Resumo O desenvolvimento tecnológico de ferramentas que possibilitem a reprodução de diferentes espécies nativas é fundamental para viabilizar iniciativas de conservação ex situ, bem como fornecer meios para produção comercial de peixes ameaçados que, por sua vez, aliviam a pressão pesqueira sobre os estoques selvagens. Peixes migratórios de água doce Neotropicais dependem de indução hormonal para desova em pisciculturas, com métodos caros e de eficiência limitada. Salminus brasiliensis é um dos maiores peixes de água doce Neotropicais, predador de topo piscívoro, admirado na pesca esportiva, muito valorizado no mercado e apreciado na gastronomia. O hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH) é uma molécula-chave na reprodução em todos os vertebrados. Os peixes teleósteos possuem dois ou três genes parálogos de GnRH: GnRH1, GnRH2 e GnRH3. Os produtos de expressão gênica dessas isoformas parálogas consistem em um polipeptídeo maior, pré-pró-GnRH, que sofre processamento proteolítico pós-traducional para produzir o hormônio decapeptídeo ativo. Há um interesse crescente na caracterização e compreensão desses neuropeptídeos, devido à sua aplicação prática na reprodução em pisciculturas. Aqui apresentamos a caracterização da sequência codificadora de GnRH1 para o polipeptídeo pré-pŕo-GnRH1 de S. brasiliensis. Uma anotação de montagem genômica foi usada para procurar parálogos de GnRH, com base em dados de transcritos anônimos preditos em um arquivo de anotação gênica. A sequência recuperada para GnRH1 foi então usada como argumento de busca para procura de parálogos não caracterizados de GnRH, a partir de genomas completos de Characiformes depositados no NCBI. A sequência recuperada de S. brasiliensis do gene GnRH1 foi alvo de PCR e submetida ao sequenciamento Sanger, permitindo a sua confirmação. Esta abrange 423 pb (éxon 1: 128 pb; íntron: 161 pb; éxon 2: 134 pb), com janelas abertas de leitura que codificam para 264 e 88 aminoácidos, respectivamente. As diferentes variantes do pré-pró-GnRH (1, 2 e 3) recuperadas dos genomas completos e sequências depositadas de Characiformes no NCBI agruparam-se em três clados distintos, numa árvore de neighbour joining, cada um formando um ramo monofilético e com as sequências de S. brasiliensis aninhadas dentro dos grupos esperados. Aqui observamos uma variação em um sítio proteolítico (GKR→GRR), até então relatado como altamente conservado em vertebrados, que pode potencialmente alterar o sítio de clivagem e modificar a topologia do peptídeo. Este trabalho caracteriza, pela primeira vez, a sequência do gene GnRH1 que codifica para o peptídeo pré-pró-GnRH1, para um membro da ordem Characiformes. Isto ajudará a promover a pesquisa e o desenvolvimento de ferramentas para a reprodução em piscicultura e a gestão ambiental de S. brasiliensis e outros peixes migratórios relacionados. situ vez selvagens pisciculturas limitada piscívoro esportiva gastronomia GnRH (GnRH moléculachave molécula chave vertebrados GnRH3 maior prépróGnRH, prépróGnRH pré pró póstraducional pós traducional ativo neuropeptídeos prépŕoGnRH1 prépŕoGnRH pŕo pré-pŕo-GnRH S Sanger confirmação 42 1 12 íntron 16 13 pb, , pb) 26 8 aminoácidos respectivamente 1, (1 3 agruparamse agruparam se distintos joining esperados GKR→GRR, GKRGRR GKR→GRR GKR GRR (GKR→GRR) caracteriza prépróGnRH1, prépróGnRH1 pré-pró-GnRH1 relacionados 4 ( (GKR→GRR
Abstract The technological development of tools that enable the spawning of different native species is paramount to enable ex situ conservation initiatives, as well as providing means for commercial hatchery of threatened fish which, in turn, relieve fisheries pressure over wild stocks. Neotropical migratory freshwater fish depend on hormonal induction for spawning in hatcheries, through expensive methods of limited efficiency. Salminus brasiliensis is one of the largest Neotropical freshwater fish, a piscivorous top-predator, prized in angling, highly valued in the market, and appreciated in gastronomy. Teleost fish have either, two or three GnRH paralogous genes: GnRH1, GnRH2 and the GnRH3. The expression products of these paralogous isoforms consist of a larger prepro-GnRH polypeptide, which undergoes post-translational proteolytic processing to yield the active decapeptide hormone. There is increasing interest in characterizing and understanding these neuropeptides, because of its practical application in hatchery spawning. We present the characterization of GnRH1’s coding sequence for the prepro-GnRH1 polypeptide of S. brasiliensis. An annotation from a genomic assembly was used for searching for GnRH paralogues, based on data from anonymous predicted transcripts. The sequence retrieved for GnRH1 was then used as a query for searching the uncharacterized GnRH paralogues from full genomes of Characiformes deposited at NCBI. The S. brasiliensis GnRH1 gene sequence retrieved was targeted for PCR and submitted to Sanger sequencing, allowing for its confirmation. It spans 423 bp (exon 1: 128 bp; intron: 161 bp; and exon 2: 1134 bp), with open reading frames coding for 264 and 88 amino acids, respectively. The different variants retrieved for the prepro-GnRH (1, 2 and 3) from Characiformes genomes and deposited sequences from NCBI grouped in three distinct clades in a neighbor joining tree, each forming a monophyletic branch and with the S. brasiliensis sequences nested within the expected groups. Here we observed a variation at a proteolytic site (GKR→GRR), reported as highly conserved in vertebrates up to now, that can potentially alter the cleavage site and modify the peptide topology. This work has characterized, for the first time, the sequence of the GnRH1 coding for its prepro-GnRH peptide, for a member of the Charaficormes order. This will help to promote research and development of tools for broodstock spawning and environmental management of S. brasiliensis and related migratory fish. initiatives turn stocks hatcheries efficiency toppredator, toppredator top predator, predator top-predator angling market gastronomy either genes GnRH3 preproGnRH prepro posttranslational post translational hormone neuropeptides GnRH1s GnRHs s preproGnRH1 S transcripts sequencing confirmation 42 1 12 intron 16 113 bp, , bp) 26 8 acids respectively 1, (1 3 tree groups GKR→GRR, GKRGRR GKR→GRR GKR GRR (GKR→GRR) now topology characterized time order 4 11 ( (GKR→GRR