RESUMO A utilização de promotores preferencialmente expressos em tecidos vegetais específicos é uma estratégia desejável na busca por resistência a patógenos que colonizam tais tecidos. A bacteria Candidatus Liberibacter asiaticus (Las), associada à doença huanglongbing (HLB) em citros, coloniza o tecido floemático. Alguns promotores, além de conferir expressão específica em certos tecidos, podem também responder diferencialmente à presença de patógenos. O objetivo deste estudo foi verificar se a presença de Las poderia modular a ativação dos promotores de floema AtPP2 (Arabidopsis thaliana phloem protein 2), AtSUC2 (A. thaliana sucrose transporter 2) e CsPP2 ( pCitrus phloemrotein 2), conhecidos por expressão específica em floema de Citrus sinensis. Plantas de laranja ‘Hamlin’ (Citrus sinensis L. Osbeck) transformadas com o gene reporter uidA (GUS) sob controle dos promotores AtPP2, AtSUC2 e CsPP2 foram infectadas para avaliar a interdependência entre a expressão dos transgenes e concentração de Las. Plantas foram inoculadas com Las por meio de Diaphorina citri e dezoito meses após, a concentração de bactéria e expressão do gene uidA foram determinadas por qPCR e RT-qPCR, respectivamente. A expressão do gene reporter dirigida pelo promotor AtSUC2 foi forte e positivamente correlacionada com a concentração de Las. Portanto, este promotor contém características desejáveis quanto à especificidade de expressão e indução específica por patógeno para a produção de plantas transgênicas tolerantes a Las.

ABSTRACT The use of promoters preferentially expressed in specific plant tissues is a desirable strategy to search for resistance for pathogens that colonize these tissues. The bacterium Candidatus Liberibacter asiaticus (Las), associated with huanglongbing disease (HLB) of citrus, colonizes phloem vessels. Some promoters, besides conferring tissue-specific expression, can also respond to the presence of the pathogen. The objective of the present study was to verify if the presence of Las could modulate the activation of the phloem-specific promoters AtPP2 (Arabidopsis thaliana phloem protein 2), AtSUC2 (A. thaliana sucrose transporter 2) and CsPP2 ( pCitrus phloemrotein 2), known to be expressed in Citrus sinensis phloem. ‘Hamlin’ sweet orange plants (Citrus sinensis L. Osbeck) transformed with the uidA (GUS) reporter gene under the control of AtPP2, AtSUC2 and CsPP2 promoters were infected to evaluate the interdependence between transgene expression and the concentration of Las. Plants were inoculated with Las by Diaphorina citri and eighteen months later, bacterial concentration and uidA expression were determined by qPCR and RT-qPCR, respectively. Reporter gene expression driven by AtSUC2 promoter was strongly and positively correlated with Las concentration. Therefore, this promoter combines desirable features of both tissue-specificity and pathogen-inducibility for the production of transgenic plants tolerant to Las.

O objetivo deste trabalho foi obter plantas transgênicas de laranja 'Pêra' e 'Valência' por meio do gene D4E1 dirigido pelo promotor Arabidopsis thaliana phloem protein (AtPP2) e quantificar a expressão dos transgenes nos diferentes eventos de transformação. Os experimentos de transformação genética foram realizados com segmentos de epicótilo cocultivados com Agrobacterium tumefaciens. Seis plantas de laranja 'Pêra' e sete plantas de laranja 'Valência' foram confirmadas como distintos eventos transgênicos por meio das técnicas de reação em cadeia da polimerase (PCR) e Southern blot. A expressão dos transgenes foi quantificada por PCR quantitativo em tempo real. Os níveis de expressão do gene D4E1 variam de 5 a 50 vezes entre os diferentes eventos de transformação.

The objective of this work was to produce transgenic 'Pêra' and 'Valência' sweet orange plants using the D4E1 gene driven by the Arabidopsis thaliana phloem protein (AtPP2) promoter and to quantify transgene expression in different transformation events. Genetic transformation experiments were carried out with epicotyl segments co‑cultivated with Agrobacterium tumefaciens. Six plants from 'Pêra' sweet orange and seven plants from 'Valência' sweet orange were confirmed as different transgenic events by means of the polymerase chain reaction (PCR) and the Southern blot techniques. Transgene expression was quantified using real‑time quantitative PCR. D4E1 gene expression levels vary from 5 up to 50 times among different transformation events.

O objetivo deste trabalho foi otimizar a regeneração in vitro via organogênese a partir de tecidos de plantas adultas das laranjas doces 'Hamlin', 'Pêra' e 'Valência'. Os explantes foram cultivados em meio EME com diferentes concentrações de 6-benzilaminopurina (BAP) e ácido naftalenoacético (ANA), a 27ºC sem luz por 50 dias, seguido de fotoperíodo de 16 horas por 20 dias. A regeneração foi avaliada 50 e 70 dias após o cultivo in vitro. A organogênese nas cultivares Hamlin e Valência foi favorecida pelo uso de EME suplementado com BAP, enquanto ANA não apresentou efeito aparente.

The objective of this work was to optimize in vitro plant regeneration via organogenesis from tissues of adult 'Hamlin', 'Pêra', and 'Valência' sweet orange plants. Explants were grown in EME culture medium with different concentrations of 6-benzylaminopurine (BAP) and naphthaleneacetic acid (NAA), at 27ºC in the absence of light for 50 days, followed by a 16-hour photoperiod for 20 days. Regeneration was assessed 50 and 70 days after in vitro culture. Organogenesis in cultivars Hamlin and Valência was promoted by EME supplemented with BAP, while NAA showed no apparent effect.

Transformação genética é considerada uma importante ferramenta auxiliar no melhoramento genético de plantas cítricas. Entretanto, a eficiência de transformação pode variar em função de diversos fatores, incluindo a própria construção gênica utilizada. Este trabalho buscou avaliar a eficiência de transformação genética de plantas de citrange 'Carrizo' [Poncirus trifoliata (L.) Raf. x Citrus sinensis (L.) Osbeck] com duas construções gênicas diferentes contendo o gene uidA (GUS) sob o controle dos promotores Arabidopsis thaliana phloem protein 2 (AtPhP2) e Arabidopsis thaliana sucrose transporter 2 (AtSuT2). Segmentos de epicótilo de plântulas germinadas in vitro foram utilizados como explantes. O gene nptII, que confere resistência ao antibiótico canamicina, foi utilizado nas construções gênicas como agente de seleção para regeneração de plantas transgênicas. O ensaio histoquímico com X-GLUC foi realizado em todas as brotações regeneradas para verificar a expressão do gene uidA. Dos 4.790 segmentos de epicótilo utilizados, registrou-se a regeneração de 366 brotações com reação positiva no ensaio histoquímico, as quais foram enxertadas em porta-enxertos cultivados in vitro. Cinco dessas brotações, de cada construção gênica, foram selecionadas para análise da PCR, com primers específicos para amplificação da sequência do gene uidA. A inserção do transgene foi confirmada por PCR em todas as brotações selecionadas. A eficiência de transformação e o número de brotos escapes, avaliada pelo teste histoquímico, variaram em função das construções gênicas utilizadas.

Genetic transformation is considered an important tool to be applied in citrus genetic improvement. However, transformation efficiency may vary according to several factors, including the genetic construction utilized. This work aimed to evaluate the transformation efficiency of 'Carrizo' citrange [Poncirus trifoliata (L.) Raf. x Citrus sinensis (L.) Osbeck], containing two different gene constructions including the uidA (GUS) gene controlled by the promoters Arabidopsis thaliana phloem protein 2 (AtPhP2) and Arabidopsis thaliana sucrose transporter 2 (AtSuT2). Epicotil segments from in vitro germinated seedlings were used as explants. The nptII gene, which confers resistance to the antibiotic kanamycin, was used in the constructions as a selection agent to regenerate transgenic plants. X-GLUC histochemical analysis was performed in all regenerated shoots in order to verify the expression of the uidA gene. From the 4790 epicotyl segments utilized, 366 shoots had a positive reaction in the histochemical analysis, and were further grafted on in vitro grown rootstocks. Five out of these shoots, from each gene construction, were selected to perform PCR analysis, with specific primers for uidA gene sequence amplification. All selected plants evaluated by PCR confirmed gene integration. Transformation efficiency and number of non-transformed shoots, evaluated by histochemical analysis, varied among gene constructions utilized

A regeneração de plantas, por organogênese ou embriogênese somática, a partir do cultivo de células e tecidos vegetais in vitro, é a base para a utilização da biotecnologia no melhoramento. O objetivo deste trabalho foi avaliar a embriogênese somática a partir de calos embriogênicos das cultivares de laranjeiras doces 'Hamlin', 'Pêra', 'Natal', 'Lima Verde' e 'Westin', em função da composição dos meios de cultura relacionada à fonte e concentração de diferentes carboidratos, utilizando-se meio de cultura MT modificado com 500mg L-1 de extrato de malte, acrescido de sacarose, galactose, glicose, sorbitol, lactose ou maltose, nas concentrações de 18, 37, 75, 110 ou 150mM à 27°C. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, em esquema fatorial cinco (cultivares) x seis (fontes de carboidratos) x cinco (concentrações das fontes de carboidratos no meio de cultura), com cinco repetições. A formação de embriões somáticos variou conforme a cultivar, e as laranjeiras 'Hamlin' e 'Natal' registraram o maior número de embriões, enquanto 'Lima Verde' e 'Westin' apresentaram menores números. A melhor fonte de carboidratos para indução de embriogênese somática foi a maltose, seguida pela lactose, nas concentrações de 37 e 75mM. Embriogênese somática não foi observada nos meios de cultura contendo galactose, glicose ou sorbitol para nenhuma cultivar estudada.

Plant regeneration, by organogenesis or somatic embryogenesis, from cell cultures and in vitro plant tissue culture is the basis for biotechnology usage in plant breeding. This research aimed to evaluate somatic embryogenesis from embryogenic calli of 'Hamlin', 'Pêra', 'Natal', 'Lima Verde', and 'Westin' sweet orange cultivars related to culture medium composition as source and concentration of carbohydrates with the use of MT culture medium modified with 500mg L-1 of malt extract, supplemented with sucrose, galactose, glucose, maltose, lactose, or sorbitol at concentrations of 18, 37, 75, 110 or 150mM at 27°C. Statistical design were complete randomized, in a factorial five (cultivars) x six (carbohydrate source) x six (carbohydrate concentration in culture medium) with five replicates. The production of somatic embryos varied with the genotype, as 'Hamlin' and 'Natal' cultivars registered higher number of embryos, whereas 'Lima Verde' and 'Westin' showed lower numbers. The best carbohydrate source was maltose, followed by lactose at concentrations of 37 and 75mM. Somatic embryogenesis was not observed on culture media supplemented with galatose, glucose or sorbitol in any studied cultivar.

A qualidade de luz pode alterar a morfogênese das plantas por meio de uma série de processos mediados por receptores de luz, principalmente na região do vermelho e azul. O objetivo do presente estudo foi verificar alterações anatômicas foliares e características biométricas de Cattleya loddigesii 'Tipo', cultivadas in vitro, sob diferentes malhas coloridas com nível de radiação de 50% de sombreamento. Plântulas oriundas de autopolinização e sementes germinadas in vitro, com aproximadamente 1,0cm de comprimento e com raízes, foram inoculadas em meio WPM e submetidas a diferentes condições de incubação. Testou-se o efeito de sombrites coloridos (vermelho e azul) sobre os frascos cultivados em casa de vegetação (CV) e sala de crescimento (SC), além dos tratamentos, nos dois ambientes, sem utilização das telas coloridas. A avaliação foi efetuada 180 dias após inoculação. Com os resultados obtidos, observou-se que o ambiente de cultivo promove alterações anatômicas e biométricas em plântulas de Cattleya loddigesii 'Tipo' micropropagadas. As alterações promovidas pelo cultivo em luz natural evidenciam maior capacidade fotossintética, por meio de maior diferenciação dos tecidos clorofilianos, promovendo uma superfície foliar anatomicamente adaptada à fase de aclimatização.

The light quality is responsible for the morphogenesis in plants. It is mediated by a series of processes involving light receptors, mainly in the red blue region. The aim of this research was to observe the anatomical leaf alterations as well as the biometric characteristics of in vitro cultured Cattleya loddigesii 'Tipo'. Two different colour shading nets (red and blue, 50% mesh) were tested and compared with a control without the shading nets in greenhouse and growth room. Plantlets of 1.0cm in length with roots produced by self pollinization and by seeds in vitro germination were inoculated in WPM medium and submitted to these different incubation environments. After 180 days of inoculation the plantlets were evaluated. It was observed that the culture environment promote anatomical and biometric alterations in Cattleya loddigesii 'Tipo' plantlets micropropagated. The changes promoted by the cultivation in natural light show greater photosynthetic capacity, through greater differentiation of the chlorenchyma tissue, promoting a leaf surface anatomically adapted to the acclimatization stage.

A realização de pesquisas que possibilitem redução dos custos de produção e ou melhoria na qualidade das mudas micropropagadas tem sido imprescindível para possibilitar a utilização e difusão deste tipo de material propagativo. O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência de alterações no ambiente de cultivo sobre o crescimento e anatomia de bananeiras na fase de alongamento/enraizamento in vitro. Para tanto, brotações axilares das cultivares Caipira e Pacovan foram cultivadas em meio MS contendo ANA (1 mg L-1) e agar (6 g L-1), onde foram aplicados os tratamentos. Os tratamentos consistiram de concentrações de sacarose (15 g L-1 e 30 g L-1) e ambientes de cultivo (Natural - casa de vegetação e Artificial - sala de crescimento). No fim de 45 dias, foram determinadas características de crescimento e de anatomia foliar. Houve influência significativa das alterações no ambiente de cultivo in vitro sobre as características avaliadas. Verificou-se que o uso da luz natural associada a 15 g L-1 de sacarose para a cultivar Caipira e 30 g L-1 para a Pacovan pode ser utilizada satisfatoriamente na fase de alongamento/enraizamento in vitro. Maior espessamento dos parênquimas clorofilianos e incremento na densidade estomática são induzidos em ambiente natural. A luz natural como alternativa às lâmapadas fluorescentes, no alongamento/enraizamento in vitro, representa potencial para reduzir os custos de produção e promover melhorias na anatomia foliar das mudas micropropagadas.

Initiatives aiming at to reduce production costs and to improve the quality of plantlets are necessary in order to turn micropropagation commercially more feasible. The objective of this work was to evaluate the influence of the environment on the growth and leaf anatomy of banana plantlets during in vitro elongating/rooting phase. Shoots of Caipira and Pacovan cultivars were cultivated in MS medium, supplemented with NAA (1 mg L-1) and agar (6 g L-1), submitted to sucrose concentrations of 15 g L-1 or 30 g L-1 under natural light of greenhouse or artificial light of growth chamber. Investigations on growth and leaf anatomy were carried out after 45 days. It was observed that natural light and 15 g L-1 sucrose for 'Caipira' or 30 g L-1 for Pacovan cultivars promote thicker of chlorophyllian parenchyma and increased stomatal density. Natural light as an alternative to fluorescent bulbs during the in vitro elongating/rooting phase reduces the production costs and improve anatomical charachteristics of leaves of micropropagated banana plants.

Brotes de Ananas comosus cv. Imperial fueron enraizados in vitro en distintas condiciones ambientales (luz natural y artificial) y después de dos meses las plántulas fueron transferidas para el substrato comercial (Plantmax®) en invernadero. El crecimiento de las plantas y la anatomía de las hojas fueron avaluadas en distintos tiempos (0, 7, 15, 30 y 60 días) del proceso de climatización. EL empleo de luz natural durante la fase de emisión de raíces in vitro proporciona el mejor desarrollo agronómico y anatómico de las plantas de piña durante la fase de climatización, presentando el beneficio de ahorrar energía eléctrica para la iluminación artificial en laboratorios de cultivo de tejidos vegetales.

Shoot tips of Ananas comosus ‘Imperial’ were rooted in vitro under two environments (artificial and natural light) and after two months the plantlets were transferred to commercial substrate (Plantmax®) in a greenhouse. Plant growth and leaf anatomy were evaluated at 0, 7, 15, 30 and 60-days during acclimatization. The in vitro rooting under natural light provides better agronomic and anatomical performances of Ananas comosus plants, with the benefit of saving electric energy for artificial illumination in vegetal tissue culture laboratories.

Brotações de Ananas comosus cv. Imperial, foram enraizadas in vitro em diferentes condições ambientais (luz artificial e natural) e após dois meses as plântulas foram transferidas para substrato comercial (Plantmax®) em casa de vegetação. O crescimento das plantas e anatomia foliar foram avaliados em diferentes tempos (0, 7, 15, 30 e 60 dias) do processo de aclimatização. O emprego de luz natural durante a fase de enraizamento in vitro proporciona melhor desempenho agronômico e anatômico das plantas de abacaxizeiro durante a fase de aclimatização, apresentando o benefício de economizar energia elétrica para iluminação artificial em laboratórios de cultura de tecidos vegetais.

O trabalho objetivou avaliar a influência do tempo de permanência em meio de enraizamento sobre o crescimento in vitro e ex vitro de plantas de bananeira. Como explantes, foram utilizadas brotações axilares provenientes do estabelecimento e multiplicação in vitro de ápices caulinares das cultivares Caipira (AAA), Preciosa (AAAB) e Japira (AAAB). Para o enraizamento, empregou-se o meio MS reduzido a 50% da concentração de sais, adicionado de 30 g.L-1 de sacarose, 1 mg.L-1 de AIB e 6 g.L-1 de ágar. Os tratamentos foram dispostos em esquema fatorial 3x4, com três cultivares (Caipira, Preciosa e Japira) e quatro períodos de enraizamento in vitro (7; 14; 21 e 28 dias), num total de 12 tratamentos. Ao final de cada período, a altura da parte aérea, o número e o comprimento de raízes foram avaliados, e as plantas, submetidas ao processo de aclimatização por 90 dias. Após esse período, as plantas foram avaliadas quanto à sobrevivência, número e comprimento de raízes, diâmetro do pseudocaule e massa seca de raízes, parte aérea e total. De modo geral, observou-se que a fase de indução de raízes nas brotações de bananeira in vitro ocorreu até os 14 dias de cultivo em meio de enraizamento, havendo apenas crescimento em tamanho das raízes após esse período. Entre as cultivares, verificou-se que, com exceção do diâmetro de pseudocaule, a cultivar Caipira apresentou crescimento vegetativo in vitro e durante a aclimatização (altura de plantas, número e comprimento de raízes e massa seca da parte aérea, raízes e total) superior às cultivares Preciosa e Japira. Após 21 dias de permanência em meio de enraizamento, a taxa de sobrevivência das plantas, observada em casa de vegetação, alcançou 100%, independentemente da cultivar testada.

The objective of the present study was to assess the influence of the exposition time to rooting medium on the in vitro and ex vitro growth of banana plants. As explants, new axillaries buds obtained from the in vitro establishment and multiplication of stem apices of Caipira (AAA), Preciosa (AAAB) and Japira (AAAB) cultivars were used. The MS medium with reduction to 50% of the salt concentration adding 30 g.L-1 of sucrose, 1 mg.L-1 of IBA, and 6 g.L-1 of agar was used to induce rooting. The treatments were analyzed in a 3x4 factorial design, with three cultivars (Caipira, Preciosa and Japira) and four in vitro rooting periods (7, 14, 21 and 28 days), given a total of 12 treatments. At the end of each period, the height of the aerial portion, and number and length of roots were assessed, and the plants were submitted to 90 days of acclimatization. After that, the survival, number and length of roots, pseudostem diameter, and dry weight of the roots, aerial and total portions of the plants were assessed. Generally, the root induction step in the in vitro banana budding occurred up to 14 days of cultivation in rooting medium, and after that, the roots grew only in length. Among the cultivars, it was verified that, with the exception of the pseudostem diameter, the Caipira cultivar showed superior in vitro vegetative growth, and during the acclimatization, the height of the plant, number and length of the roots, and dry mass of the aerial, roots, and total parts, were also superior to the observed in Preciosa and Japira cultivars. After 21 days on rooting medium, the survival rate of the plants in greenhouse reach 100%, in despite of the tested cultivar.

A micropropagação da amoreira-preta pode gerar plantas livres de vírus e em curto espaço de tempo. Com o objetivo de aprimorar técnicas de micropropagação de amoreira-preta cv. Tupy (Rubus spp.), segmentos nodais com cerca 2 cm e 2 gemas axilares, oriundos de plantas pré estabelecidas in vitro, foram excisados e inoculados em meio de cultura MS, suplementado com diferentes concentrações de fosfato de sódio (0, 125, 250, 500 e 1000 mg L-1) e de cloreto de potássio (0, 125, 250, 500 e 1000 mg L-1). O pH foi ajustado para 5,8 antes da adição de 6 g L-1 de ágar e da autoclavagem a 121ºC e 1 atm por 20 minutos. Após a inoculação, os explantes foram transferidos para sala de crescimento a 25 ± 1ºC, irradiância de 35 mmol m-2 s-1 e fotoperíodo de 16 horas, onde permaneceram por 60 dias. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualisado, utilizando-se de quatro repetições constituídas de três tubos de ensaio contendo um explante cada. O número de brotos e o comprimento da parte aérea das plantas foi menor em função de maiores concentrações de cloreto de potássio. Melhores resultados foram obtidos na ausência de KCl e na presença de fosfato de sódio, principalmente para comprimento e matéria fresca da parte aérea.

The micropropagation of blackberry can generate virus-free plants in short time. In order to improve micropropagation techniques of blackberry cv. Tupy (Rubus spp.), nodal segments with 2 cm length and 2 axillary buds originating from plants in vitro were excised and inoculated in MS culture medium, supplemented with different concentrations of sodium phosphate (0, 125, 250, 500 and 1000 mg L-1) and potassium chloride (0, 125, 250, 500 and 1000 mg L-1). The pH was adjusted to 5.8 before the addition of 6 g L-1 agar and sterilization at 121ºC and 1 atm for 20 minutes. After the inoculation, the explants were transferred to growth room at 25 ± 1ºC, 35 mmol m-2 s-1 irradiance and photoperiod of 16 hours, where they stayed for 60 days. The experiment was arranged in a completely randomized design, using four repetitions with 12 plants each. Number of sprouts and length of the aerial part of plants were smaller, due to larger concentrations of potassium chloride. Better results were obtained in the absence of KCl, and in the presence of sodium phosphate, mainly for length and fresh weight of the aerial part.