Resumen OBJETIVO: Analizar los posibles factores asociados con las fallas en la amplificación, los desenlaces de la euploidia y clínicos entre los embriones con repetición de la biopsia y los de una sola (grupo control). MATERIALES Y MÉTODOS: Estudio retrospectivo y multicéntrico de análisis de biopsias de blastocistos practicadas en 22 centros de reproducción asistida (noviembre 2017 a febrero 2022). Se analizaron 4,106 blastocistos procedentes de 1,007 ciclos de ICSI con prueba genética para aneuplidias previa a la implantación. En los blastocistos reportados con falla en la amplificación se analizó el Centro donde se practicó la biopsia, el día en que ésta se tomó, la calidad embrionaria y la incidencia de complicaciones durante el procedimiento. Los resultados se compararon con la prueba genética para aneuploidias previa a la implantación y los desenlaces clínicos entre los embriones con repetición de la biopsia y el grupo control. RESULTADOS: En el 96.0% (3,942) de los embriones se obtuvo resultado y en el 4.0% (n = 164) se reportó falla en la amplificación. La biopsia se repitió en las 99 fallas en la amplificación y se obtuvo resultado en el 83.8% de los casos. Las tasas de euploidia fueron similares entre embriones con repetición de la biopsia y los controles (34.9 en comparación con 39.7%; p > 0.05). El Centro fue el único factor que mostró diferencias en las tasas de falla en la amplificación (p < 0.05). No se observaron diferencias en el día de la biopsia o la calidad embrionaria. Las tasas de embarazo (51.0 en comparación con 58.3%), implantación (63.9 en comparación con 61.5%) y aborto (16.9 en comparación con 28.6%) fueron similares entre embriones con una sola biopsia o repetición de ésta, respectivamente. CONCLUSIONES: El Centro fue el principal factor que influyó en las fallas en la amplificación. Las tasas de euploidia y los desenlaces clínicos no difirieron entre el grupo control y los embriones con repetición de la biopsia; por consiguiente, se recomienda repetir la biopsia en los embriones con falla en la amplificación.

Abstract OBJECTIVE: To analyze possible factors associated with amplification failures, euploidy and clinical outcomes between repeat and single biopsy embryos (control group). MATERIALS AND METHODS: Retrospective multicenter study involving 4,106 blastocysts from 1,007 ICSI cycles with preimplantation genetic testing for aneuploidy performed by next generation sequencing. In case of DNA amplification failure, the IVF center where biopsies were performed, the day of biopsy, the embryo quality and the incidence of complications during biopsy were analyzed. Preimplantation genetic testing for aneuploidy results and clinical outcomes were compared between re-biopsied embryos and the control group. RESULTS: Of the 4,106 blastocysts included in this study, 96.0% (3,942) obtained a result while 4.0% (164) had an amplification failure. Ninety-nine embryos with amplification failure were re-biopsied and 83.8% resulted in an informative diagnosis. Euploidy rates were equivalent between re-biopsied and control blastocysts (34.9% vs 39.7%, P>0.05). The only factor significantly affecting the amplification failure rates was the IVF center. No differences were observed between biopsy days or embryo quality. Pregnancy (51.0% vs 58.3%), implantation (63.9% vs 61.5%) and miscarriage rates (16.9% vs 28.6%) were similar between single and repeat biopsied embryos, respectively. CONCLUSIONS: The centre was the main factor influencing amplification failures. Euploidy rates and clinical outcomes did not differ between the control group and repeat biopsied embryos; therefore, repeat biopsy is recommended for embryos with amplification failure.

Abstract Objective To determine whether a rescue strategy using dydrogesterone (DYD) could improve the outcomes of frozen embryo transfer cycles (FET) with low progesterone (P4) levels on the day of a blastocyst transfer. Methods Retrospective cohort study including FET cycles performed between July 2019 and October 2020 following an artificial endometrial preparation cycle using estradiol valerate and micronized vaginal P4 (400 mg twice daily). Whenever the serum P4 value was below 10 ng/mL on the morning of the planned transfer, DYD 10 mg three times a day was added as supplementation. The primary endpoint was ongoing pregnancy beyond 10 weeks. The sample was subdivided into two groups according to serum P4 on the day of FET: low (< 10 ng/mL, with DYD supplementation) or normal (above 10 ng/mL). We performed linear or logistic generalized estimating equations (GEE), as appropriate. Results We analyzed 304 FET cycles from 241 couples, 11.8% (n = 36) of which had serum P4 below 10 ng/mL on the FET day. Baseline clinical data of patients was comparable between the study groups. Overall, 191 cycles (62.8%) had a biochemical pregnancy, of which 131 (44,1%) were ongoing pregnancies, with a 29,8% miscarriage rate. We found no statistically significant differences in the hCG positive (63 vs 64%) or ongoing pregnancy rates (50 vs 43,3%) between those FETs with low or normal serum P4 values, even after multivariable logistic regression modelling. Conclusion Our results indicate that DYD 10 mg three times a day administered in women who perform FET with P4 serum levels < 10 ng/mL, allows this group to have pregnancy rates beyond 12 weeks at least as good as those with serum levels above 10 ng/mL. (DYD (FET P (P4 201 202 400 (40 daily. daily . daily) 1 ngmL ng mL supplementation ( ng/mL) GEE, GEE , (GEE) appropriate 30 24 couples 118 11 8 11.8 n 36 Overall 19 62.8% 628 62 (62.8% 13 44,1% 441 44 (44,1% pregnancies 298 29 29,8 rate 63 (6 64% 64 50 (5 43,3% 433 43 3 values modelling (P 20 40 (4 (GEE 2 11. 62.8 6 (62.8 44,1 4 (44,1 29, 5 43,3 62. (62. 44, (44, 43, (62 (44

Resumo Objetivo Determinar se uma estratégia de resgate usando didrogesterona (DYD) pode melhorar os resultados dos ciclos de transferência de embriões congelados (TEC) com baixos níveis de progesterona (P4) no dia de uma transferência de blastocisto. Métodos Estudo de coorte retrospectivo que incluiu ciclos TEC realizados entre julho de 2019 e outubro de 2020 após um ciclo de preparação endometrial artificial usando valerato de estradiol e P4 vaginal micronizado (400 mg duas vezes ao dia). Sempre que o valor de P4 sérico estava abaixo de 10 ng/mL na manhã da transferência planejada, adicionou-se 10 mg de DYD tri-diário como suplementação. O desfecho primário foi gravidez evolutiva após 10 semanas. A amostra foi subdividida em dois grupos de acordo com o P4 sérico no dia da TEC: baixo (< 10 ng/mL, com suplementação de DYD) ou normal (acima de 10 ng/mL). Realizamos equações de estimativa generalizada linear ou logística (GEE), conforme apropriado. Resultados Analisaram-se 304 ciclos de FET de 241 casais, dos quais 11,8% (n = 36) tinham valores de P4 sérico abaixo de 10 ng/mL no dia da TEC. Os dados clínicos e demográficos dos pacientes eram comparáveis entre os grupos. Globalmente, 191 ciclos (62,8%) tiveram uma gravidez bioquímica, dos quais 131 (44,1%) foram gestações em curso, com uma taxa de aborto espontâneo de 29,8%. Não encontramos diferenças estatisticamente significativas na taxa de gravidez bioquímica (63 vs. 64%) ou nas taxas de gravidez evolutiva (50 vs. 43,3%) entre TEC com valores séricos de P4 baixos ou normais, mesmo após modelação com regressão logística multivariável. Conclusão Nossos resultados indicam que a suplementação com DYD 10 mg três vezes ao dia em mulheres com níveis séricos de P4 abaixo de 10 ng/mL em ciclos de TEC substituídos parecem conseguir resultados pelo menos tão bons como nos ciclos com valores superiores para taxas de gravidez em curso além de 12 semanas. (DYD (TEC P (P4 blastocisto 201 202 400 (40 dia. . dia) 1 ngmL ng mL planejada adicionouse adicionou tridiário tri diário semanas < ( acima ng/mL. ng/mL) GEE, GEE , (GEE) apropriado Analisaramse Analisaram 30 24 casais 118 11 8 11,8 n 36 Globalmente 19 62,8% 628 62 (62,8% 13 44,1% 441 44 (44,1% 298 29 29,8% 63 (6 vs 64% 64 50 (5 43,3% 433 43 3 normais multivariável (P 20 40 (4 (GEE 2 11, 62,8 6 (62,8 44,1 4 (44,1 29,8 5 43,3 62, (62, 44, (44, 29, 43, (62 (44

Resumen La alpaca es el camélido sudamericano doméstico de mayor importancia para el Perú, país que a nivel regional cuenta con el 87% de estos animales. Ya que las formas tradicionales de reproducción no garantizan su calidad genética, la reproducción in vitro es una alternativa para su mejoramiento. Este estudio evaluó la influencia de los factores embriotróficos de desarrollo epidérmico (EGF) y de crecimiento insulínico (IGF-1) y tensiones de oxígeno en el desarrollo in vitro de ovocitos de alpaca hasta la etapa de blastocistos. A partir de ovarios de animales sacrificados, se obtuvieron ovocitos que se colocaron en medio TCM-199, suplementado con piruvato de sodio, glutamina, estradiol (E2), hormona folículo estimulante (FSH), hormona luteinizante (LH), factor embriotrófico (EGF o IGF-1), 5% de suero fetal bovino y gentamicina (10.L/mL) durante 32 horas, a 38,5 .C, con 5% de CO. y humedad relativa mayor de 95%, con tensiones O. entre 6 y 20%. Posteriormente, los ovocitos fueron fecundados con semen fresco y cultivados en medio KSOMaa durante 48 horas. Los cultivos fueron diferenciados por factores de crecimiento (EGF e IGF-1) y tensiones de O. (6% y 20%), más el grupo control sin suplementar con EGF o IGF-I, para valorar las tasas de división de ovocitos y blastocistos a partir de ovocitos. Mediante análisis de conglomerados, se establecieron diferencias significativas entre los tratamientos con α= 0,05 para cada variable de respuesta, observándose la mayor tasa de divisiones de ovocitos (24,8%) con EGF a 6% de O.y la mayor producción de blastocistos/ovocito (18,4%) con IGF-1 a 6% de O. . Se concluye que la adición de factores embriotróficos y una baja tensión de O. son favorables para el desarrollo embrionario in vitro en alpacas.

Abstract The alpaca is the most important South American domestic camelid for Peru, a country that regionally has 87% of these animals. Since traditional forms of reproduction do not guarantee its genetic quality, in vitro reproduction is an alternative for its improvement. This study evaluated the influence of embryotrophic factors of epidermal development (EGF) and insulin-like growth factor (IGF-1) and oxygen tension on the in vitro development of alpaca oocytes up to the blastocyst stage. From ovaries of sacrificed animals, oocytes were obtained and placed in TCM-199 medium, supplemented with sodium pyruvate, glutamine, estradiol (E2), follicle stimulating hormone (FSH), luteinizing hormone (LH), embryotrophic factor (EGF or IGF-1), 5% fetal bovine serum and gentamicin (10.L/mL) for 32 hours, at 38.5 .C, with 5% CO. and relative humidity greater than 95%, with O. tensions between 6 and 20%. Subsequently, the oocytes were fertilized with fresh semen and cultured in KSOMaa medium for 48 hours. Cultures were differentiated by growth factors (EGF and IGF-1) and O. tensions (6% and 20%), plus the control group without EGF or IGF-I supplementation, to assess oocyte and blastocyst division rates from oocytes. By cluster analysis, significant differences were established between treatments with α= 0.05 for each response variable, with the highest rate of oocyte divisions (24.8%) with EGF at 6% O. and the highest blastocyst/oocyte production (18.4%) with IGF-1 at 6% O.. It is concluded that the addition of embryotrophic factors and low O. tension are favorable for in vitro embryo development in alpacas.

Resumo Niedenzuella (Tetrapterys) multiglandulosa, uma videira encontrada no Brasil, tem sido correlacionada a surtos de intoxicações em bovinos e búfalos, gerando perdas econômicas relacionadas à morte por insuficiência cardíaca, aborto, natimorto e mortalidade neonatal. O objetivo deste estudo foi examinar o potencial embriotóxico do extrato vegetal aquoso em embriões bovinos in vitro. O estudo in vitro foi realizado em cinco repetições de cultura de embriões bovinos distribuídos em dois grupos: controle, meio de cultura de embriões in vitro sem o extrato aquoso da planta; grupo tratado, com adição de 2,7mg / mL de extrato vegetal aquoso (10%) à cultura do embrião no sexto dia de cultivo. A taxa de clivagem foi avaliada no dia 2 da cultura de células. Viabilidade, eclodibilidade e subdesenvolvimento de blastocistos no sétimo, oitavo e nono dia (D7, D8 e D9, respectivamente) de cultura foram avaliados em microscópio estereoscópico. No dia 7, os blastocistos foram submetidos ao ensaio TUNEL para determinar o índice apoptótico. Observamos redução significativa da produção de blastocisto / número de embriões clivados (60,6% vs 41,5%); redução da produção de blastocistos / número total de oócitos bovinos maturados (35,1% vs 21,3%); e taxas de eclosão embrionária (38,0% vs 10,0%). No entanto, nenhum efeito foi observado na taxa de apoptose. Em conclusão, o extrato aquoso das folhas de N. multiglandulosa reduz a viabilidade do embrião bovino in vitro, sugerindo possíveis efeitos prejudiciais no desenvolvimento embrionário.

Abstract Niedenzuella (Tetrapterys) multiglandulosa, a vine plant found in Brazil, has been correlated to outbreaks of poisoning in cattle and buffaloes, generating economic losses related to the death due to heart failure, miscarriage, abortion, stillbirth, and neonatal mortality. The aim of this study was to examine the embryotoxic potential of the aqueous plant extract on in vitro bovine embryos. In vitro study was performed in five replicates of bovine embryo culture assigned in two groups: control, in vitro embryo culture medium without the aqueous plant extract; treated group, with addition of 2.7mg/mL of aqueous plant extract (10%) to the embryo culture on the sixth day of culture. Cleavage rate was evaluated at day 2 of the cell culture. Viability, hatchability and underdevelopment of blastocysts on the seventh, eighth, and ninth days (D7, D8, and D9, respectively) of culture were assessed under stereoscopic microscope. On day 7, blastocysts were submitted to TUNEL assay to determine apoptotic index. In vitro exposure of bovine embryos to of N. multiglandulosa resulted in reduced embryo development and survival, evaluated by dark cytoplasm indicating poor morphology and poor quality with marked reduction of hatchability. We observed a significant reduction of blastocyst production/number of cleaved embryos (60.6% vs 41.5%); reduction of blastocysts production/total number of matured bovine oocytes (35.1% vs 21.3%); and embryonic hatching rates (38.0% vs 10.0%). However, no effects were observed on the apoptotic rate. In conclusion, aqueous extract of N. multiglandulosa leaves reduces bovine embryo viability in vitro, suggesting possible detrimental effects on embryo development.

Resumen OBJETIVO: Evaluar la relación entre la ubicación de la burbuja de aire que contiene los embriones y las tasas de implantación y de gestación clínica. El secundario: estudiar la relación entre la posición de la punta de la cánula, el grosor endometrial y el desplazamiento de la burbuja con esos desenlaces reproductivos. MATERIALES Y MÉTODOS: Estudio retrospectivo, observacional y de análisis de imágenes ecográficas de transferencias de embrión único en estadio de blastocisto practicadas por un mismo especialista en la Fundación IVI, Valencia, España, entre septiembre de 2013 y febrero de 2021. Criterios de selección: grosor endometrial ≥ 6 mm en el último control ecográfico, ausencia de miomas, IMC menor de 30 kg/m2, transferencias atraumáticas efectuadas por el mismo especialista. En función de la ubicación de la burbuja de aire se establecieron tres grupos de estudio (alta: mayor de 0.98 cm, media: 0.98 a 1.44 cm y baja: mayor de 1.44 cm) y para evaluar la asociación entre las categorías se aplicó el cálculo de razón de momios (OR) e IC95%. RESULTADOS: Se estudiaron 342 transferencias de embrión único. La edad media de las pacientes fue 39.70 ± 4.5 años. La relación entre la distancia de la burbuja de aire al fondo uterino y la tasa de implantación fue de 61 ± 9% en el grupo de ubicación alta, 64 ± 9% en el grupo de ubicación media, y de 56 ± 1% en el grupo de ubicación baja (p = 0.437). No se observaron diferencias en la tasa de gestación evolutiva analizada mediante probabilidad de ocurrencia entre grupos, con frecuencias de 0.60 en comparación con 0.64 (OR: 1.42; IC95%: 0.83 a 2.44; p: 0.199) y en la ubicación alta con media, y frecuencias de 0.60 en comparación con 0.56 (OR: 1.22; IC95%: 0.72-2.08; p: 0.462) entre alta y baja. CONCLUSIONES: No se encontró asociación entre la ubicación de la burbuja y las tasas de implantación y de gestación evolutiva. El mayor desplazamiento de la burbuja se asoció con mayores tasas de gestación evolutiva.

Abstract OBJECTIVE: To evaluate the relationship between the location of the air bubble containing the embryos and the implantation and clinical gestation rates. Secondary: to study the relationship between the position of the cannula tip, the endometrial thickness and the displacement of the bubble with these reproductive outcomes. MATERIALS AND METHODS: Retrospective, observational, ultrasound image analysis study of single embryo transfers at blastocyst stage performed by the same specialist at the IVI Foundation, Valencia, Spain, between September 2013 and February 2021. Selection criteria: endometrial thickness ≥ 6 mm at the last ultrasound control, absence of fibroids, BMI less than 30 kg/m2, atraumatic transfers, performed by the same specialist. Based on the location of the air bubble, three study groups were established (high: greater than 0.98 cm, medium: 0.98 to 1.44 cm and low: greater than 1.44 cm) and the odds ratio (OR) and 95%CI were used to evaluate the association between the categories. RESULTS: A total of 342 single embryo transfers were studied. The mean age of the patients was 39.70 ± 4.5 years. The relationship between the distance of the air bubble to the uterine fundus and the implantation rate was 61 ± 9% in the high placement group, 64 ± 9% in the medium placement group, and 56 ± 1% in the low placement group (p = 0.437). No differences were observed in the evolutionary gestation rate analyzed by probability of occurrence between groups, with frequencies of 0.60 compared to 0.64 (OR: 1.42; 95%CI: 0.83 to 2.44; p: 0.199) and high to medium location, and frequencies of 0.60 compared to 0.56 (OR: 1.22; 95%CI: 0.72-2.08; p: 0.462) between high and low. CONCLUSIONS: No association was found between the air bubble localization and implantation or ongoing pregnancy rates. However, a greater displacement of the bubble was associated with higher ongoing pregnancy rates.

Resumo Abordagens para o teste genético pré-implantacional não-invasivo para aneuploidias (non-invasive preimplantation genetic testing for aneuploidies, niPGT-A, em inglês) com o objetivo de avaliar o DNA embrionário livre são promissoras, especialmente porque estas podem reverter as menores taxas de implantação causadas por inadequada biópsia de trofectoderma (TE). Nesse contexto, nosso centro é parte do maior estudo atual que avalia as taxas de concordância entre PGT-A convencional e niPGT-A, e relatamos aqui o nascimento do primeiro bebê brasileiro após niPGT-A. Os pais do bebê foram admitidos no nosso centro em 2018. Eles não apresentavam histórico de infertilidade, e estavam interessados em utilizar os tratamentos de fertilização in vitro (FIV) e PGT-A para evitar anomalias congênitas na progênie.Umtotal de 11 blastocistos expandidos (3 do dia-5 e 8 do dia-6) foram submetidos a biópsia, e os meios de cultivo condicionados (cultivo do dia-4 ao dia-6) de 8 blastocistos do dia-6 foram coletados para niPGT-A. No total, resultados informativos para as amostras de TE e dos meios foram obtidos para sete embriões. Entre os embriões com resultado informativo, 5 apresentaram diagnóstico concordante entre PGT-A convencional e niPGT-A, e 2 apresentaram diagnóstico discordante (1 falso positivo e 1 falso negativo). O Blastocisto 4, diagnosticado como 46, XY por ambos niPGT-A e PGT-A convencional, foi desvitrificado e transferido, o que resultou no nascimento de ummenino saudável, que pesava 3,8 kg, em fevereiro de 2020. Com base em nossos resultados e literatura contemporânea, acreditamos que a aplicação atualmais segura do niPGT-A seria como método de seleção embrionária para pacientes sem indicação ao PGT-A convencional. A confiabilidade aproximada de 80% do niPGT-A para determinação da ploidia ainda é superior àquela obtida com abordagens não invasivas, como seleção morfológica ou morfocinética.

Abstract Non-invasive preimplantation genetic testing for aneuploidies (niPGT-A) aiming to assess cell-free embryonic DNA in spent culturemedia is promising, especially because it might overcome the diminished rates of implantation caused by the inadequate performance of trophectoderm (TE) biopsy. Our center is part of the largest study to date assessing the concordance between conventional PGT-A and niPGT-A, and we report here the delivery of the first baby born in Brazil using niPGT-A. The parents of the baby were admitted to our center in 2018. They did not present history of infertility, and they were interested in using in vitro fertilization (IVF) and PGT-A in order to avoid congenital anomalies in the offspring. A total of 11 (3 day-5 and 8 day-6) expanded blastocysts were biopsied, and the spent culture media (culture from day-4 to day-6) from 8 day-6 blastocysts were collected for niPGT-A. Overall, 7 embryos yielded informative results for trophectoderm (TE) and media samples. Among the embryos with informative results, 5 presented concordant diagnosis between conventional PGTA and niPGT-A, and 2 presented discordant diagnosis (1 false-positive and one falsenegative). The Blastocyst 4, diagnosed as 46, XY by both niPGT-A and conventional PGTA, was warmed up and transferred, resulting in the birth of a healthy 3.8 kg boy in February 2020. Based on our results and the recent literature, we believe that the safest current application of niPGT-A would be as a method of embryo selection for patients without an indication for conventional PGT-A. The approximate 80% of reliability of niPGT-A in the diagnosis of ploidy is superior to predictions provided by other noninvasive approaches like morphology and morphokinetics selection.

ABSTRAC The objective of this study was to evaluate the in vitro embryo production rate up to the blastocyst stage with two fertilization media: FERT-TALP and modified TCM-199, grown in BOEC medium, from oocytes collected by aspiration of follicular ovaries of creole cows obtained from the slaughterhouse. In total, 281 oocytes were collected, 179 for FERT-TALP medium and 144 for modified TCM-199. The oocytes were subjected to the process of maturation, fertilization and embryo culture in vitro. An oocyte cleavage rate of 25.8% was obtained in FERT-TALP and 2.4% in modified TCM-199 at 18 hours post-fertilization. Likewise, at 48h, 87.7% of total cleavage was obtained in FER-TALP and 40.5% in modified TCM-199, whose percentage of embryos with 4 to 8 cells was 64.5 and 26.2%, respectively. In the morula and blastocyst phase, a rate of 10.3 and 3.9% was achieved in FERT-TALP, respectively, while none wwere achieved with the modified TCM-199 medium.

RESUMEN El objetivo del presente estudio fue evaluar la tasa de producción de embriones in vitro hasta el estadio de blastocisto con dos medios de fertilización: FERT-TALP y TCM-199 modificado, cultivado en el medio BOEC, a partir de ovocitos recolectados por aspiración folicular de ovarios de vacas criollas obtenidos del matadero. Se recolectaron 281 ovocitos, 179 para el medio FERT-TALP y 144 para TCM-199 modificado. Los ovocitos fueron sometidos al proceso de maduración, fecundación y cultivo embrionario in vitro. Se obtuvo una tasa de clivaje de ovocitos de 25.8% en FERT-TALP y 2.4% en TCM-199 modificado a las 18 horas pos-fertilización. Asimismo, a las 48h se obtuvo 87.7% de clivaje total en FER-TALP y 40.5% en TCM-199 modificado, cuyo porcentaje de embriones con 4 a 8 células fue de 64.5 y 26.2% respectivamente. En la fase de mórula y blastocisto se alcanzó una tasa de 10.3 y 3.9% en FERT-TALP, respectivamente, mientras que ninguno se logró con el medio TCM-199 modificado.

RESUMO Este estudo teve como objetivo avaliar a morfometria ultraestrutural de embriões bovinos produzidos in vitro e cultivados em diferentes concentrações de antioxidantes. Após a maturação e a fertilização in vitro, os possíveis zigotos foram divididos em cinco tratamentos: T1) sem adição de antioxidantes (controle negativo); T2) adição de 50μM/mL de cisteamina; e T3, T4 e T5) adição de 2,5μg/mL, 5,0μg/mL ou 10,0μg/mL dos antioxidantes derivados do extrato oleoso de Lippia origanoides, respectivamente. No D7 de cultivo, os embriões em estágio de blastocisto foram fixados e preparados para microscopia eletrônica de transmissão. Estes foram avaliados para a proporção entre citoplasma e núcleo, citoplasma e mitocôndria, citoplasma e vacúolos, citoplasma e vacúolos autofágicos e citoplasma e gotículas lipídicas. Blastocistos cultivados em meio contendo extrato oleoso de Lippia origanoides apresentaram características morfológicas como alta relação célula:mitocôndria e baixa relação célula:vacúolos e célula:vacúolo autofágico, possíveis indicadores morfológicos de qualidade embrionária. A massa celular interna (MCI) de blastocistos cultivados em meio sem quaisquer antioxidantes teve a maior razão célula:vacúolo. Resultados semelhantes foram encontrados nas células do trofectoderma (TE) de blastocistos do tratamento 2. Portanto, o meio de cultivo embrionário suplementado com antioxidantes derivados do óleo de Lippia origanoides produziu embriões com maior proporção citoplasmática de organelas, como mitocôndrias. Além disso, tratamentos sem antioxidantes ou com adição de cisteamina apresentaram vacuolização citoplasmática, característica relacionada à produção de embriões de baixa qualidade.

ABSTRACT This study aimed to evaluate the ultrastructural morphometry of bovine embryos produced in vitro grown at different concentrations of antioxidants. After in vitro maturation and fertilization, the presumptive zygotes were assigned into five treatments. T1) without the addition of any antioxidants (negative control); T2) addition of 50μM/mL cysteamine; and T3, T4 and T5) adding 2.5μg/mL, 5.0μg/mL or 10.0μg/mL of the antioxidants derived from the oily extract from Lippia origanoides, respectively. On D7 of culture, the embryos in the blastocyst stage were fixed and prepared for electron transmission microscopy. These were evaluated for the proportion of cytoplasm-to-nucleus, cytoplasm-to-mitochondria, cytoplasm-to-vacuoles, cytoplasm-to-autophagic vacuoles and cytoplasm-to-lipid droplets. Blastocysts cultured in media containing oily extract of Lippia origanoides presented morphological characteristics such as high cell:mitochondria ratio and low cell:vacuoles and cell:autophagic vacuole ratio, possibly been morphological indicators of embryonic quality. Inner cell mass (ICM) from blastocysts cultured in media without any antioxidants had the highest cell:vacuole ratio. Similar results were found in the trophectoderm (TE) cells of blastocysts from treatment 2. Embryo culture media supplemented with antioxidants derived from Lippia origanoides oil produced embryos with a higher cytoplasmic proportion of organelles, such as mitochondria. Also, treatments without any antioxidants or with the addition of cysteamine presented cytoplasmic vacuolization, a characteristic related to production of poor-quality embryos.

RESUMO As vantagens dos animais transgênicos têm sido demonstradas em diferentes aplicações, entretanto muitas metodologias usadas para gerar animais geneticamente modificados (GM) apresentam baixas taxas de eficiência. O objetivo deste estudo foi avaliar a entrega dos vetores lentivirais (VLs) em zigotos durante a fertilização in vitro (FIV), para gerar embriões GM, com o gene da proteína verde fluorescente (GFP) ou do fator IX de coagulação humana (FIX). Vetores lentivirais com os genes GFP (pLGW-GFP-LV) ou FIX (pLWE2-FIX-LV) foram utilizados na FIV ou na cultura de embriões in vitro (CIV). A coincubação de pLWE2-FIX-LV com espermatozoides e complexos oócitos-células do cumulus (COCs) durante a FIV diminuiu (P<0,05) as taxas de clivagem e de blastocistos, enquanto com pLGW-GFP-LV diminuiu (P<0,05) a taxa de blastocisto quando se comparou ao controle sem VL. A coincubação de pLWE2-FIX-LV e pLGW-GFP-LV com presumíveis zigotos durante a CIV não afetou (P>0,05) o desenvolvimento embrionário. A expressão da proteína GFP não foi detectada em embriões após a coincubação de FIV ou CIV, embora as células do cumulus expressassem a proteína até o dia oito de cultivo in vitro. Reações em cadeia da polimerase (PCR) não detectaram os genes GFP ou FIX em embriões, mas ambos foram detectados em células do cumulus. Assim, a coincubação de VL com espermatozoide bovino e COCs não é eficaz para produzir embriões geneticamente modificados por meio de FIV.

Resumo Objetivo Avaliar se existe alguma relação entre os valores plasmáticos de progesterona no dia da transferência de um blastocisto desvitrificado em ciclos hormonalmente substituídos e a taxa de gravidez, aborto ou nascido vivo. Métodos Estudo observacional, ambispectivo, incluindo todos os ciclos de transferência de blastocistos congelados no nosso departamento, entre maio de 2018 e junho de 2019. Avaliou-se a taxa de gravidez e de nascidos vivos após 24 semanas de gestação. Os grupos foram comparados de acordo com os valores de progesterona plasmáticos dosados no dia da transferência do blastocisto: comparou-se o 1° quartil com os outros e depois os 2° e 3° quartis com o 4°. Resultados Avaliaram-se 140 transferências: 87 com β gonadotrofina coriônica humana (β-HCG)>10 IU/L (62%), 50 das quais terminaram em nascido vivo (36% do total), enquanto 37 tiveram um aborto (42% das gravidezes). Verificou-se uma tendência para menor número de recém-nascidos nas transferências com níveis de progesterona no 1° quartil (<10.7ng/mL) (26 versus 39%; p>0.05) e ummaior número de abortos (64 versus 33%; p<0.01). Comparando o 2° e 3° quartis com o 4°, verificouse que nos casos em que a progesterona estava acima do percentil 75, apesar de uma taxa de gravidez semelhante (60 versus 57%; p>0.05), houve uma tendência para uma maior taxa de nascidos vivos (43 versus 31%; p>0.05) emenor número de abortos (28 versus 45%; p>0.05) abaixo do percentil 75. Estas diferenças não foram estatisticamente significativas. Conclusão Não se verificaram diferenças estatisticamente significativas para taxa de gravidez e de nascido vivo. A taxa de aborto foi maior no primeiro quartil.

Abstract Objective To establish a relationship between serum progesterone values on the day of frozen blastocyst transfer in hormone-replaced cycles with the probability of pregnancy, miscarriage or delivery. Methods This was an ambispective observational study including all frozen-thawed embryo transfer cycles performed at our department following in vitro fecundation from May 2018 to June 2019. The outcomes evaluated were β human chorionic gonadotropin (β-hCG)-positive pregnancy and delivery. Groups were compared according to the level of serum progesterone on the day of embryo transfer: the 1st quartile of progesterone was compared against the other quartiles and then the 2nd and 3rd quartiles against the 4th quartile. Results A total of 140 transfers were included in the analysis: 87 with β-HCG>10 IU/L (62%), of which 50 (36%) delivered and 37 had a miscarriage (42%).Women with lower progesterone levels (< 10.7ng/mL) had a trend toward higher β-HCG-positive (72 versus 59%; p>0.05), lower delivery (26 versus 39%; p>0.05) and higher miscarriage rates (64 versus 33%; p<0.01). Comparing the middle quartiles (P25-50) with those above percentiles 75, the rate of pregnancy was similar (60 versus 57%; p>0.05), although there was a trend toward a higher number of deliveries (43 versus 31%; p>0.05) and a lower number of miscarriages (28 versus 45%; p>0.05). These differences were not statistically significant. Conclusion There were no differences in pregnancy and delivery rates related with the progesterone level when measured in the transfer day. The miscarriage rate was higher in the 1st quartile group.

RESUMO Dez éguas, sem raça definida, foram submetidas a avaliações ultrassonográficas durante o intervalo interovulatório, avaliando-se folículos ≥ 5mm. Cinco éguas foram tratadas com 500mg de r-bST no primeiro e no 14º dia pós-ovulação (grupo GT), e as demais com soro fisiológico (grupo GC). Quando o folículo dominante atingiu diâmetro ≥ 40mm, foram induzidas com hCG e inseminadas 24 horas após, sendo submetidas à coleta de embrião seis dias após a ovulação. Os dados foram agrupados de acordo com o diâmetro do folículo dominante nas fases de emergência, divergência, dominância, pré-ovulatória, indução, inseminação e ovulação. Todas as éguas foram usadas duas vezes, no mesmo grupo. O GT apresentou crescimento folicular precoce para as fases de emergência, divergência, dominância e pré-ovulatória, assim como para o seu maior folículo subordinado, que cresceu mais cedo. As taxas de recuperação foram de 90% (GC) e 70% (GT), em 16 estruturas coletadas, obtendo-se uma não fecundada e um blastocisto inicial para o grupo GC; os demais, no estágio de mórula, apresentaram comportamento semelhante entre os grupos. Conclui-se que a r-bST influencia a dinâmica folicular de éguas, levando a uma antecipação do desenvolvimento folicular, que pode ser utilizada para encurtar o ciclo estral.

ABSTRACT Ten undefined mare breeds were submitted to ultrasonographic evaluations during the interovulatory interval, evaluating follicles measuring ≥ 5mm. Five mares were treated with 500mg r-bST on the first and the 14th day after ovulation (TG group), and the others with saline (CG group). When the dominant follicle reached a diameter ≥ 40mm the ovulation was induced with hCG, and the mares were inseminated 24 hours later and submitted to embryo collection six days after ovulation. The data were grouped according to the diameter of the dominant follicle in the emergence, divergence, dominance, preovulatory, induction, insemination and ovulation phases. All mares were used twice, in the same group. The GT showed early follicular growth for the emergence, divergence, dominance and pre-ovulatory phases, as well as for its greater subordinate follicle, growing earlier. The recovery rates were 90% (CG) and 70% (TG), and 16 structures were collected, obtaining an unfertilized embryo and an initial blastocyst for the CG group, the others in the morula stage behaved similarly between the groups. It can be concluded that r-bST influences the follicular dynamics of the mares, leading to an anticipation of the follicular development that can be used to shorten the estrous cycle.

Abstract The objective of this study was to determine the effect of a semi-defined culture media system developed in laboratory, named Pigs Media System (PMS) on the in vitro production of porcine embryos. In a first assay, the cummulus-oocytes complexes (COCs) were matured, fertilized and cultured for embryo development in PMS supplemented with bovine serum albumin (BSA), and in North Carolina State University-23 (NCSU-23) supplemented with follicular fluid, until blastocysts evaluation. In the assay 2, maturation and culture were performed in PMS using BSA or polyvinyl alcohol (PVA) in a 2 × 2 factorial arrangement (PMS-BSA/BSA, PMS-BSA/PVA, PMS-PVA/PVA, PMS-PVA/BSA). The PMS had a positive effect on the total cell number (58.04) and the decrease of the total lipids (49.4 %) regarding the NCSU-23 medium (37.98 and 59.2 % respectively; P<0.05). The percentage of monospermic fertilization was significantly lower (42.3 %; P<0.05) when oocytes were matured with PMS-BSA than in PMS-PVA (52.6 %). The supplementation of BSA in the PMS for embryo culture, increased the blastocyst development, the cell number of blastocysts and decreased the content of total lipids (36.8 %, 46.9 and 49.6 % respectively; P<0.05), in comparison with the supplementation of PVA in the PMS for embryo culture. These results suggest that the semi-defined culture media system developed by the National Genetic Resources Center (CNRG), have proved favorable effects on the total cell number and the decrease of total lipids of porcine blastocysts in vitro produced.

Resumen El objetivo del estudio fue determinar el efecto de un sistema de medios de cultivo desarrollado en laboratorio, denominado Sistema de Medios para Cerdo (PMS por sus siglas en inglés), sobre la producción in vitro de embriones porcinos. En el primer ensayo, los complejos ovocito-células del cúmulo (COCs) fueron madurados, fertilizados y cultivados en PMS suplementado con albúmina sérica bovina (en inglés, BSA), y en un medio desarrollado por la Universidad de Carolina del Norte-23 (NCSU-23 por sus siglas en inglés) suplementado con fluido folicular hasta la evaluación de blastocisto. En el segundo ensayo, la maduración y cultivo fueron realizadas en PMS con BSA o alcohol polivinil (PVA en inglés) en un arreglo factorial 2x2 (PMS-BSA/BSA, PMS-BSA/PVA, PMS-PVA/PVA, PMS-PVA/BSA). El PMS tuvo un efecto positivo sobre el número de células totales (58.04) y la disminución de lípidos totales (49.4 %) con respecto al medio NCSU-23 (37.98 y 59.2% respectivamente; P<0.05). el porcentaje de fertilización monoespérmica fue significativamente más baja (42.3 %; P<0.05) cuando los ovocitos fueron madurados en PMS-BSA comparado con PMS-PVA (52.6 %). La suplementación de BSA en el PMS para cultivo embrionario, incrementó el desarrollo hasta blastocisto y el número de células del blastocisto, y disminuyó los lípidos totales (36.8 %, 46.9 y 49.6 % respectivamente; P<0.05), en comparación con la suplementación de PVA en el PMS para cultivo embrionario. Estos resultados sugieren que el sistema de medios de cultivo desarrollados por el Centro Nacional de Recursos Genéticos (CNRG), tienen un efecto favorable sobre el número de células totales y disminuyen los lípidos totales de blastocistos porcinos producidos in vitro.

RESUMO A biópsia embrionária associada à genotipagem permite a obtenção de informações genômicas antes mesmo da transferência dos embriões. Neste estudo, foram avaliadas amostras biopsiadas de blastocistos bovinos transferidos para receptoras (n=47), sob a hipótese de que a raça (Gir ou Girolando), o estádio embrionário (blastocisto ou blastocisto expandido) e a competência para estabelecimento de prenhez (positiva ou negativa) afetariam a quantidade e a qualidade do DNA da amostra obtida. O DNA foi extraído, amplificado, quantificado por eletroferograma e genotipado. O parâmetro call rate (CR) foi adotado para mensurar a qualidade da genotipagem. Obteve-se concentração de DNA de 86,07±171,66ng/µL e CR 0,73±0,17. O CR não variou em função da quantidade de DNA nas amostras. As variáveis raça e estádio embrionário não influenciaram a concentração de DNA, nem o CR. Houve efeito da prenhez sobre o CR (P=0,0187), mas, como houve maior CR nas amostras provenientes do grupo prenhez negativa, não foi possível associar esse parâmetro à qualidade embrionária. Concluiu-se que a raça e a qualidade embrionária não afetam os parâmetros aqui estudados em amostras embrionárias, ou seja, embriões com maiores chances de implantação não refletem alta qualidade nas amostras de biópsia genotipadas.

ABSTRACT Embryo biopsy associated with genotyping allows genomic information before embryo transfer. In this study, blastocyst biopsy samples from embryos transferred to recipients (n= 47) were evaluated, under the hypothesis that breed (Gyr or Girolando), embryonic stage (blastocyst or expanded blastocyst) and competence to establish pregnancy (positive or negative) would affect the quantity and DNA quality of samples. DNA was extracted, amplified, quantified by electropherogram and genotyped. The parameter call rate (CR) was used to measure the quality of genotyping. DNA concentration of 86.07±171.66ng/μl, and CR 0.73±0.17 was obtained. CR did not vary according to the amount of DNA in the samples. The variables breed and embryonic stage had no influence on DNA concentration or CR. There was pregnancy effect on the CR (P= 0.0187), but since there was a higher CR in the samples from the negative pregnancy group, it was not possible to associate this parameter with the embryonic quality. We conclude that the breed and embryo quality do not affect the evaluated parameters in embryonic samples. Embryos with higher chances of implantation do not reflect high quality in embryo biopsy genotyped samples.

RESUMO O objetivo foi avaliar a produção in vitro de embriões bovinos a partir de doadoras zebuína e taurina. Os complexos cumulus oócitos (COC’s) foram obtidos de 167 doadoras Bos taurus e 161 Bos indicus, por meio de Ovum pick-up. Os COC’s foram classificados quanto à qualidade morfológica, maturados em incubadora por 22 a 24h em meio de maturação, e encaminhados à fertilização entre 18 e 22h. Os zigotos foram transferidos para meio de cultivo, onde permaneceram durante sete dias. Os embriões foram classificados em mórula (MO), blastocisto inicial (BI), blastocisto (BL) e blastocisto expandido (BX), envasados em palhetas contendo meio de cultivo, e inovulados em receptoras sincronizadas. Após 30 e 45 dias da inovulação, realizou-se o diagnóstico de gestação. Os animais Bos indicus apresentaram maior produção oocitária (n = 2556) em comparação aos Bos taurus (n = 1903) (P = 0,008). Os COCs das doadoras zebu apresentaram melhor qualidade morfológica do que das doadoras taurina (n = 689 vs. 444 para COCs grau I, P < 0,0001; n = 681 vs. 509 para COCs grau II, P = 0,010, para doadoras zebu e taurina, respectivamente). Quanto à produção de embriões, houve diferença nas porcentagens obtidas de MO (0,44% zebuínas e 6,42% taurinas, P = 0,017), BL (14,18% zebuínas e 3,74% taurinas, P < 0,0001) e BX (81,43% zebuínas e 75,13% taurinas, P < 0,0001). Não foi observado diferença para BI e taxa de prenhez (P > 0,05). Os animais Bos indicus apresentaram maior recuperação oocitária e maior número de oócitos viáveis em comparação às vacas Bos taurus, como também, maior produção de embriões viáveis.

ABSTRACT In this study, the in vitro production of bovine embryos from zebu and taurine donors was compared. Cumulus-oocyte complexes (COCs) were obtained from 167 Bos taurus and 161 Bos indicus donors by ovum pick-up. COCs were classified based on their morphological quality, matured in incubators for 22 to 24 h in maturation medium, and then fertilized for 18 to 22 h. The zygotes were transferred to the culture medium for seven days. The embryos were classified as morula (OM), initial blastocyst (BI), blastocyst (BL), and expanded blastocyst (BX), before being transferred to synchronized recipient cows. Pregnancy was diagnosed 30-45 days post-transfer. The Bos indicus donors had a higher oocyte yield (n = 2556) than Bos taurus donors (n = 1903) (P = 0.008). The COCs from zebu donors had a better morphological quality than those from taurine donors (n = 689 vs. 444 for grade 1 COC, P < 0.0001; n = 681 vs. 509 for grade 2 COC, P = 0.010, for zebu and taurine donors, respectively). There were differences in embryo production percentages obtained from OM (0.44% from zebu and 6.42% from taurine, P = 0.017), BL (14.18% from zebu and 3.74% from taurine, P < 0.0001), and BX (81.43% from zebu and 75.13% from taurine, P < 0.0001). No significant difference was observed for embryo production from BI and pregnancy rate (P > 0.05). The Bos indicus cows showed greater oocyte recovery, number of viable oocytes, and production of viable embryos than the Bos taurus cows.

Abstract OBJECTIVE: To evaluate results of a combined approach in IVF, using minimal stimulation, preimplantation genetic testing for aneuploidy, and single blastocyst transfer. MATERIALS AND METHODS: Retrospective cohort study over a three years’ period in two fertility centers in Mexico. A total of 125 patients were included, between 25 and 45 years old, with minimal stimulation IVF, preimplantation genetic testing for aneuploidy (PGT-A) and single euploid embryo transfer. PGT was performed using microarrays and next generation sequencing (NGS). RESULTS: A total of 175 cycles (mean age: 39 years old) were analyzed in 125 patients. On average, five eggs were collected per cycle; fertilization rate was 86.57%; blastocyst rate was 50.7% per fertilized egg. Only 33% of embryos were euploid. Pregnancy rate per transferred embryo was 71%. Live birth rate was 60.8% (42 births). CONCLUSIONS: A combination of minimal stimulation, PGT-A and single blastocyst embryo transfer can yield a high live birth rate.

Resumen OBJETIVO: Evaluar los desenlaces de una estrategia combinada para fertilización in vitro: mínima estimulación ovárica, diagnóstico genético preimplantación para aneuploidias y transferencia de un solo embrión. MATERIALES Y MÉTODOS: Estudio de cohorte, retrospectivo, efectuado en dos centros de reproducción de México, en un periodo de tres años. Se incluyeron pacientes entre 25 y 45 años, en protocolo de fertilización in vitro, con mínima estimulación, diagnóstico genético preimplantación para aneuploidias (PGT-A) y transferencia de embrión único. El diagnóstico genético preimplantación se estableció mediante microarreglos y secuenciación de nueva generación (NGS). Para el análisis estadístico se integraron 5 grupos, según la edad de las pacientes: menores de 35 años; 35 a 37 años; 38 a 40 años; 41 a 42 años; y mayores de 42 años. Mediante estadística descriptiva se analizaron las variables numéricas y categóricas. RESULTADOS: Se analizaron 175 ciclos, en 125 pacientes (edad promedio: 39 años ± 5). Se obtuvieron, en promedio, 5 óvulos por ciclo. La tasa de fertilización fue de 86.5% y la de blastocisto por óvulo fertilizado de 50.7%. Se tomó biopsia para diagnóstico genético preimplantación para aneuploidias a 404 embriones. La tasa general de euploidia fue de 33%. Se efectuaron 69 transferencias de embrión único, con una tasa de embarazo por transferencia de 71%. La tasa de nacimiento por transferencia fue de 60.8% (42 nacimientos). CONCLUSIONES: La combinación de mínima estimulación, diagnóstico genético preimplantación para aneuploidias y transferencia de embrión único, es un procedimiento adecuado para alcanzar una tasa de nacimiento alta.