ABSTRACT Tomato fruit blotch virus (ToFBV) is a blunervirus that causes blotches on mature tomato (Solanum lycopersicon L.) fruits in Italy and Australia in 2020, and was newly detected in Brazil. A cytological study on pericarp tissues from the blotched areas of infected fruits collected in Brasília, Brazil, revealed characteristic cell alterations. Small and slender bacilliform particles (ca. 25 nm wide × 100 nm long) were found accumulating in the perinuclear space and the lumen of the endoplasmic reticulum of the epidermis, peri- and mesocarp cells. No viroplasm-like inclusion was observed either in the nuclei or in the cytoplasm. Such cell alterations are reminiscent of those described in cultured mosquito cells infected by negeviruses, an unofficial group of insect viruses. Negeviruses and some other arthropod-borne viruses shared a common ancestor in the RdRp gene with kitavirids, including blunerviruses. Although additional detailed studies are required, we show evidence that ToFBV particles are enveloped and bacilliform, and that such similarity in cytopathology seems to support the evolutionary relationship between plant kitavirids and insect negeviruses.

RESUMO A detecção e identificação molecular de vírus são fundamentais para se definir estratégias de controle de viroses, tendo uma importancia crucial para vírus transmitidos por moscas-brancas. Plantas de algodoeiro (Gossypium) com sintomas de mosaico e redução de produtividade foram observadas em cultivares comerciais (G. hirsutum) e em acessos do banco de germoplasma de algodão da Embrapa mantidos em campo (G. hirsutum, G. barbadense, G. mustelinum). A extração de DNA a partir de plantas com sintomas de mosaico e clorose internerval e amplificação do genoma de begomovírus com primers degenerados e universais mostrou a associação com um begomovírus. Este vírus foi identificado como um isolado de sida micrantha mosaic virus (SiMMV) por sequenciamento do amplicon. O vírus não pode ser transmitido para algodão por mosca-branca (Bemisia tabaci MEAM1) quando plantas de algodão foram usadas como fonte de inóculo, em casa de cultivo protegido, sugerindo uma complexa interação entre vírus, plantas e vetores.

ABSTRACT Detection and molecular identification of viruses are fundamental to define control strategies against viral diseases, particularly for whitefly-transmitted viruses. Cotton (Gossypium) plants showing leaf mosaic symptoms and yield reduction were observed in commercial cultivars (G. hirsutum) and in plants of the cotton germplasm collection of Embrapa maintained in the field (G. hirsutum, G. barbadense, G. mustelinum). DNA was extracted from cotton plants with symptoms of mosaic and interveinal chlorosis, and a begomovirus-specific genome was amplified with degenerated universal primers, which indicated their association with a begomovirus. This virus was identified as an isolate of sida micrantha mosaic virus (SiMMV) after the amplicon sequencing. The virus could not be transmitted by whiteflies (Bemisia tabaci MEAM1) to cotton plants when the latter were used as inoculum source under protected cultivation house, suggesting a complex interaction among viruses, plants and vectors.

Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) causes substantial economic losses in cucurbit crops. Although ZYMV has been present in Brazil for more than 20 years, there is little information about the biological and molecular characteristics of the isolates found in the country. This study aimed to characterize the experimental hosts, pathotypes and genetic diversity of a collection of eleven Brazilian ZYMV isolates within the coat protein gene. For biological analysis, plant species from Amaranthaceae, Chenopodiaceae, Cucurbitaceae, Fabaceae, Solanaceae, and Pedaliaceae were mechanically inoculated and pathotypes were identified based on the reaction of a resistant Cucumis melo, accession PI414723. All of the cucurbit species/varieties and Sesamum indicum were systemically infected with all isolates. The nucleotide sequence variability of the coat protein gene ranged from 82 % to 99 % compared to the corresponding sequences of ZYMV isolates from different geographical locations. No recombination event was detected in the coat protein gene of the isolates.

Um levantamento de begomovírus de quiabeiro foi realizado no Brasil Central. Amostras foliares foram coletadas em campos de produção de quiabo e avaliadas em testes utilizando primers universais para begomovírus. A infecção por begomovírus foi confirmada em apenas uma amostra (#5157) de um total de 196 amostras. O DNA total foi submetido à amplificação por PCR e introduzido em plântulas de quiabeiro pelo método de biobalística, sendo que a amostra de DNA bombardeada foi infecciosa em plantas de quiabeiro. O DNA-A e DNA-B do isolado #5157 foram clonados e a sequência de nucleotídeos mostrou características típicas de begomovírus do Novo Mundo. A sequência do DNA-A apresentou 95,6% de identidade nucleotídica com um isolado de Sida micrantha mosaic virus do Brasil, sendo assim identificado como sua estirpe de quiabeiro. Os clones gerados a partir da amostra #5157 foram infecciosos para quiabeiro, Sida santaremnensis e em um grupo de plantas solanáceas quando inoculados por biobalística após circularização do inserto isolado, seguido por amplificação por círculo rolante.

A survey of okra begomoviruses was carried out in Central Brazil. Foliar samples were collected in okra production fields and tested by using begomovirus universal primers. Begomovirus infection was confirmed in only one (#5157) out of 196 samples. Total DNA was subjected to PCR amplification and introduced into okra seedlings by a biolistic method; the bombarded DNA sample was infectious to okra plants. The DNA-A and DNA-B of isolate #5157 were cloned and their nucleotide sequences exhibited typical characteristics of New World bipartite begomoviruses. The DNA-A sequence shared 95.6% nucleotide identity with an isolate of Sida micrantha mosaic virus from Brazil and thus identified as its okra strain. The clones derived from #5157 were infectious to okra, Sida santaremnensis and to a group of Solanaceae plants when inoculated by biolistics after circularization of the isolated insert, followed by rolling circle amplification.

Os begomovírus (fam. Geminiviridae) possuem um genoma de ssDNA, são transmitidos por mosca-branca, e causam danos importantes em campos de produção de tomate no Brasil. Atualmente, a identificação de espécies de begomovírus é realizada pela análise da seqüência completa do genoma. Devido ao alto custo e dificuldade em se aplicar essa técnica para análises em larga escala, o objetivo desse trabalho foi desenvolver um método de detecção espécie-específico baseado em PCR. Três espécies foram avaliadas para amplificação: Tomato severe rugose virus (ToSRV), Tomato rugose mosaic virus (ToRMV) e Tomato yellow vein streak virus (ToYVSV). Foram testadas treze combinações de primers, e quatro foram selecionadas e avaliadas em um grupo de 82 amostras, incluindo DNA clonado e DNA viral total extraído de plantas infectadas com begomovírus previamente identificados por seqüenciamento direto de produto de PCR. Três combinações de primers capazes de distinguir as três espécies foram selecionadas, e confirmadas por seqüenciamento dos produtos amplificados. Estas combinações foram validadas com amostras de tomate infectadas por begomovírus em campo, demonstrando que a PCR pode ser uma ferramenta útil para separar as espécies virais e detectar infecções mistas causadas pelas três espécies de begomovírus.

The begomoviruses (fam. Geminiviridae) have an ssDNA genome, are transmitted by whiteflies, and cause significant losses in tomato fields in Brazil. Nowadays, begomovirus species identification is carried out through the analysis of their complete genome sequence. Due to the high costs and difficulty in applying this technique to large-scale analysis, we aimed to develop a species-specific detection method based on PCR. Three species were targeted for amplification: Tomato severe rugose virus (ToSRV), Tomato rugose mosaic virus (ToRMV) and Tomato yellow vein streak virus (ToYVSV). Thirteen primer combinations were designed, and four were finally selected and tested against a group of 82 samples, including cloned DNA and viral DNA from infected plants previously identified by direct sequencing of PCR products. Three primer combinations were selected that could distinguish the three species, and confirmed by sequencing of amplified products. These combinations were validated by evaluation of field-collected tomato samples infected by begomovirus and this demonstrated that PCR can be a useful tool to distinguish the viruses and detect mixed infections caused by three begomovirus species.

O aumento na ocorrência de begomoviroses (geminiviroses) em tomateiros, Lycopersicon esculentum Mill., em várias regiões brasileiras, vem causando grandes prejuízos para o agronegócio de tomate, devido à ocorrência do inseto vetor, Bemisia argentifolii (Bemisia tabaci biotipo B). A diagnose é realizada em geral por "polymerase chain reaction" (PCR) ou por hibridização com sondas radioativas. A PCR é um método de alta sensibilidade, porém apresenta a desvantagem da possibilidade de obtenção de resultados falso-positivos, devido a contaminações, ou falso-negativos causados por inibidores contaminantes da reação, ou pela extrema especificidade dos iniciadores. A hibridização de ácidos nucléicos com sondas radioativas tem o seu uso limitado devido à necessidade de infra-estrutura especial, treinamento de pessoal, riscos para a saúde do manipulador e demanda constante de radioquímicos. O presente trabalho tem por finalidade demonstrar a viabilidade do uso do método de hibridização com sondas não-radioativas para a detecção de um begomovírus de tomateiro do Brasil. A sensibilidade do teste foi alta, obtendo-se detecção de até 0,1fg do DNA homólogo e em extrato bruto foliar diluído até 100 vezes.

Major outbreaks of tomato begomoviruses (geminiviruses) in several tomato Lycopersicon esculentum Mill growing in many parts of Brazil have been imposing significant losses upon the tomato agribusiness, due to the introduction of the Bemisia argentifolii (Bemisia tabaci biotype B). Polymerase chain reaction (PCR) and hybridization are generally used for diagnosis. The PCR is a detection method with high sensitivity, however it has the disadvantage of producing false-positives, due to contamination, or false-negatives caused by inhibitors or because of the high primer specifity. The use of nucleic acid hybridization with radio-labelled probes is restricted due to the requirement of special infrastructure and handling experience, the risk for the user’s health and a regular radiochemical element supply. This study is aimed at demonstrating the usefulness of the hybridization method with non-radioactive probes for detection of a tomato begomoviruses in Brazil. The sensitivity of this method was high enabling the detection of 0.1fg of homologous DNA and in crude sap extract diluted up to 100-fold.

A seqüência de nucleotídeos parcial de cinco isolados de Begomovirus foi determinada do DNA-A, correspendente à região intergênica e à porção 5' do gene associado à replicação e da capa protéica. O isolado DFM apresentou identidade de 95% com Tomato mottle leaf curl virus (TMoLCV); os isolados 34, PA-05 e Ta4 foram 88% idênticos ao Tomato yellow vein streak virus (ToYVSV); e o isolado DF-BR3 mostrou 77% de identidade com TMoLCV. Análise de recombinação indicou que o isolado DF-BR3 seria uma quimera e evidencia que um complexo de espécies de begomovírus bipartidos está em formação no Brasil.

Partial nucleotide sequences of five tomato infecting Begomovirus isolates were determined from DNA-A fragments, corresponding to the 5' region of the replication associated protein gene, the intergenic region and the 5' region of the coat protein gene. Isolate DFM shared 95% identity with Tomato mottle leaf curl virus (TMoLCV), isolates 34, PA-05, and Ta4 were 88% identical to Tomato yellow vein streak virus and isolate DF-BR3 shared 77% identity with TMoLCV. Recombination analysis indicated that isolate DF-BR3 was a chimaera, and it provided evidence that there is a complex and actively recombining population of tomato infecting begomoviruses in Brazil.