Antecedentes: Los accidentes ofídicos representan un grave problema de salud pública en muchas regiones del mundo, particularmente en países tropicales y subtropicales de África, Asia, América latina y Oceanía. Los venenos de serpiente son mezclas complejas de enzymas y proteínas tóxicas, donde las fosfolipasas A2 (PLA2s) son uno de los principales y más abundantes componentes que destruyen el tejido muscular. Objetivo: Aislar y caracterizar una fosfolipasa A2 del veneno de Bothrops asper de Colombia, con el fin de obtener información acerca de la composición del veneno de esta especie. Materiales y Métodos: Se empleó cromatografía de intercambio catiónico seguida de HPLC en fase reversa para purificar la proteína. La masa molecular fue determinada por espectrometría de masas. La caracterización bioquímica fue llevada a cabo usando un sustrato sintético (ácido 4-nitro-3-octanoyloxi-benzoico). La actividad miotóxica y edematizante fue ensayada en ratones, al medir la actividad de la creatina kinasa en plasma y el aumento del diámetro de la almohadilla plantar, respectivamente. Además, la actividad citotóxica fue examinada en mioblastos y miotubos murinos C2C12. Resultados: Fue purificada una fosfolipasa A2 básica (BaspCol-PLA2) del veneno de Bothrops asper de Colombia. Su masa molecular fue 13974,6 Da. La enzima hidrolizó un sustrato sintético con un K M de 3,11 mM y un V Max de 4,47 nmol/ min, mostrando actividad máxima a 40 °C y pH 8,0. La PLA2 requirió Ca2+ para su actividad. La adición de Mg2+, Cd2+, Mn2+ y Zn2+ (10mM) en presencia de una baja concentración de Ca2+ (1mM) disminuyó la actividad enzimática. La sustitución de Ca2+ por otros cationes divalentes también redujo la actividad a niveles similares a aquellos presentados en ausencia de Ca2+. Tres péptidos internos (CCFVHDCCYGK, AAAI/LCFRDNI/LNTYNDKK, DAAI/LCFR) identificados por espectrometría de masas mostraron similitud con otras fosfolipasas A2 de B. asper previamente descritas. Cuando BaspCol-PLA2 fue inyectada en ratones indujo una miotoxicidad local considerable y un edema moderado. In vitro, esta enzima provocó efecto citotóxico sobre mioblastos y miotubos. Adicionalmente, esta proteína fue débilmente anticoagulante, mostrando este efecto sobre plasma humano en concentraciones entre 3 y 10 μg/mL. Conclusiones: Una PLA2 fue purificada y llamada BaspCol-PLA2, esta enzima presentó actividad catalítica y una masa molecular de 13974,6 Da. La toxina mostró actividad miotóxica, edematizante, anticoagulante y citotóxica.

Background: Snakebites represent a relevant public health issue in many regions of the world, particularly in tropical and subtropical countries of Africa, Asia, Latin America and Oceania. Snake venoms are complex mixtures of toxic enzymes and proteins, where the most important and abundant muscle-damaging components in snake venoms are phospholipases A2 (PLA2s). Objective: Isolate and characterize a phospholipase A2 from Colombian Bothrops asper venom, in order to obtain information about venom composition of this species. Materials and methods: Cation-exchange chromatography followed by reverse phase HPLC were used to purify the protein. Mass spectrometry was used to determine its molecular mass. Biochemical characterization was performed using a synthetic substrate (4-nitro-3-octanoyloxy-benzoic acid). Myotoxic and edema-inducing activity of toxin were tested in mice, by measuring the plasma creatine kinase activity and footpad diameter, respectively. Moreover, cytotoxic activity was examined to murine skeletal muscle C2C12 myoblasts and myotubes. Results: A PLA2 of Bothrops asper venom from Colombia (BaspCol-PLA2) was purified. Its molecular mass was 13974.6 Da. The enzyme hydrolyzed a synthetic substrate with a K M of 3.11 mM and a V Max of 4.47 nmol/min, showing maximum activity at 40 °C and at pH 8.0. The PLA2 required Ca2+ for activity. The addition of Mg2+, Cd2+, Mn2+ and Zn2+ (10mM) in the presence of low Ca2+ concentration (1mM) decreased the enzyme activity. The substitution of Ca2+ by mentioned divalent cations also reduced the activity to levels similar to those in the absence of Ca2+. Three internal fragments (CCFVHDCCYGK, AAAI/ LCFRDNI/LNTYNDKK, DAAI/LCFR) identified by a mass spectrometry analysis showed similarity with previously reported B. asper PLA2s. In mice, BaspCol-PLA2 induced a conspicuous local myotoxic effect and moderate footpad edema. In vitro, this enzyme induced cytotoxic effect on both myoblasts and myotubes. Additionally, it was classified as weakly anticoagulant PLA2, showing this effect at concentrations between 3 and 10 μg/mL when using human plasma. Conclusions: A PLA2 was purified and named BaspCol-PLA2, this enzyme displayed catalytic activity and molecular mass of 13974.6 Da. The toxin showed myotoxic, edema-forming, anticoagulant and cytotoxic activities.

Activity-guided fractionation of an ethanol-soluble extract of the leaves of Swietenia macrophylla King, Meliaceae, led to several fractions. As a result, sample Sm13-16, 23 had the most promising activity against phospholipases A2 (PLA2), Asp49 and Lys49 types. This fraction inhibited PLA2 activity of the Asp49 PLA2, when aggregated substrate was used. On the other hand, this activity was weakly neutralized when monodispersed substrate was used. In addition, Sm13-16, 23 inhibited, in a dose dependent manner, the cytotoxicity, myotoxicity and edema induced by PLA2s, as well as the anticoagulant activity of Asp49 PLA2. Overall, this fraction exhibited a better inhibition of the toxic activities induced by the Lys49 PLA2than those caused by the Asp49 PLA2. The spectral data of Sm13-16, 23 suggested the presence of aromatic compounds (UV λ max (nm) 655, 266, and 219; IR λ max KBr (cm-1): ~ 3600-3000 (OH), 2923.07 and 1438.90 (C-H), 1656.69 (C = O), 1618.63 and 1607.67 (C-O), 1285.47772.60). We suggest that phenolic compounds could interact and inhibit the toxins by several mechanisms. Further analysis of the compounds present in the active fraction could be a relevant contribution in the treatment of accidents caused by snake envenomation.

Los compuestos fenólicos han mostrado inhibir los efectos tóxicos inducidos por proteínas de veneno de serpiente. En éste trabajo, nosotros demostramos que el ácido gálico, el ácido ferúlico, el ácido cafeico, el propilgalato y el epigalocatequingalato inhiben la actividad enzimática de una fosfolipasa A2 (PLA2) usando yema de huevo como sustrato. Los valores de IC50 están entre 0,38 – 3,93 mM. Los compuestos mencionados también inhiben la actividad enzimática cuando un sustrato sintético es usado. Además, estos compuestos polifenólicos disminuyen el efecto citotóxico inducido por la fosfolipasa A2 miotóxica, el epigalocatequingalato exhibe la mejor capacidad inhibitoria con 90,92 ± 0,82%, mientras que el ácido ferúlico muestra la menor actividad inhibitoria con 30,96 ± 1,42%. Con el fin de determinar los posibles mecanismos de acción de los compuestos fenólicos, realizamos estudios de modelamiento molecular. Todos los polifenoles muestran puentes de hidrogeno con el sitio activo de la enzima; además el epigalocatequingalato presenta una unión más fuerte con la PLA2 que los otros compuestos. Adicionalmente, un análisis preliminar de relación estructura actividad muestra una correlación entre los valores de IC50 y el área superficial polar topológica (p = 0,0491, r = -0,8079 (-0,9878 a -0,2593)), la cual indica el área superficial requerida por cada molécula para unirse a la enzima. Además, nuestros resultados muestran al propilgalato y el epigalocatequingalato como dos nuevos productos naturales con potencial antimiotóxico. La aplicación tópica de estos polifenoles en el sitio de mordedura podría llevar a la prevención de la miotoxicidad; sin embargo, posteriores investigaciones in vivo serían necesarias para confirmar los resultados in vitro.

Polyphenolic compounds have shown to inhibit toxic effects induced by snake venom proteins. In this work, we demonstrate that gallic acid, ferulic acid, caffeic acid, propylgallate and epigallocatechingallate inhibit the enzymatic activity of a phospholipase A2 (PLA2), using egg yolk as substrate. The IC50 values are between 0.38 – 3.93 mM. These polyphenolic compounds also inhibit the PLA2 enzymatic activity when synthetic substrate is used. Furthermore, these compounds decreased the cyotoxic effect induced by a myotoxic PLA2; specifically, epigallocatechin gallate exhibited the best inhibitory capacity with 90.92 ± 0.82%, while ferulic acid showed the lowest inhibitory activity with 30.96 ± 1.42%. Molecular docking studies were performed in order to determine the possible modes of action of phenolic compounds. All polyphenols showed hydrogen bonds with an active site of enzyme; moreover, epigallocatechingallate presented the strongest binding compared with the other compounds. Additionally, a preliminary structure-activity relationship analysis showed a correlation between the IC50 and the topological polar surface area of each compound (p = 0.0491, r = -0.8079 (-0.9878 to -0.2593)), which indicates the surface area required for each molecule to bind with the majority of the enzyme. Furthermore, our results show that propylgallate and epigallocatechingallate are two novel natural products with anti-myotoxic potential. The topical application of these plant polyphenols at the bite site could lead to prevent myotoxicity; however, further in vivo studies would be necessary to confirm the in vitro results.

Veneno de cobra continua a ser um problema importante de saúde em muitos países da América Latina. Apesar dos avanços na terapia antiveneno, os efeitos locais causados por fosfolipases A2 miotóxica (PLA2) presentes no veneno, ainda persistem. Em busca de alternativas para antagonizar a atividade da PLA2 do veneno de Bothrops asper, foram selecionados 36 extratos pertencentes a dezessete famílias de plantas vasculares e briófitas. Uma inibição significativa da atividade enzimática de PLA2 presente no veneno de B. asper foi observada em onze extratos. Além disso, a atividade antioxidante dos extratos foi avaliada. Os resultados evidenciaram uma correlação estatisticamente significativa entre os extratos com ação inibitória contra a PLA2 e aqueles com atividade antioxidante. Também, a quantidade de fenóis foi avaliada e foi encontrada uma relação entre a atividade biológica e a presença dessas substâncias. Nove extratos foram testados contra uma fração do veneno rico em PLA2 básica (Fx-V B. asper), resultando em um efeito inibitório na atividade desta fração da PLA2 na faixa de 30-80%. Esta atividade foi apoiada pela inibição que esses extratos apresentaram na citotoxicidade causada pelo Fx-V B. asper sobre mioblastos C2C12 de músculo esquelético de murino. Os resultados podem indicar a minimização dos esforços na busca de inibidores da PLA2, com foco nas amostras com propriedades antioxidantes conhecidas.

Snakebite continues to be a significant health problem in many countries of Latin America. Even though, there has been an improvement in the antivenom therapy, the local effects caused by myotoxic phospholipases A2 (PLA2) present in the venoms, still persist. In search for alternatives to antagonize the PLA2 activity of Bothrops asper's venom, 36 extracts belonging to seventeen families of vascular plants and bryophytes were screened. A significant inhibition of the enzymatic activity of PLA2 present in B. asper's whole venom was seen in eleven of these extracts. In addition, the antioxidant activity of all the extracts was evaluated. The results evidenced a significant statistical correlation between extracts with an inhibitory effect against PLA2 and those with an antioxidant activity. Moreover, the amount of phenols was quantified finding a relationship between the bioactivity and the presence of these compounds. Nine extracts were screened against a fraction of the venom rich in basic PLA2 (Fx-V B. asper), exhibiting an inhibitory effect on PLA2 activity of this fraction in a range from 30-80%. This activity was supported by the inhibition that these extracts presented on the cytotoxicity caused by Fx-V B. asper on murine skeletal muscle C2C12 myoblasts. The results obtained, could point to minimize efforts in the search of PLA2 inhibitors by focusing in samples with known antioxidant properties.

Los envenenamientos causados por serpientes del género Bothrops constituyen un problema de salud en algunos países tropicales, no solamente por la mortalidad sino por el alto porcentaje de incapacidades físicas que ocasionan. Las fosfolipasas A2 (PLA2) son componentes abundantes en los venenos bothrópicos y crotálicos, y se caracterizan por inducir daños irreversibles en el músculo. Considerando el aporte de las plantas en el tratamiento ofídico, este trabajo se enfocó en la búsqueda de inhibidores de las fosfolipasas, bien sea como alternativa terapéutica o como coadyuvante del tratamiento ofídico. De un tamizaje de 37 especies de plantas vasculares y briofitos contra las PLA2, se seleccionó la especie Murraya paniculata por su promisoria actividad preliminar. Se siguió con el fraccionamiento biodirigido por la evaluación de la actividad inhibitoria de la PLA2 y de la fracción con mayor actividad inhibitoria, por medio de cromatografía de gases acoplada a masas se identificaron metabolitos responsables de la actividad, para proponer un modelo de inhibición enzima-sustrato. Los resultados de este proyecto pretenden contribuir en la búsqueda de moléculas inhibitorias de las PLA2 en plantas vasculares, como la especie M. paniculata, que podrían llegar a ser una herramienta en el desarrollo de nuevos productos para mejorar el pronóstico del accidente ofídico.

Envenomation by snakes of the genus Bothrops are a health problem in some tropical countries, not only because of the mortality but given the high percentage of physical disabilities it causes. Phospholipases A2 (PLA2) are abundant constituents in bothropic and crotalic venoms, characterized by inducing irreversible muscle damage. Due to the contribution of plants in the snakebite treatment, we focus on the search of phospholipases inhibitors, either as an alternative treatment or as a therapeutic adjuvant of the current treatments. From a screening of 37 vascular plants and bryophytes in the search for such inhibitors, the species Murraya paniculata was selected due to its promising preliminary activity. Starting from this point further work consisting of bioassay-guided fractionation followed by the evaluation of the inhibitory activity of PLA2, the metabolites responsible for the activity were detected through a tandem of gas chromatography - mass spectrometry in the most active fraction, to propose substrate-enzyme inhibition model. The aims of this project was the search of promising compounds with an inhibitory activity of the PLA2 in vascular plants such as M. paniculata, that could become tools for developing new products to improve the prognosis of the snakebite.

Este trabajo se realizó con el objetivo de determinar la toxicidad y las características inmunoquímicas del veneno del escorpión Tityus pachyurus y su neutralización por tres antivenenos antiescorpión producidos en Latinoamérica: Alacramyn® del Instituto Bioclón de México; el suero antiescorpiónico del Instituto Butantán de São Paulo, Brasil, y el suero antiescorpiónico del Centro de Biotecnología de la Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela. Este escorpión produjo 0,68±0,20 mg (promedio ± DE) de veneno por estimulación manual, el cual presentó una dosis letal 50% (DL50) en ratones de 4,8 myg/kg (91,3 myg/ratón de 18-20 g). Los signos de envenenamiento predominantes en los ratones fueron: sialorrea, dificultad respiratoria, sudoración generalizada, ataxia, alteraciones del comportamiento (excitabilidad, somnolencia) e hiperglicemia 3 y 24 horas después de la inyección 0,5 DL50 del veneno por vía subcutánea. Para los antivenenos de México y Brasil, la dosis efectiva 50% neutralizante del efecto letal fue de 330 y 292 myg de veneno por ml de antiveneno, respectivamente. El antiveneno de Venezuela no neutralizó este efecto. Por electroforesis (SDS-PAGE) se demostró que el veneno contiene proteínas desde menos de 14 kd hasta 97 kd. Los Western blot indicaron reactividad inmunológica de los tres antivenenos con los diversos componentes del veneno, incluso las proteínas de baja masa molecular (<14 kd). Los resultados permiten concluir que el veneno de T. pachyurus es neutralizado eficientemente por los antivenenos contra picaduras de escorpiones producidos en México y Brasil.

The toxicity and immunochemical properties of Tityus pachyurus Pocock scorpion venom was characterized, as well as the neutralization capacity against it by three anti-scorpion antivenoms (Alacramyn®, Instituto Bioclón, México; Suero antiescorpiónico, Instituto Butantán, Sao Paulo, Brasil; and Suero antiescorpiónico, Centro de Biotecnología, Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela). The venom yield, obtained by manual milking, 680±20 mug venom, a 50% lethal dose in mice was 4.8 mug/kg (90 mug for an 18-20 g mouse). The most common symptoms of venom poisoning in mice were sialorrhea, respiratory distress, profuse sweating, ataxia, behavior alterations (restlessness, somnolence) and hyperglycemia at 3 and 24 hours after subcutaneous venom injection (0.5 LD50). The neutralizing capacity of Bioclón (México City) and Butantán (Sao Paulo) antivenoms (for a 50% effective dose) was 330 and 292 mug venom/ml antivenom, respectively. The Biotecnología (Caracas) antivenom did not neutralize the lethal effect of venom. By electrophoresis (SDS-PAGE) was demonstrated that the venom contains proteins from less than 14 kd to 97 kd. The Western blots indicated immunological reactivity of the three antivenoms with most of venom components, including proteins of low molecular mass (<14 kd). The results allow to conclude that T. pachyurus venom is neutralized efficiently by anti-scorpion antivenoms produced in México and Brasil.

EN COLOMBIA, EL 90-95% DE LAS 3000 MORDEDURAS DE SERPIENTES informadas cada año, son ocasionadas por Bothrops spp, con una elevada mortalidad y secuelas. Siguiendo recomendaciones de la OMS, se evaluó la capacidad neutralizante de los efectos farmacológicos y enzimáticos de los venenos de Bothrops asper y Porthidium nasutum de Antioquia y Chocó por cuatro antivenenos; 2 de ellos de IgG completa (polivalente antibothrópico, anticrotálico del Instituto Nacional de Salud INS -Colombia; polivalente antibothrópico, anticrotálico, antilachésico de Laboratorios Probiol -Colombia) y 2 antivenenos de fragmentos F(ab')2 (polivalente antibothrópico, anticrotálico del Centro de Biotecnología de la Universidad Central de Venezuela; y el polivalente antibothrópico, anticrotálico Antivipmyn® del InstitutoBioclón -México). Se determinó la actividad letal, hemorrágica, desfibrinante, edematizante, mionecrosante y hemolítica indirecta de cada veneno, siguiendo métodos ya estandarizados. Las pruebas de neutralización in vitro e in vivo se realizaron por el método de preincubación a 370C de dosis fijas de veneno y dosis variables de antiveneno. Los antivenenos Antivipmyn® de México y polivalente INS de Colombia tuvieron la mayor potencia neutralizante de todos los efectos farmacológicos y enzimáticos del veneno de B. asper y P. nasutum. El antiveneno polivalente Probiol fue el de menor capacidad neutralizante y mayor concentración de proteínas. Los antivenenos de fragmentos F(ab')2 tuvieron más baja concentración de proteínas y solo cantidades menores de proteínas no inmunes por electroforesis.

NINETY TO 95% OF THE SNAKEBITESreported yearly in Colombia are inflicted by Bothrops spp with high mortality and sequelae. Following recommendations of the World Health Organization, the neutralizing ability of four polyvalent antivenoms against several pharmacological and enzymatic effects of Bothrops asper and Porthidium nasutum snake venoms from Antioquia and Chocó, was evaluated. Two of them were of whole IgG (polivalente antibothrópico, anticrotálico, Instituto Nacional de Salud- INS - Colombia; polivalente antibothrópico, anticrotálico, antilachésico, Laboratorios Probiol -Colombia) and two were of F(ab')2 fragments (polivalente antibothrópico, anticrotálico, Centro de Biotecnología, Universidad Central de Venezuela; polivalente antibothrópico, anticrotálico Antivipmyn®, Instituto Bioclon -México). The lethal, hemorrhagic, edema-forming, myonecrotic, defibrinating and indirect hemolytic effects of the venoms were determined. Then, the experiments of neutralization were performed by preincubating different venom/antivenom ratios at 37 °C during 30 minutes. The polyvalent antivenoms Antivipmyn® from México and INS from Colombia, showed the highest neutralizing ability against all toxic effects of the venoms in this study. Polyvalent antivenom from Probiol had the lowest neutralizing ability and the highest protein concentration. The antivenoms composed of F(ab')2 fragments had the lowest protein concentration and minor quantities of nonimmunoglobulin proteins by SDS-PAGE