Abstract Background: The production of carbapenem-hydrolyzing β-lactamases is one of the most concerning resistance mechanisms since it eliminates the last therapeutic option against multidrug resistant microorganisms. Aim: To determine the production of KPC and NDM-1 type carbapenemases, using phenotypic and genotypic methods, in isolated enterobacteria in a clinical laboratory in the city of Maracay, Venezuela. Methods: The production of carbapenemases was determined by phenotypic (according to the Malbrán algorithm) and genotypic methods (amplification of the blaNDM-1 and blaKPC genes by PCR) in clinical isolates of Enterobacteriaceae during the period March-August 2018. Results: 605 Enterobacteriaceae of different species were identified, being Escherichia coli the strain with the highest percentage of isolation (61.3%), followed by Klebsiella pneumoniae (14.9%). Sixteen strains (2.64%) were positive for carbapenemases production: 13 strains of K. pneumoniae and three of the Enterobacter cloacae complex. PCR showed that 14 strains (87.5%) carry the blaNDM-1 gene and two strains (12.5%) the blaKPC gene; 100% agreement was observed between phenotypic determination and PCR for both groups of enzymes. Conclusions: The results of this study showed a higher incidence of metallo-β-lactamase type NDM-1, which rapid dissemination and consequently difficult control has been cause of epidemiological alert. The identification of the type of enzyme would allow establishing more accurate management and control strategies in order to eradicate these pathogens.

Resumen Introducción: La producción de β-lactamasas capaces de hidrolizar a los carbapenémicos es uno de los mecanismos de resistencia más preocupantes porque eliminan la última opción terapéutica frente a los microorganismos multi-resistentes. Objetivo: Determinar la producción de carbapenemasas tipo KPC y NDM-1, empleando métodos fenotípicos y genotípicos, en enterobacterias aisladas en un laboratorio clínico de la ciudad de Maracay, Venezuela. Métodos: Se determinó la producción de carbapenemasas mediante métodos fenotípicos (según algoritmo de Malbrán) y genotípicos (amplificación de los genes blaNDM-1 y blaKPC por RPC) en enterobacterias aisladas en un laboratorio clínico durante el período marzo-agosto 2018. Resultados: Se identificaron 605 enterobacterias de diferentes especies, siendo Escherichia coli la cepa con mayor porcentaje de aislamiento (61,3%), seguida por Klebsiella pneumoniae (14,9%). Diez y seis enterobacterias (2,64%) fueron positivas para la producción de carbapenemasas: 13 cepas de K. pneumoniae y tres del complejo Enterobacter cloacae. La RPC demostró que 14 cepas (87,5%) contienen el gen blaNDM-1 y dos (12,5%) el gen blaKPC; se observó 100% de concordancia entre la determinación fenotípica y la RPC para ambos grupos de enzimas. Conclusiones: Los resultados mostraron mayor incidencia de la metalo-β-lactamasa tipo NDM-1, reconocida como una alarma epidemiológica debido a que su rápida diseminación dificulta su control, por lo que la identificación del tipo de enzima permitiría establecer estrategias de manejo y control más certeras con la finalidad de erradicar a dichos patógenos.

ABSTRACT Objective: Typify the SCCmec cassette in methicillin-resistant strains of Staphylococcus aureus in clinical isolates from health centers in the State of Aragua-Venezuela and compare the presence of SCCmec genotypes among the state health centers and according to the type of infection. Materials and methods: 81 MRSA strains from four health centers of the Aragua-Venezuela State were studied. Methicillin resistance was performed with the Kirby-Bauer method with oxacillin (1 µg) and cefoxitin (30 µg) disks. The mecA gene and SCCmec were analyzed by the multiple PCR technique. Results: Only 55 isolates (67.9%) amplified the mecA gene, and 24 strains (43.6%) amplified SCCmec. SCCmec type I was the most frequency, followed by SCCmec IV and SCCmec III, representing 62.5%, 25% and 12.5%, respectively. SCCmec I was predominant in health center A (80%), while in B and C 60% and 100% respectively were SCCmec IV. At health center D, 50% turned out to be SCCmec I and 50% SCCmec IVd. A relationship was found between the SCCmec and the health center with statistical significance. SCCmec I predominated in skin and soft tissue and respiratory infections with 63.2% and 50%, respectively. There was no association between genotype and type of infection with a p value greater than 0.05. Conclusions: The prevalence of SCCmec I and IV will allow establishing new measures in the use of antibiotics and epidemiological control.

RESUMEN Objetivos: Tipificar el casette SCCmec en cepas de Staphylococcus aureus resistentes a meticilino (SARM) en aislados clínicos de centros de salud del Estado Aragua-Venezuela y comparar la presencia de los genotipos SCCmec entre los centros de salud del estado y según el tipo de infección. Materiales y métodos: Durante enero y agosto de 2015 se estudiaron 81 cepas SARM de cuatro centros de salud del estado de Aragua en Venezuela. La resistencia al meticilino se midió con el método de Kirby-Bauer con discos de oxacilina (1 µgr) y cefoxitina (30 µgr). El gen mecA y el SCCmec se analizaron por la técnica de reacción en cadena de polimerasa múltiple. Resultados: 55 aislados (67,9%) amplificaron el gen mecA, y 24 cepas (43,6%) amplificaron el SCCmec. El SCCmec I fue el más frecuente, seguido de SCCmecIV y SCCmec III, representaron el 62,5%, 25% y 12,5%, respectivamente. El SCCmec I fue predominante en el centro de salud A (80%), mientras que el SCCmec IV se encontró en el centro de salud B (60%) y C (100%). En el centro de salud D, 50% resultó ser SCCmec I y 50% SCCmec IVd. Se encontró relación entre el SCCmec y el centro de salud con significancia estadística. En infecciones de piel y tejidos blandos y en las respiratorias predominó el SCCmec I con 63,2% y 50% respectivamente. Conclusiones: La frecuencia de SCCmec I y IV permitirá establecer nuevas medidas en el uso y control de la resistencia a los antibióticos.

ABSTRACT Objective: Typify the SCCmec cassette in methicillin-resistant strains of Staphylococcus aureus in clinical isolates from health centers in the State of Aragua-Venezuela and compare the presence of SCCmec genotypes among the state health centers and according to the type of infection. Materials and methods: 81 MRSA strains from four health centers of the Aragua-Venezuela State were studied. Methicillin resistance was performed with the Kirby-Bauer method with oxacillin (1 µg) and cefoxitin (30 µg) disks. The mecA gene and SCCmec were analyzed by the multiple PCR technique. Results: Only 55 isolates (67.9%) amplified the mecA gene, and 24 strains (43.6%) amplified SCCmec. SCCmec type I was the most frequency, followed by SCCmec IV and SCCmec III, representing 62.5%, 25% and 12.5%, respectively. SCCmec I was predominant in health center A (80%), while in B and C 60% and 100% respectively were SCCmec IV. At health center D, 50% turned out to be SCCmec I and 50% SCCmec IVd. A relationship was found between the SCCmec and the health center with statistical significance. SCCmec I predominated in skin and soft tissue and respiratory infections with 63.2% and 50%, respectively. There was no association between genotype and type of infection with a p value greater than 0.05. Conclusions: The prevalence of SCCmec I and IV will allow establishing new measures in the use of antibiotics and epidemiological control.

RESUMEN Objetivos: Tipificar el casette SCCmec en cepas de Staphylococcus aureus resistentes a meticilino (SARM) en aislados clínicos de centros de salud del Estado Aragua-Venezuela y comparar la presencia de los genotipos SCCmec entre los centros de salud del estado y según el tipo de infección. Materiales y métodos: Durante enero y agosto de 2015 se estudiaron 81 cepas SARM de cuatro centros de salud del estado de Aragua en Venezuela. La resistencia al meticilino se midió con el método de Kirby-Bauer con discos de oxacilina (1 µgr) y cefoxitina (30 µgr). El gen mecA y el SCCmec se analizaron por la técnica de reacción en cadena de polimerasa múltiple. Resultados: 55 aislados (67,9%) amplificaron el gen mecA, y 24 cepas (43,6%) amplificaron el SCCmec. El SCCmec I fue el más frecuente, seguido de SCCmecIV y SCCmec III, representaron el 62,5%, 25% y 12,5%, respectivamente. El SCCmec I fue predominante en el centro de salud A (80%), mientras que el SCCmec IV se encontró en el centro de salud B (60%) y C (100%). En el centro de salud D, 50% resultó ser SCCmec I y 50% SCCmec IVd. Se encontró relación entre el SCCmec y el centro de salud con significancia estadística. En infecciones de piel y tejidos blandos y en las respiratorias predominó el SCCmec I con 63,2% y 50% respectivamente. Conclusiones: La frecuencia de SCCmec I y IV permitirá establecer nuevas medidas en el uso y control de la resistencia a los antibióticos.

El agua puede ser un vehículo para agentes patógenos y oportunistas portadores de multiresistencia y con capacidad de formar biopelículas (CFB). Se evaluó la presencia de indicadores microbiológicos y bacilos gramnegativos no fermentadores (BGNNF) en agua potable envasada y se estudió la susceptibilidad antimicrobiana y la CFB de los mismos. Se seleccionaron al azar 50 muestras de 250 mL obtenidos de envases de agua potable (20 L), provenientes de igual número de hogares. A cada muestra le fue realizado recuento de heterótrofos aerobios (vertido en placa), coliformes totales y termotolerantes (filtración por membrana), CFB (microplaca) y susceptibilidad antimicrobiana (Kirby-Bauer). El 92% y el 84% de las muestras presentaron coliformes totales y termotolerantes respectivamente, valores por encima de lo establecido en la Gaceta Oficial Venezolana N.° 36.395, mientras que el 86% presentó heterótrofos aerobios con cuentas >100 UFC/mL. El mayor porcentaje de BGNNF aislados pertenecía al complejo Acinetobacter baumannii/calcoaceticus (29,3%), seguido de Pseudomonas aeruginosa (17,4%), con moderada capacidad de formar biopelículas. No hubo asociación significativa entre la resistencia antimicrobiana y la CFB (p>0,05). Un porcentaje elevado de las muestras, no se ajustó a los parámetros microbiológicos establecidos en Gaceta, por lo que no se garantiza la inocuidad de las mismas.

Water can be a vehicle for multiresistant carrier pathogenic and opportunist agents with biofilm forming capacity (BFC). The presence of microbiological indicators and non fermenting Gram negative bacilli (NFGNB) was evaluated in bottled drinking water, as well as their antimicrobial susceptibility and BFC. Fifty 250 mL drinking water samples were randomly selected from 20 L drinking water bottles from the same number of homes. Each sample was tested for aerobic heterothrophics (discharged in a plate) counts, total and thermo tolerant coliforms (membrane filtration), BFC (microplate) and antimicrobial susceptibility (Kirby-Bauer). The results showed that 92% and 84% of the samples carried total and thermo tolerant coliforms respectively, values above those established in the Venezuelan Official Gazette N.o 36,395, while 86% presented aerobic heterothrophics with counts >100 CFU/mL. The highest percentage of isolated NFGNBs belonged to the Acinetobacter baumannii/calcoaceticus complex (29.3%), followed by Pseudomonas aeruginosa (17.4%) which has a moderate biofilm formation capacity. There was no significant association between antimicrobial resistance and the BFC (p>0.05). A high percentage of the samples were not adjusted to the biological parameters established in the Official Government Gazette; therefore, it is not possible to guarantee their safety.

Bacterias indicadoras de contaminación tales como bacterias heterótrofas, coliformes totales y termotolerantes fueron enumeradas en agua potable embotellada usando métodos estándar y filtración a través de membrana. El desarrollo de biopelículas y la susceptibilidad antimicrobiana (método de Kirby-Bauer) fueron evaluados sobre sesenta aislados de coliformes seleccionados de forma aleatoria. De 50 muestras, en un elevado porcentaje (94), se observó niveles de bacterias heterotróficas por encima de 100 UFC/mL de agua, 38 % presentó al menos una UFC/100 mL de coliformes totales o termotolerantes, mientras que, 30 % y 28 %, presentaron más de diez UFC/100 mL para ambos indicadores, respectivamente. Las especies de coliformes identificadas en mayor proporción fueron, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli y Klebsiella oxytoca. Usando un ensayo in vitro para detectar la formación de biopelículas se determinó que entre un 75,8 y 79,2 % de los coliformes totales y termotolerantes, respectivamente, fueron descritos como moderados o fuertes formadores de biopelículas. No se observaron diferencias significativas (P>0,05) con respecto a la capacidad de formación de biopelículas entre los dos grupos. La mayoría de los aislados resultaron susceptibles frente a los antimicrobianos evaluados, únicamente dos especies presentaron fenotipos de resistencia no naturales. Perfiles de multiresistencia, típicos de especies asociadas con actividades clínicas o veterinarias, fueron identificados en un aislado de Enterobacter cloacae (betalactamasas tipo AmpC derreprimida) y un aislado de Escherichia coli fue resistente a ampicilina. Este estudio sugiere que el agua potable en botellones plásticos que se expende en algunas áreas urbanas de Carabobo, Venezuela, puede representar un riesgo para la salud.

Pollution indicator bacteria such as heterotrophic bacteria, total and thermotolerant coliforms were quantified in bottled drinking water using standard method and membrane filter procedure. Biofilm formation and antimicrobial susceptibility (Kirby-Bauer method) were tested on sixty randomly selected coliform strains. Among 50 water samples, a large percentage (94) were found with heterotrophic bacteria levels above 100 CFU/mL, 46 % showed at least one CFU/100 mL of thermotolerant or total coliformes whereas 28 % and 30 % showed more than ten CFU/100 mL for both indicators. Coliform species found in higher proportion were, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli and Klebsiella oxytoca. Using an "in vitro" assay for biofilms formation it was determined that between 75.8 y 79.2 % of total and thermotolerant coliforms, respectively, were found to be moderate or strong biofilm formers. There were no significant differences (P>0.05) between both groups regarding the capacity for biofilm formation. Most of the isolates were susceptible against the antibiotics tested and only two species showed unnatural resistance phenotypes. Multiresistance profiles, typical of strains associated with human clinical or veterinary activities were identified in one Enterobacter cloacae isolated (derepressed AmpC beta-lactamases) and one Escherichia coli strain was ampicilin resistant. This study suggests that the water sold in some plastic bottles in some urban areas near by Carabobo, Venezuela, may be a risk to health.

The utility of immunomagnetic separation (IMS) for the recovery of Escherichia coli O157:H7 in milk creams was evaluated. The efficiency of different pre-enrichments broths previous to ISM was determined and different agars were analyzed (differential and/or selective) for plating of the inmunobeads. Portions of 25 g from milk creams were inoculated with pathogen low levels (50, 10 and 1 cell/g) and then, were enriched in buffered peptone water with vancomycin (BPW-V), buffered peptone water with vancomycin and cefixime (BPW-VC) and triptone soya broth with vancomycin, cefixime and tellurite (TSB-VCT) being incubated 35ºC/18 hours. Then, IMS was applied and immunobeads were plated onto sorbitol MacConkey agar (SMA), sorbitol MacConkey agar with cefixime and tellurite (SMA-CT) and chromogenic agar with tellurite and cefixime (CRGA-TC). It was observed significant differences (p<0,05) in the recovery percentages according to the pre-enrichment broth used, being obtained the biggest recovery rates with the use of TSB-VCT for the three inocula levels. The recovery rates did not vary significantly (p<0,05) among the utilized agars, while the number of inoculated cells impacts the recovery percentages, being bigger as it increases the inocula. In conclusion, IMS is a sensitive method for the recovery of Escherichia coli O157:H7 in milk creams, recommending for isolation of this pathogen, the enrichment in TSB-VCT, application of IMS, and plating of immunobeads onto nonselective agar (SMA) and selective agar (SMA-TC or CRGA-TC).