haver uma influência parcial do Rio Amazonas no fluxo gênico (3,3%; p < 0,0001), mas foram identificadas evidências de fluxo gênico atravessando o rio. Houve diferenças significativas nas freqüências dos marcadores (p < 0,05) e o fluxo gênico estimado foi relativamente baixo (Nm = 2,02). A correlação entre a distância genética e o fluxo gênico foi de - 0,95 (p = 0,06) e para a distância geográfica e o fluxo gênico foi de - 0,78 (p = 0,12). Houve um padrão geográfico de variabilidade ao longo do eixo Leste - Oeste, influenciado também pelo Rio Amazonas, o que sugere que o rio poderia funcionar como uma barreira para o fluxo gênico. Apesar de ameaçadas, estas populações de Pau-rosa possuem alta diversidade, com o maior valor na população de Manaus, que vem sendo protegida por 42 anos em uma reserva.

Rosewood (Aniba rosaeodora Ducke, Lauraceae) is an Amazonian evergreen tree and a source of the purest linalool, the main component of its essential oil, which is very valuable in the international perfumery market. After decades of over-exploitation it is currently considered as threatened. We evaluated the genetic diversity and its distribution in four populations in Central Amazonia. Thirty-five reliable RAPD markers were generated, of which 32 were polymorphic (91.4%). Variation was higher within the populations (76.5%; p < 0.0001) and geographic distribution contributed to population differentiation (23.4%; p < 0.0001). The Amazon River had a small influence on gene flow (3.3%; p < 0.0001), but we identified evidence of gene flow across the river. There were significant differences in marker frequencies (p < 0.05), in agreement with the low gene flow (Nm = 2.02). The correlation between genetic distance and gene flow was - 0.95 (p = 0.06) and between geographic distance and gene flow was -0.78 (p = 0.12). There was a geographic cline of variability across an East-West axis, influenced as well by the Amazon River, suggesting the river could be a barrier to gene flow. Although threatened, these Rosewood populations retain high diversity, with the highest levels in the Manaus population, which has been protected for over 42 years in a Reserve.

O Pau-rosa (Aniba rosaeodora Ducke) é uma espécie importante economicamente para a Região Amazônica, porque sua madeira é fonte de linalol, insumo utilizado pelas perfumarias. Esta espécie foi explorada durante décadas e, ainda assim, o conhecimento acerca da diversidade genética intra-específica é muito restrito. Foram objetivos deste trabalho: 1) validar um protocolo para coleta de folhas de pau-rosa que permitisse preservar a integridade do DNA até a estocagem em "freezer"; 2) selecionar um protocolo para extração de DNA em quantidade e qualidade adequadas para geração de bandas RAPD e 3) desenvolver um critério para avaliar o grau de reprodutibilidade que pudesse auxiliar a seleção de bandas RAPD úteis para análises de diversidade genética. Imediatamente após a coleta, as folhas foram acondicionadas em tubos de polietileno com sílica gel e aí permaneceram por até 10 dias. Foram testados três protocolos para a extração de ácidos nucléicos destas folhas, condições ideais para as PCR e a reprodutibilidade dos padrões RAPD. Critérios para a eliminação das bandas que mais contribuíram para o afastamento dos resultados do ideal da reprodutibilidade total foram desenvolvidos e a significância estatística das diferenças geradas pela aplicação dos critérios ao conjunto de dados foi testada. DNA com qualidade e em quantidade suficiente para a geração de padrões RAPD, nas condições ideais definidas para as PCRs, foi obtido. A eliminação de bandas com reprodutibilidade menor que 70% não diferiu do controle. A eliminação de bandas com reprodutibilidade menor que 90% diferiu dos demais tratamentos em todos os arranjos testados (P < 5%).

Rosewood (Aniba rosaeodora Ducke) is one of the economically valuable species in the Amazon region, because it is the principal source of linalool which is demanded by the perfumery industry. This species was submitted to hard exploitation along the past decades and besides this almost nothing is known about its intraspecific genetic diversity. The objectives of this work were: 1) to validate a method to collect rosewood leaves, while preserving the integrity of DNA until storage in freezer; 2) to choose a method for extraction of nucleic acids in quantity and with quality good enough to be used for RAPD and 3) to develop criteria for evaluating the reproducibility, which could help to select RAPD bands useful for genetic diversity analysis. Immediately following collection, the leaves were put in PET flasks partially filled with silica gel and kept there up to 10 days. Three methods for extracting nucleic acids from those leaves, the PCR conditions and the reproducibility of the RAPD patterns produced were tested. Criteria for elimination of bands that contributed to maintain reproducibility away from the ideal, which would be total reproducibility, were developed and the differences produced by application of these criteria were statically tested. DNA with sufficient quality to generate RAPD patterns under the improved conditions defined for the PCRs was obtained. Elimination of bands with reproducibility below 70% did not differ from control. Elimination of bands with reproducibility below 90% differed from all the other treatments tested (P < 5%).

Este trabalho teve como objetivo o estabelecimento in vitro de embriões e de gemas de mudas de pau-rosa (Aniba rosaeodora Ducke) livres de contaminações e de oxidação fenólica. As gemas foram obtidas da rebrota de mudas cultivadas em viveiro e os embriões a partir de sementes em diversos estágios de maturação. Para a assepsia dos explantes foram utilizados dois antibiótico (Ampicilina e Agrimicina), etanol (70%) e hipoclorito de sódio, em concentrações e tempo de exposição variando em função do tratamento. Para o controle da oxidação foram utilizados imersão em ácido ascórbico (250 mg/l) e PVP (Polivinilpirrolidona) no meio Murashige & Skoog (MS). O delineamento estatístico empregado foi o inteiramente ao acaso com tratamentos e repetições em função do tipo de explante. Foi observado 71% de sobrevivência e 53% de germinação de embriões tratados com hipoclorito de sódio (50% e 2% de cloro ativo) por 10 minutos e inoculados em meio MS contendo 20 mg/l de água de côco após 45 dias. As gemas das rebrotas de mudas tratadas com solução de Sulfato de Estreptomicina (Agrimicina) na concentração de 500 mg/l (1h) apresentaram 51% de sobrevivência. Quando submetidas ao pré-tratamento com o emprego de bomba a vácuo (180 mmHg) contendo a Agrimicina (500 mg/l), apresentaram 25% de sobrevivência.

This study deals with the establishment in vitro of Aniba rosaeodora Ducke explants, free from fungical and endogenous contaminations and phenolic oxidation. Bud explants and embryos' seeds from many maturation stages were used in this trial. The explants were disinfected with Ampicilin antibiotic, Streptomicine Sulphate (Agrimicina), etanol (70%), sodium hipoclorite in many concentrations and exposure time acording to the type of explant. For the phenolic oxidation control, the immersion on ascorbic acid and PVP (Polyvinilpirrolidone) in culture medium were used. The explants were inoculated in MS medium. The statistical design was the completely randomized and the treatments and repetitions varied according to the type of explant adopted. After 45 days, 100% of survival and 53% of germination in embryos were observed, which had been desinfested by sodium hipoclorite (50%) for 10 minutes and inoculated in MS medium, supplemented with 20 ml of coconut water. Satisfactory results (51% of survival) were observed in bud´s explants, which had been treated by immersion in 300 mg.l-1 of Agrimicina and 25% when submitted in 500 mg.l-1 on vacuum pre-treatment.