Abstract: Phospholipases A2 (PLA2) from snake venom are enzymes with highly variety of biological effects, due to their different isoforms and some may be myotoxins. This research aimed was to purify, characterize and evaluate the myotoxic activity of an isoform of acid PLA2 (BaPer-PLA2a). For purification, in DEAE Sephadex-A50, Sephadex-G75 and an automated medium pressure system-NGC were used. BaPer-PLA2a had a specific activity of 34.1 U/ mg and a MW of ~ 14.5 kDa by SDS-PAGE, non-reducing conditions. From venom were obtained total RNA, to synthesis of cDNA and an amplified of ~ 480 bp. A mature protein of 124 amino acids was deduced from the cDNA sequence with a pI (4.41), being an acidic isoform, likewise presented primary structure with conserved regions and residues His48, Asp49 and Tyr52 identified in the catalytic center. Additionally, the structural theoretical model has an identity greater than 70 % with other acidic PLA2. Finally, BaPer-PLA2a did not have myotoxic activity, however, when combined with the basic PLA2 isoform increased the last 's myotoxic activity in 21.58 %.

Resumen: Las fosfolipasas A2 (PLA2) del veneno de las serpientes, son enzimas con una variedad de efectos biológicos, debido a sus diferentes isoformas y algunas pudiendo ser miotoxinas. El objetivo de la investigación fue purificar, caracterizar y evaluar la actividad miotóxica de una isoforma de PLA2 ácida (BaPer-PLA2a). Se purificó por DEAE Sephadex-A50, Sephadex-G75 y un sistema automatizado de presión media-NGC. La BaPer-PLA2a tuvo una actividad específica de 34,1 U/mg y un peso molecular de ~14,5 kDa por PAGE-SDS en condiciones no reductoras. Del veneno se obtuvo el ARN total, para la síntesis de ADNc y un amplificado de ~480 pb. Se dedujo de la secuencia de ADNc una proteína madura de 124 aminoácidos con un punto isoeléctrico (4,41), siendo una isoforma ácida, asimismo presentó una estructura primaria con regiones conservadas y los residuos His48, Asp49 y Tyr52 identificados en el centro catalítico. Adicionalmente, el modelo teórico estructural posee una identidad mayor al 70 % con otras PLA2 ácidas. Finalmente, la BaPer-PLA2a no presenta actividad miotóxica, sin embargo, al combinarla con la isoforma de PLA2 básica incrementó la actividad miotoxina de esta última en 21,58 %.

The hyaluronidase from Bothrops atrox venom was purified and characterized. The effect of monovalent and divalent ions on their catalytic activity was studied, showing that the magnesium ion (150 mM) increases de activity in 40%, while glycine inhibits it by 44 %. The enzyme lacks toxic activity, when administered in albino mice in toxicity tests, but increases the hemorrhagic action of the total venom on the skin of these animals. The polyvalent botropic antivenom, was able to recognize components of the total venom of B. atrox, as well as the purified enzyme, in immunodiffusion assays. The cDNA coding for hyaluronidase from the venom of B. atrox was obtained from mRNA extracted of the fresh venom, and sequenced. The analysis of the cDNA, of 2020 bp, shows that it contains an ORF of 1350 bp that codes for a pre-enzyme of 449 amino acids, which probably is processing resulting in a mature enzyme of 429 amino acids, Molecular Weight of 50 kDa and pI 9.19, indicating its basic nature, and with 4 probable N-glycosylation sites (Asn103, Asn111, Asn153 and Asn357).

La hialuronidasa del veneno de Bothrops atrox fue purificada y caracterizada. Se estudió el efecto de iones monovalentes y divalentes en su actividad catalítica, mostrando que el ion magnesio (150 mM) incrementa la actividad en 40 %, mientras que la glicina lo inhibe en un 44 %. La enzima carece de actividad tóxica cuando es administrada en ratones albinos en ensayos de toxicidad, pero incrementa la acción hemorrágica del veneno total sobre la piel de estos animales. El antiveneno botrópico polivalente, Perú) fue capaz de reconocer componentes del veneno total de B. atrox, así como la enzima purificada, en ensayos de inmunodifusión. El cDNA que codifica para esta hialuronidasa se obtuvo a partir de mRNA extraído del veneno fresco, y secuenciado. El análisis de la secuencia de cDNA, de 2020 pb, muestra que contiene un ORF de 1350 pb que codifica para una pre-enzima de 449 aminoácidos, cuyo procesamiento, posiblemente, resulta en una enzima madura de 429 aminoácidos, masa molecular 50 kDa y pI de 9,19, indicando su naturaleza básica, y con 4 probables sitios de N-glicosilación (Asn103, Asn111, Asn153 y Asn357).

Venous thromboembolism represents a prominent cause of maternal morbidity and mortality with an incidence of 0.5 to 2.2 out of 1 000 pregnancies. Pregnant patients have 5 times increased risk compared with non-pregnant women; it is the second cause of death in this population. We present the case of a 27-year-old pregnant woman with 11 weeks of gestation with no significant history who was admitted to the Emergency Department due to 24 hours of pain, increased volume of the lower limb and slight functional impotence for walking. Venous Doppler ultrasound of the lower limbs revealed deep vein thrombosis of the left lower limb. The diagnosis and management of deep vein thrombosis during pregnancy and the need for timely recognition are discussed.

El tromboembolismo venoso representa una causa importante de morbimortalidad materna con incidencia de 0,5 a 2,2 de 1 000 embarazos. Las mujeres embarazadas presentan un riesgo incrementado en 5 veces respecto de las no embarazadas, siendo la segunda causa de muerte en dicha población. Presentamos el caso de una paciente mujer de 27 años, gestante de 11 semanas, sin antecedentes de importancia, quien ingresó a Emergencia por presentar 24 horas dolor e incremento de volumen de extremidad inferior, además de impotencia funcional a la marcha. Se realizó ecografía Doppler venosa de extremidades inferiores, encontrándose trombosis venosa profunda de miembro inferior izquierdo. Se discute el diagnóstico y manejo de la trombosis venosa profunda durante la gestación, la necesidad del reconocimiento oportuno que puede no ser clara.

A coagulant enzyme from Bothrops brazili snake venom called thrombin-like enzyme was purified by three successive chromatographic steps on Sephadex G-75, DEAE Sephadex A-50 and Sephadex G-50 using 0.05M Tris-HCl buffer pH 8.5. The enzyme was purified 15.9 times with a yield of 28.6% and by PAGE-SDS a single protein band of 48 kDa was obtained both in reducing and non-reducing conditions using 2β-Mercaptoethano., It is a unicatenary protein with coagulant activity on both citrated human plasma and bovine fibrinogen. The enzyme showed amidolytic activity on the chromogenic substrate Benzoyl-Arginyl-p- Nitroaniline (BApNA) and the coagulant potency on bovine fibrinogen was calculated on 121 NIH units of thrombin / mg. The enzyme was inhibited by PMSF and the soybean trypsin inhibitor, therefore, it is a serine protease; the optimum pH for the amidolytic activity was 8.5 and the protein was stable to heat treatment only up to 40 °C. The minimal defibrinogenating dose was 8 μg / g of mouse and by double immunodiffusion tests immunoreactivity was observed with respect to INS polyvalent antibothropic serum

Se ha purificado una enzima coagulante del veneno de la serpiente Bothrops brazili denominada enzima similar a trombina (TLE) mediante tres pasos cromatográficos sucesivos sobre Sephadex G-75, DEAE Sephadex A-50 y Sephadex G-50, empleando buffer Tris-HCl 0,05 M pH 8,5. La enzima fue purificada 15,9 veces con un rendimiento del 28,6 % y por PAGE-SDS se obtuvo una sola banda proteica de 48 kDa, tanto en condiciones reductoras como no reductoras usando 2β-Mercaptoetanol. Se trata de una proteína con actividad coagulante, tanto sobre plasma humano citratado como sobre fibrinógeno bovino. La enzima mostró actividad amidolítica sobre el sustrato cromogénico Benzoil-Arginil-p-Nitroanilina (BApNA) y la potencia coagulante sobre el fibrinógeno bovino fue calculada en 121 unidades NIH de trombina/mg. La enzima fue inhibida por PMSF y por el inhibidor de tripsina de soya, por lo que se trata de una serinoproteasa; el pH óptimo para la actividad amidolítica fue de 8,5 y la proteína fue estable al tratamiento térmico solo hasta los 40 ºC. La dosis defibrinogenante mínima fue 8 μg/g de ratón y mediante pruebas de inmunodifusión doble se observó inmunorreactividad con respecto al suero antibotrópico polivalente del INS

Two proteases from the glandular venom of Loxosceles laeta spider were isolated using a column of Sephadex G-100 gel molecular filtration equilibrated with 0,05M ammonium acetate buffer pH 5,0. One of them is a metalloprotease inhibited by 5 mM EDTA (60,5%) and the other is a serinoprotease inhibited by 5 mM PMSF (93,3%). The metalloproteinase had activity on casein and dimethylcasein while the serinoprotease had activity on citrated human plasma. They showed different molecular weights by PAGE-SDS: 35 kDa and 15,9 kDa. In addition both were antigenic against commercial loxoscelic antivenom by immunodifusion assays.

A partir del veneno glandular de la araña casera Loxosceles laeta, se han aislado dos proteasas, una inespecífica con actividad sobre caseína y dimetilcaseína mientras que la otra es una proteasa con actividad procoagulante sobre plasma humano citratado. Para ello, se utilizó una columna de filtración molecular sobre Sephadex G-100, equilibrada con buffer acetato de amonio 0,05M pH 5,0, determinándose el contenido proteico por absorbancia a 280 nm y las respectivas actividades en cada fracción. También se midieron las actividades enzimáticas de: hialuronidasa, fosfolipasa A2, amidolítica, y la actividad hemorrágica. El análisis electroforético por PAGE-SDS determinó que la enzima proteolítica tiene un peso molecular de 35 kDa en tanto que la fracción procoagulante registró un peso molecular de 15,9 kDa. La actividad proteolítica fue inhibida por EDTA 5 mM en un 60,5% mientras que la fracción procoagulante fue inhibida por PMSF 5mM en un 93,3%. Por tanto, tales enzimas corresponden a una metaloproteasa y a una serinoproteasa, respectivamente. Por ensayos de inmunodifusión doble, ambas proteínas mostraron reactividad inmunogénica frente al antiveneno loxoscélico comercial.

A hemorrhagin with metalloprotease activity was purified from the venom of Bothrops pictus snake using Sephadex G-75 molecular gel filtration and DEAE A-50 ionic exchange column. Thus a homogeneus protein entity was obtained with 62 kDa under non reducting conditions. Hemorrhagin is a acid protein, attack both casein and collagen being 0,226 μg as a DHM. Chelating agent such as EDTA as well as 2 ß-mercaptoetanol and DTT produced strong inhibition both caseinolitic and hemorrhagic activities. Optimus pH was 7,5 and heating treatment reduced both activities, At 55 °C recovered activity on casein was 30,4%. On the other hand hemorrhagin is an antigenic entity showed on double immunodiffusion test and was neutralizated fulling with 0,5, 1 and 2 doses of antivenom.

A partir de veneno total de la serpiente Bothrops pictus se ha purificado una hemorragina con actividad de metaloproteasa, usando una columna de filtración molecular sobre Sephadex G-75 y otra de intercambio aniónico sobre DEAE Sephadex A-50, equilibradas con buffer acetato de amonio 0,1M pH 5. La proteína en estudio fue obtenida al estado homogéneo con un peso molecular de 62 kDa y es de naturaleza ácida, ataca tanto a la caseína como a la gelatina y es inhibida por EDTA, 2 β-mercaptoetanol y DTT. La dosis hemorrágica mínima (DHM) de la proteína purificada fue de 0,226 μg y esta actividad fue reducida por los mismos agentes. Su pH óptimo es de 7,5 y su estabilidad térmica le permite mantener el 30,4% de su actividad luego del calentamiento a 55 °C. La hemorragina de B. pictus reacciona con el antiveneno botrópico polivalente, generando líneas de precipitina en pruebas de inmunodifusión doble y es neutralizada por el antiveneno usando 0,5, 1 y 2 dosis.

Objectives. To perform a biochemical and molecular characterization of the coagulant principle from Bothrops pictus venom. Materials and methods. We amplified the genetic sequence of this enzyme from cDNA and analyzed the homology of its nucleotide sequence and its deduced protein. This enzyme was also purified for N-terminal sequencing of first 20 amino acids and for coagulation assays using human plasma and human fibrinogen. Furthermore, cleavage pattern on fibrinogen was evaluated using SDS-PAGE and defibrinogenant activity on white mice (18-22 g). Finally, associated carbohydrate content, effect of protease inhibitors and chloride ions on its enzymatic activity were analyzed. Results. The Thrombin-like Enzyme from Bothrops pictus showed homology at primary level of structure with other previously reported TLEs from Viperidae family. Minimum Coagulant Dosis (MCD) on plasma and human fibrinogen were 18 and 6 µg, respectively, and its coagulant potency was 131.1 NHI Thrombin units. This TLE was stable under physiological conditions and chloride ions are not necessary for its activity. Detected associated carbohydrates were hexoses (25.76%), hexosamines (13.12%) and sialic acid (0.76%). Phenyl methyl sulphonyl fluoride (PMSF) and dithiothreitol (DTT) were the main inhibitors of its enzymatic activity, but heparin had no inhibitor effect. Conclusions. The coagulant principle of Bothrops pictus venom is a Thrombin-like enzyme

Objetivos. Realizar una caracterización bioquímica y molecular del principio coagulante del veneno de Bothrops pictus. Materiales y métodos. Se realizó la amplificación del gen a partir de cDNA, se analizó la homología de la secuencia nucleotídica y de la proteína deducida. Se procedió a purificar la enzima para los análisis de secuenciación directa N terminal de los primeros 20 aminoácidos y los ensayos de coagulación sobre plasma humano y fibrinógeno humano, por otro lado, se evaluó el patrón de corte del fibrinógeno por medio de PAGE SDS y la actividad defibrinogenante en roedores albinos (18-22 g). Se determinó el contenido de carbohidratos asociados, el efecto de inhibidores clásicos de proteasas y el efecto de iones bajo la forma de cloruros. Resultados. La enzima mostró homología en la estructura primaria con otras TLEs reportadas para la familia Viperidae, la dosis coagulante mínima (DCM) sobre plasma y fibrinógeno humano fue de 18 y 6 µg respectivamente y su potencia coagulante fue de 131,1 NHI unidades de trombina. La enzima se mostró estable a condiciones fisiológicas y prescinde de iones para su actividad. Los carbohidratos asociados detectados fueron hexosas (25,76%), hexosaminas (13,1%) y ácido siálico (0,76%). Los agentes fluoruro de fenil metil sulfonil floruro (PMSF) ditiotreitol (DTT) fueron los principales inhibidores de la actividad enzimática en tanto que la heparina no tuvo efecto inhibidor. Conclusiones. El principio coagulante del veneno de Bothrops pictus es una enzima similar a trombina

Objectives. To perform a biochemical and molecular characterization of the coagulant principle from Bothrops pictus venom. Materials and methods. We amplified the genetic sequence of this enzyme from cDNA and analyzed the homology of its nucleotide sequence and its deduced protein. This enzyme was also purified for N-terminal sequencing of first 20 amino acids and for coagulation assays using human plasma and human fibrinogen. Furthermore, cleavage pattern on fibrinogen was evaluated using SDS-PAGE and defibrinogenant activity on white mice (18-22 g). Finally, associated carbohydrate content, effect of protease inhibitors and chloride ions on its enzymatic activity were analyzed. Results. The Thrombin-like Enzyme from Bothrops pictus showed homology at primary level of structure with other previously reported TLEs from Viperidae family. Minimum Coagulant Dosis (MCD) on plasma and human fibrinogen were 18 and 6 µg, respectively, and its coagulant potency was 131.1 NHI Thrombin units. This TLE was stable under physiological conditions and chloride ions are not necessary for its activity. Detected associated carbohydrates were hexoses (25.76%), hexosamines (13.12%) and sialic acid (0.76%). Phenyl methyl sulphonyl fluoride (PMSF) and dithiothreitol (DTT) were the main inhibitors of its enzymatic activity, but heparin had no inhibitor effect. Conclusions. The coagulant principle of Bothrops pictus venom is a Thrombin-like enzyme

Objetivos. Realizar una caracterización bioquímica y molecular del principio coagulante del veneno de Bothrops pictus. Materiales y métodos. Se realizó la amplificación del gen a partir de cDNA, se analizó la homología de la secuencia nucleotídica y de la proteína deducida. Se procedió a purificar la enzima para los análisis de secuenciación directa N terminal de los primeros 20 aminoácidos y los ensayos de coagulación sobre plasma humano y fibrinógeno humano, por otro lado, se evaluó el patrón de corte del fibrinógeno por medio de PAGE SDS y la actividad defibrinogenante en roedores albinos (18-22 g). Se determinó el contenido de carbohidratos asociados, el efecto de inhibidores clásicos de proteasas y el efecto de iones bajo la forma de cloruros. Resultados. La enzima mostró homología en la estructura primaria con otras TLEs reportadas para la familia Viperidae, la dosis coagulante mínima (DCM) sobre plasma y fibrinógeno humano fue de 18 y 6 µg respectivamente y su potencia coagulante fue de 131,1 NHI unidades de trombina. La enzima se mostró estable a condiciones fisiológicas y prescinde de iones para su actividad. Los carbohidratos asociados detectados fueron hexosas (25,76%), hexosaminas (13,1%) y ácido siálico (0,76%). Los agentes fluoruro de fenil metil sulfonil floruro (PMSF) ditiotreitol (DTT) fueron los principales inhibidores de la actividad enzimática en tanto que la heparina no tuvo efecto inhibidor. Conclusiones. El principio coagulante del veneno de Bothrops pictus es una enzima similar a trombina

In the venom of the snake Bothrops brazili was found a protein with hyaluronidase activity. The purification was performed by two chromatographic steps using SephadexG-75 and DEAE SephadexA-50 columns equilibrated with ammonium acetate buffer 0.1M, pH 5. The purification obtained was 33 fold with 54.5% of yield and a recovery of active protein was equivalent to 1.66%. This enzyme was a basic protein with a molecular weight of 110kDa and an optimum pH of 5,5. The enzymatic activity at 20 °C was maintained at 50% after 72 hours and was completely inactivated at 192 hours. Furthermore, the enzymatic activity was increased by 38.9% by the addition of magnesium ions (150mM). The diffusing capacity of the protein was demonstrated by increased hemorrhagic activity caused in mice when added to the purified enzyme. Toxicity assays in mice and enzyme- antivenoms assays indicated that hyaluronidase was not toxic and was completely inhibited by both polyvalent bothropic as monovalent lachesic antivenoms (INS-Perú).

En el veneno de la serpiente Bothrops brazili se ha encontrado una proteína con actividad hialuronidasa. La purificación se realizó en dos pasos cromatográficos utilizando columnas de Sephadex G-75 y DEAE Sephadex A-50 equilibradas con buffer acetato de amonio 0,1 M, pH 5. Se obtuvo una purificación de 33 veces con un rendimiento de 54,5 % y una recuperación de proteína activa equivalente a 1,66 %. Esta enzima es una proteína básica con un peso molecular de 110 kDa y un pH óptimo de 5,5. La actividad enzimática a 20 °C se mantuvo en un 50% después de 72 horas y fue completamente inactivada a las 192 horas. Asimismo, la actividad enzimática se incrementó un 38,9 % por la adición de iones magnesio (150 mM). La capacidad difusora de esta proteína se demostró mediante el incremento de la actividad hemorrágica causada en ratones al adicionarse la enzima purificada. Los ensayos de toxicidad en ratones y las pruebas enzima -antivenenos, indicaron que la hialuronidasa carece de toxicidad y es inhibida totalmente por los antivenenos botrópico y lachésico (INS-Perú).

A protein of high molecular weight was purified from the venom of Bothrops atrox Peruvian snake, using DEAE Sephadex A-50 anion exchange chromatography and Sephadex G-50 gel molecular filtration, with 0,05M ammonium acetate, pH 5.0. It showed hyaluronidase activity, and was obtained until homogeneous state with a 145-fold, 72% of yield and a 0.5% of recovery of active protein. The enzyme showed a molecular weight of 110 kDa by SDS- PAGE under reducing and non reducing conditions. The stability assays indicated that hyaluronidase lost 60% of its activity after 150 hours at pH 5.0 and it was quickly inactivated by heat treatment above 40 ºC. The optimum pH was 6.0 using hyaluronic acid and some inhibitors such as TLCK, iodoacetate and dexamethasone (5 mM), caused 60, 40 and 75% of inactivation, respectively. On the other hand, this enzyme is capable to increase hemolysis into agar plates. Furthermore, treatment of the enzyme with human blood-serum, as well as lachesic and bothropic commercial antivenoms produced a strong inhibition; also, IgY experimental antivenom revealed high inhibition of this enzyme.

Se ha purificado un componente proteico de alto peso molecular del veneno de la serpiente peruana B. atrox, usando una cromatografía de intercambio aniónico sobre DEAE Sephadex A-50 y una filtración molecular sobre Sephadex G-50, utilizando en ambos casos buffer acetato de amonio 0,05M pH 5,0. El análisis enzimático mostró que se trata de una proteína con actividad de hialuronidasa la cual fue purificada 145 veces con un rendimiento de 72% y una recuperación de proteína activa de 0,5%. La enzima registró un peso molecular de 110 kDa por PAGE-SDS, en condiciones reductoras y no reductoras. Los ensayos de estabilidad indicaron que la hialuronidasa perdió el 60% de su actividad después de 150 horas a pH 5,0 y fue rápidamente inactivada por tratamiento térmico mayor a 40 °C. El pH óptimo de la enzima fue de 6 y la proteína sólo mostró actividad sobre ácido hialurónico y no sobre condroitin sulfato. Los ensayos con inhibidores, tales como TLCK, yodoacetato y dexametasona 5mM, produjeron pérdida de la actividad equivalentes a 60, 40 y 75%, respectivamente, en tanto que el tratamiento con suero sanguíneo humano la inactivó totalmente. Asímismo, las pruebas en placa de hemólisis conteniendo ácido hialurónico mostraron que la enzima es capaz de incrementar el área hemolítica. Adicionalmente, la preincubación de la enzima con los antivenenos comerciales lachésico y botrópico, así como el antiveneno experimental botrópico IgY, revelaron una elevada capacidad inhibitoria de tales antivenenos.

A neutralizing study against Bothrops atrox venom was carried aout using different preparations from amazonic plants referred as antiofidic properties. Mixture of plants heated and non heated in distillate water were assayed in order to neutralize toxicity from the venom using mice to calculated LD50 and some enzymatic activities. The protein content into the venom was 76,4%, showed 8 and 9 protein bands by SDS-PAGE in non reducting and reducting conditions being the range of molecular weights: 56-12 kDa and 73-15 kDa. Some enzymatic activities are present in this venom: L- amino acid oxidase, phospholipase A2, coagulant and proteolytic actions, being its LD50 3,38 µg/g mouse. Heated extract from Dracontium sp. (MC 5990), Philodendro ernestii (MC 6807) and Philodendron sp. (MC 5984) are capable to blocked 3LD50 until 48 hours. Other extracts by infusion Cordianodosa (MC 6810) and Philodendro ernestii (MC 6807) were neutralizing action against the venom too.

Se ha realizado un estudio de neutralización con extractos vegetales de la Amazonía peruana contra el veneno de la serpiente Bothrops atrox "jergón". Para ello, se preparó extractos acuosos: hervidos, sin hervir e infusión de diez especies de plantas y con ellos se realizó pruebas de destoxificación del veneno empleando ratones albinos, haciéndose en paralelo el análisis bioquímico del veneno y calculándose su toxicidad. El veneno de B. atrox tuvo un porcentaje de proteína de 76,4%, mostrando 8 y 9 bandas electroforéticas en condiciones no reductoras y reductoras, respectivamente, con un rango de pesos moleculares de 56-12 kDa y 73-15 kDa. El análisis enzimático mostró la presencia de L-aminoácido oxidasa, fosfolipasa A2 y actividades proteolítica y coagulante. La toxicidad (DL50) fue de 3,38 µg/g de ratón. Los ensayos extracto acuoso sin hervir-veneno no neutralizan la toxicidad de la ponzoña; en cambio, los extractos hervidos de Dracontium sp. (MC 5990), Philodendro ernestii (MC 6807) y Philodendron sp. (MC 5984) fueron capaces de neutralizar una cantidad equivalente a 3DL50 del veneno. Por otro lado, los extractos obtenidos por infusión de Cordia nodosa (MC 6810) y Philodendro ernestii (MC 6807) fueron los únicos que tuvieron acción neutralizante contra el veneno en estudio.

A lectin type C was purified and researching its biochemical properties from the venom of Lachesis muta Peruvian snake. Purification was performed through a unic chromatographic step using a DEAE-Sephadex A-50 column, equilibrated with 0,1 M ammonium acetate pH 5 buffer. A lectin was recognized for its capacity in vitro to agglutinating human red cells. This protein was purified 3,6 folds and it represents 3,5 % of the total protein into the venom. It had 27,5 kDa and 14,3 kDa of molecular weight in non reduction and reduction conditions, respectively, using a PAGE-SDS analysis. It was strongly inhibited by the lactose (1,56 mM) followed by galactose, arabinose, sacarose and glucose. While maltose, mannose and fructose were not inhibitors. Hemagglutinating activity was inhibited by EDTA, DTT and ME too using different concentrations. However inhibition produced by EDTA (0,125-0,5 mM) was abolished by Ca+2, Mg+2 and Mn+2 ions. These results showed that this purified protein is a lectin type C, with a potent hemagglutinin activity.

A partir del veneno de la serpiente Lachesis muta, que habita en la amazonía peruana, se purificó y determinó las propiedades bioquímicas de una proteína no enzimática denominada lectina Tipo C. La purificación se logró a través de un único paso cromatográfico utilizando una columna de DEAE-Sephadex A-50 equilibrada con buffer acetato de amonio 0,1 M pH 5. La lectina fue reconocida debido a su capacidad para aglutinar glóbulos rojos humanos in vitro; por lo que se trata de una hemoaglutinina. La proteína en estudio fue purificada 3,6 veces y representó el 3,5 % del contenido proteico total del veneno. El análisis por PAGE-SDS, demostró que la lectina se encontraba al estado homogéneo con una masa molecular de 27, 5 kDa y 14,3 kDa en su forma reducida. La lectina fue inhibida en su actividad por la lactosa (1,56 mM), seguida de galactosa, arabinosa, sacarosa y glucosa. En cambio, no se registró inhibición con maltosa, manosa y fructosa. La capacidad hemoaglutinante de la lectina también fue inhibida por EDTA, seguida de DTT y 2-mercaptoetanol a distintas concentraciones; la inhibición causada por EDTA (0,125 - 0,5 mM), fue anulada por los iones Ca+2, Mg+2 y Mn+2. Los resultados indican que la proteína purificada es una lectina tipo C, la cual es una potente hemoaglutinina.

Objectives. To study the variability in the composition and enzymatic activity of venom from adult Bothrops atrox specimens. Materials and methods. We used venoms from adult snakes from Amazonas, Junín and Ucayali. Each of the venom samples underwent analysis for protein and number of bands by pagesds. Phospholipase A2, hemolytic, amidolytic, coagulant, hemorrhagic activity were analyzed, also and proteolytic activity on casein and by zymogram. Additionally, immunodiffusion and neutralization assays in vitro were done with a polyvalent botropic serum from the national institute of health of Peru. Results. The amidolytic, coagulant, hemorrhagic, proteolytic by zymogram, phospholipase A2, and indirect hemolytic activity were variable, demonstrating increased activity in the venoms from Amazonas, regarding proteolytic by zymogram, phospholipase A2, and indirect hemolytic activity. While the amount of protein electrophoretic bands and proteolytic activity on casein did not demonstrated differences. Regarding neutralization tests, a 0.5 dose of antivenom was sufficient to effectively neutralize (>50%) the coagulant activity and phospholipase A2 of all samples analyzed. Conclusions. Some biological properties of the venom from adult Bothrops atrox of Peru are variable, without interference with the in vitro neutralization by the polyvalent botropic serum on coagulant and phospholipase A2 properties of the venom.

Objetivos. Estudiar la variabilidad en la composición y actividades enzimáticas entre venenos de ejemplares adultos de Bothrops atrox. Materiales y métodos. Se emplearon venenos de serpientes adultas procedentes de Amazonas, Junín y Ucayali. A cada una de las muestras se les realizó el análisis del contenido proteico y del número de bandas por PAGESDS, así como las actividades de fosfolipasa A2, hemolítica indirecta, amidolítica, coagulante, hemorrágica y proteolítica sobre caseína y mediante zimograma; además, se hicieron ensayos de inmunodifusión y neutralización in vitro con el suero antibotrópico polivalente del Instituto Nacional de Salud de Perú. Resultados. Las actividades amidolítica, coagulante, hemorrágica, proteolítica mediante zimograma, fosfolipasa A2 y hemolítica indirecta fueron variables, evidenciándose en las tres últimas una mayor actividad en los venenos de Amazonas, mientras que en la cantidad de proteína, bandas electroforéticas y actividad proteolítica sobre caseína no se observaron diferencias. Con respecto a las pruebas de neutralización, 0,5 dosis del antiveneno fueron suficientes para neutralizar con eficacia (más del 50%) la actividad coagulante y fosfolipasa A2 de todas las muestras analizadas. Conclusiones. Algunas propiedades biológicas del veneno de ejemplares adultos de Bothrops atrox de Perú son variables, sin que ello afecte la neutralización in vitro por parte del suero antibotrópico polivalente sobre las actividades coagulante y fosfolipasa A2 del veneno.

Objectives. To study the variability in the composition and enzymatic activity of venom from adult Bothrops atrox specimens. Materials and methods. We used venoms from adult snakes from Amazonas, Junín and Ucayali. Each of the venom samples underwent analysis for protein and number of bands by pagesds. Phospholipase A2, hemolytic, amidolytic, coagulant, hemorrhagic activity were analyzed, also and proteolytic activity on casein and by zymogram. Additionally, immunodiffusion and neutralization assays in vitro were done with a polyvalent botropic serum from the national institute of health of Peru. Results. The amidolytic, coagulant, hemorrhagic, proteolytic by zymogram, phospholipase A2, and indirect hemolytic activity were variable, demonstrating increased activity in the venoms from Amazonas, regarding proteolytic by zymogram, phospholipase A2, and indirect hemolytic activity. While the amount of protein electrophoretic bands and proteolytic activity on casein did not demonstrated differences. Regarding neutralization tests, a 0.5 dose of antivenom was sufficient to effectively neutralize (>50%) the coagulant activity and phospholipase A2 of all samples analyzed. Conclusions. Some biological properties of the venom from adult Bothrops atrox of Peru are variable, without interference with the in vitro neutralization by the polyvalent botropic serum on coagulant and phospholipase A2 properties of the venom

Objetivos. Estudiar la variabilidad en la composición y actividades enzimáticas entre venenos de ejemplares adultos de Bothrops atrox. Materiales y métodos. Se emplearon venenos de serpientes adultas procedentes de Amazonas, Junín y Ucayali. A cada una de las muestras se les realizó el análisis del contenido proteico y del número de bandas por PAGESDS, así como las actividades de fosfolipasa A2, hemolítica indirecta, amidolítica, coagulante, hemorrágica y proteolítica sobre caseína y mediante zimograma; además, se hicieron ensayos de inmunodifusión y neutralización in vitro con el suero antibotrópico polivalente del Instituto Nacional de Salud de Perú. Resultados. Las actividades amidolítica, coagulante, hemorrágica, proteolítica mediante zimograma, fosfolipasa A2 y hemolítica indirecta fueron variables, evidenciándose en las tres últimas una mayor actividad en los venenos de Amazonas, mientras que en la cantidad de proteína, bandas electroforéticas y actividad proteolítica sobre caseína no se observaron diferencias. Con respecto a las pruebas de neutralización, 0,5 dosis del antiveneno fueron suficientes para neutralizar con eficacia (más del 50%) la actividad coagulante y fosfolipasa A2 de todas las muestras analizadas. Conclusiones. Algunas propiedades biológicas del veneno de ejemplares adultos de Bothrops atrox de Perú son variables, sin que ello afecte la neutralización in vitro por parte del suero antibotrópico polivalente sobre las actividades coagulante y fosfolipasa A2 del veneno

Objectives. To develop an immunization protocol in order to produce avian IgY immunoglobulins against Bothrops atrox Peruvian snake venom and to evaluate its neutralizing capacity. Materials and methods. Six Hy Line Brown hens were immunized each two weeks using 500μg/doses of B. atrox venom in a period of two months. Each week, eggs were collected for IgY isolation from yolk using two consecutive steps with caprilic acid and ammonium sulfate. Detection of IgY anti-B. atrox were performed by double immunodiffusion, whereas title and cross-reactivity were analyzed using ELISA and Western Blot technics, respectively. Furthermore, letal dose (DL50) and Medium Effective Dose (DE50) were obtained by Probit analysis. Results. As a result of this protocol, chicken IgY’s were obtained in a concentration of 8,5 ± 1,35 mg/yolk mL. DE50 from avian antivenom was 575 μL/venom mg. Cross-reactivity studies showed Bothrops atrox venom share more commom epitopes with Bothrops brazili (47%) than others Bothrops venoms showing Lachesis muta (19%) and Crotalus durissus (12%) venoms a low crossing reactivity, instead. Conclusions. Using this procedure, we could purify chicken IgY with a neutralizant capacity of B. atrox venom which is comparable to the antivenom of equine origin and demonstrate its capacity as a immunoanalitical tool to evaluate the cross reactivity with others peruvian snakes.

Objetivos. Desarrollar un protocolo de inmunización para producir inmunoglobulinas IgY de origen aviar contra el veneno de la serpiente peruana Bothrops atrox y evaluar la capacidad neutralizante. Materiales y métodos. Se inmunizaron seis gallinas de postura de la raza hy line brown con 500 μg/dosis de veneno de B. atrox en un periodo de dos meses. Cada semana, los huevos fueron colectados para el aislamiento de inmunoglobulinas IgY a partir de la yema, usando dos pasos consecutivos con αcido caprνlico y sulfato de amonio. La detecciσn de anticuerpos se realizσ por inmunodifusiσn doble mientras que el tνtulo y reactividad cruzada se determinaron por las técnicas de ELISA y Western blot. El cálculo de DL50 y de la DE50 del antiveneno IgY producido se realizó utilizando el método de Probits. Resultados. La masa de anticuerpos aislados fue de 8,5 ± 1,35 mg de IgY/mL de yema. Asimismo, la DE50 del antiveneno aviar fue calculada en 575 μL de antiveneno/mg de veneno. Adicionalmente, los ensayos de reactividad cruzada mostraron que el veneno de B. atrox comparte mas epνtopes comunes con el veneno de B. brazili (47%) que con otros veneno del mismo género, en tanto que los venenos de Lachesis muta (19%) y Crotalus durissus (12%) mostraron una baja reactividad cruzada. Conclusiones. Se ha obtenido IgY purificada contra el veneno de B. atrox con capacidad neutralizante y se ha demostrado su utilidad como herramienta inmunoanalítica para evaluar la reactividad cruzada con venenos de otras especies.