Abstract Obtaining transgenic sugarcane lines in vitro is a laborious, expensive, and time-consuming process. To minimize these disadvantages, the presence of transgenes must be checked as soon as possible. Here, we describe a method for direct PCR amplification of DNA from sugarcane plantlets, using smaller quantities of vegetal material, low-cost lab reagents, and rapid processing. By using this methodology, we were able to identify 100% of the transgenic lines generated. The outlined protocol enabled us to perform an earlier checking of the transgene insertions on genomes of transformed lines reducing costs and labor at in vitro stages. laborious expensive timeconsuming time consuming process disadvantages possible Here plantlets material lowcost low cost reagents processing methodology 100 generated stages 10 1

Sugarcane borer Diatraea saccharalis (Fabricius) (Lepidoptera: Crambidae) is the most important sugarcane pest in Tucumán, Argentina. Older larvae bore into the stalks, facilitating microorganism colonization which indirectly reduces yield and quality of sugar. The aim of the present work was to optimize a sugarcane plant phenotyping method with D. saccharalis under controlled conditions to evaluate different strategies to manage the pest. Different numbers of neonate larvae were placed in the leaf whorl of sugarcane seedling (2-months-old) of cultivars TUC 95-10, TUC 03-12 and LCP 85-384. On the other hand, on single plants 6-month old of TUC 95-10, 10 larvae of several instars were added and the number of perforations and damaged sheath, the tunnel total length and the dead heart symptom were evaluated. In in vitro tests, immature leaf roll disks cut from seedlings were inoculated with two neonate larvae and the larval survival percentage was determined. Each assay was repeated twice or three times with 5 -10 replicates per treatment and conducted under controlled conditions (28-30ºC; 50-70% RH). In seedlings the symptom of the dead heart was observed in all the treatments with different larval number. In the case of the 6-month-old plants, damage in the sheath and stem were observed when infested with L2, L3 and L4 instars, whereas neonate larvae only produced sheath damage. In the laboratory tests, the survival percentage of larvae obtained was high. The results suggest that several methodologies were optimized to evaluate different types of plant material, which are available to study potential strategies for sugarcane borer management.

El barrenador de caña de azúcar Diatraea saccharalis (Fabricius) (Lepidoptera: Crambidae) es la plaga más importante del cultivo en Tucumán, Argentina. Los estadios larvales más avanzados perforan los tallos facilitando la colonización de microorganismos que reducen indirectamente el rendimiento y la calidad del azúcar. El objetivo del presente trabajo fue optimizar sistemas de fenotipado de D. saccharalis en caña de azúcar, en condiciones controladas, con el fin de evaluar diferentes estrategias de manejo de la plaga. En primer lugar, diferentes números de larvas neonatas fueron colocadas en el cogollo de plantines de caña de azúcar de dos meses de edad de las variedades TUC 95-10, TUC 03-12 y LCP 85-384. Por otro lado, en plantas individuales de seis meses de edad de TUC 95-10 se inocularon 10 larvas de diferentes estadios y se determinó el número de perforaciones y de vainas dañadas, la longitud total del túnel y el síntoma del corazón muerto. En ensayos in vitro se inocularon dos larvas neonatas en ápices caulinares extraídos de plantines y se determinó el porcentaje de supervivencia de larvas. Todos los ensayos se realizaron en condiciones controladas (28-30ºC; 50-70% de HR), con dos o tres repeticiones y con 5 - 10 unidades experimentales por tratamiento. En plantines se observó el síntoma del corazón muerto en todos los tratamientos con diferente número de larvas neonatas. Las plantas de seis meses de edad presentaron daños en vaina y tallo cuando se infestaron con los estadios larvales L2, L3 y L4, mientras que las larvas neonatas solo produjeron daño en la vaina. En los ensayos de laboratorio el porcentaje de supervivencia de larvas obtenido fue elevado. Los resultados sugieren que diferentes sistemas de fenotipado empleando material vegetal de distinta edad fueron optimizados y están disponibles para evaluar potenciales estrategias de manejo del barrenador.

A previous development of transgenic glyphosate-resistant sugarcane suitable for commercial release was carried out through genetic transformation of cultivar RA 87-3. During the time elapsed to develop this technology, new commercial cultivars produced by the local breeding program have been adopted by farmers. The complex genetics of modern sugarcane cultivars, which are interspecific hybrids, highly polyploid and frequently aneuploid, make the introgression by backcrossing of the transgene into other varieties extremely difficult. Direct transformation of new commercial cultivars or promising clones at final stages of a breeding scheme could greatly improve the development and adoption of transgenic sugarcane by both farmers and millers. The aim of this study was to obtain glyphosate-resistant transgenic events of the two recently released cultivars, TUC 95- 10 and TUC 03-12, through the introduction via microprojectile bombardment of plasmids harbouring the epsps and nptII genes. A total of 23 and 8 independent bombardments experiments were carried out on TUC 95-10 and TUC 03-12, respectively. The stable transformation and integration of both epsps and nptII genes were determined by using PCR with specific primers. Transgenic events were evaluated for glyphosate tolerance under ex vitro conditions and for genetic similarity with donor plant by using target region amplification polymorphism (TRAP) molecular markers. Although plantlets of both varieties regenerated from calli, TUC 95-10 showed a low tissue culture-response since only two events were obtained, whilst a total of 22 plantlets regenerated for TUC 03-12. One line of TUC 95-10 and three lines of TUC 03-12 were PCR-positive for both genes and different levels of herbicide-tolerance were observed. Genetic analyses of 213 TRAP loci from transgenic lines derived from TUC 03-12 indicate that two events show 99.30% of similarity with the non-transformed TUC 03-12 control and the third had 98.7% similarity. These are encouraging results as, based on our previous experience, the molecular-marker data suggest that the events are practically identical to their parental cultivar, and are suitable for future comparative field testing.

El previo desarrollo de un evento transgénico de caña de azúcar resistente al glifosato aceptada para su liberación comercial fue llevado a cabo a partir de la transformación genética de la variedad RA 87-3. Durante el tiempo transcurrido para desarrollar esta tecnología, nuevas variedades comerciales liberadas por el programa de mejoramiento local están siendo adoptadas por los agricultores. La complejidad genómica de las variedades modernas de caña de azúcar, caracterizadas por ser híbridos interespecíficos, con un alto grado de poliploidía y frecuente aneuploidía, hace prácticamente imposible la introgresión del transgén por retrocruzamientos en otras variedades. La transformación directa de nuevas variedades comerciales o clones promisorios que se encuentren en etapas finales de un esquema de mejoramiento, podrían mejorar enormemente el desarrollo y la adopción de la caña de azúcar transgénica tanto por los agricultores como por los industriales. El objetivo de este estudio fue obtener eventos transgénicos resistentes al glifosato de las variedades TUC 95-10 y TUC 03-12 a partir del bombardeo de microproyectiles recubiertos por plásmidos que contengan los genes epsps y nptII. Se realizaron experimentos independientes con un total de 23 y 8 bombardeos de las variedades TUC 95-10 y TUC 03-12, respectivamente. La transformación e integración estable de los genes epsps y nptII se determinaron mediante el uso de la técnica de PCR con cebadores específicos. Los eventos transgénicos fueron evaluados en condiciones ex vitro para determinar la tolerancia al glifosato, mientras que también se analizó su similitud genética con la variedad que les dio origen mediante marcadores moleculares TRAP. Aunque se obtuvieron plántulas de ambas variedades, la variedad TUC 95-10 mostró una menor respuesta al cultivo de tejido, ya que solo se obtuvieron dos eventos, mientras que para la variedad TUC 03-12 se regeneraron un total de 22 plántulas. Un evento regenerado a partir de TUC 95-10 y tres eventos derivados de TUC 03-12 fueron PCR positivos para ambos genes, observándose diferentes niveles de tolerancia al herbicida. El análisis genético de 213 loci TRAP en las 3 líneas transgénicas derivadas de TUC 03-12 indican que dos eventos comparten un 99,30% de similitud con el control no transformado, mientras que el evento restante presenta un 98,7%. Estos resultados son alentadores, ya que basados en conocimientos previos, los marcadores moleculares indicarían que los eventos obtenidos son prácticamente idénticos a su variedad donante, con lo cual serían adecuados para conducir ensayos comparativos adicionales a campo.