RESUMO Os objetivos deste trabalho foram avaliar diferentes meios de cultura na organogênese indireta e na multiplicação in vitro de brotos de Eucalyptus benthamii x Eucalyptus dunnii. Para organogênese, explantes foliares foram excisados no sentido transversal e cultivados in vitro, sendo os seguintes fatores testados: dois meios de cultura (MS N/2 e JADS) adicionados de 0,1 µM de ANA, duas concentrações de thidiazuron (0,1 e 0,5 μM) e presença ou não de PVP-40 (250 mg L-1). Após 70 dias de cultivo foram avaliadas as porcentagens de explantes oxidados totalmente, formando calo, produzindo antocianina, formando gema, formando brotações e o número de brotações formadas por explante regenerando. No experimento de multiplicação, brotações isoladas foram cultivadas em meio MS, JADS e WPM, adicionados de 1,11 μM de BAP. Foram realizados quatro subcultivos a cada 28 dias e em cada subcultivo foram avaliados: a porcentagem de oxidação, de explantes apresentando clorose total ou parcial, massa fresca e número médio de brotos por explante. O meio de cultura MS N/2 suplementado com 0,1 µM de ANA, 0,5 µM de TDZ e PVP-40 promoveu a maior taxa de organogênese (8,3%). No meio de cultura MS com 1,11 μM de BAP, a taxa de multiplicação foi maior que nos outros meios, no primeiro e segundo subcultivos (9,28 e 9,24 por mês), não havendo diferença entre os três meios nos demais subcultivos.

ABSTRACT The aims of this research were to evaluate different culture media for indirect organogenesis and shoot multiplication of Eucalyptus benthamii x Eucalyptus dunnii. For organogenesis, leaf explants were used to test the following treatments: two culture media (MS N/2 and JADS) supplemented with 0.1 µM 1-naphthaleneacetic acid (NAA) and thidiazuron (TDZ) (0.1 or 0.5 μM), with or without PVP- 40 (250 mg L-1). The percentage of oxidized explants, callus forming explants, explants with anthocyanin, buds, shoots and the shoot number per explant were evaluated. In the multiplication experiment, isolated shoots were cultivated in MS, JADS and WPM media, all supplemented with 1.11 μM BAP. Four subcultures were carried out every 28 days. In every subculture the explant oxidation, partial or total leaf chlorosis, fresh mass and mean number of shoot per explant were evaluated. The MS N/2 medium supplemented with 0.1 µM NAA and 0.5 µM TDZ promoted the highest rate of organogenesis (8.3%) and the culture media MS supplemented with 1.11 μM BAP the multiplication rate was higher than in the other media, in the first and the second subcultures (9.28 and 9.24, respectively), without differences between the three media in the following subcultures.

O desenvolvimento de um protocolo eficiente em um sistema de regeneração é crucial para a transformação genética de cana-de-açúcar. Os objetivos deste estudo foram a regeneração de plantas a partir de embriões somáticos e a análise da origem e modelos de divisão celular durante os diferentes estágios dos embriões somáticos, das cultivares de cana-de-açúcar RB855156 e RB72454. Em ambas as cultivares, os melhores resultados para a indução de calos embriogênicos foram obtidos com o cultivo dos explantes em meio de cultura contendo 13,5 µM de 2,4- ácido-diclorofenoxiacético (2,4-D), seguido do cultivo dos calos em meio de cultura sólido com 4,5 µM de 2,4-D. As maiores taxas de indução de brotações foram encontradas com 8,9 de 17,8 µM benzilaminopurina (BAP) para RB855156 e 17,8 µM BAP para RB72454. O meio de Murashige and Skoog (1962) (MS) com 2,5 µM de ácido indolbutírico (IBA) para RB855156 e 5,0 µM IBA para RB72454 foram adequados para o enraizamento das brotações. As mudas foram aclimatizadas com sucesso e a taxa de sobrevivência foi de 100% para ambas as cultivares. As análises histológicas revelaram que a origem das brotações em ambas as cultivares ocorreu via embriogênese somática.

The development of an efficient regeneration system is crucial for the genetic transformation of sugarcane. The aims of this study were to regenerate plants from somatic embryos and analyze the origin and division pattern of cells during the different embryonic developmental stages of the sugarcane cultivars RB855156 and RB72454. For both cultivars, the best results for embryogenic callus induction were obtained with explant cultures on culture medium containing 13.5 µM 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) followed by callus culture on solid medium with 4.5 µM 2,4-D. A higher rate of shoot induction was observed in RB855156 with the addition of 8.9 and 17.8 µM benzylaminopurine (BAP); this higher rate was also observed in RB72454 with the addition of 17.8 µM BAP. Murashige and Skoog (1962) (MS) medium containing 2.5 and 5.0 µM indolebutyric acid (IBA) for RB855156 and RB72454, respectively, was suitable for rooting. The plantlets were successfully acclimatized and the plant survival rate was 100% for both cultivars. Histological analysis revealed that the shoots in both cultivars originated from somatic embryogenesis.

Os objetivos deste estudo foram estabelecer condições apropriadas para a obtenção de regeneração de plantas e aclimatização das cultivares 'RB92579' e 'RB93509' de cana-de-açúcar e elucidar a origem das brotações através da análise histológica. Em ambas as cultivares, as brotações obtidas apresentaram os melhores resultados com a cultura dos explantes em um meio de indução de calo contendo 2,0mg L-1 de ácido 2,4-diclorofenoxiacético, seguido do cultivo em meio indutor de brotações, contendo 0,1mg L-1 de cinetina e 0,2mg L-1 benzilaminopurina. O meio MS sem reguladores de crescimento foi adequado para o alongamento e enraizamento das brotações e da utilização do substrato composto de vermiculite + sais do meio MS, foi eficaz para a aclimatização. A análise histológica revelou que a origem das brotações em ambas as cultivares ocorreu via organogênese indireta.

The objectives of this study were to establish appropriate conditions for obtaining plant regeneration and acclimatization of the 'RB92579' and 'RB93509' sugarcane cultivars and to elucidate the shoots origin through histological analysis. For both cultivars, obtaining shoots showed better results with the culture of explants on a callus induction medium containing 2.0mg L-1 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, followed by cultivation on a shoot induction medium containing 0.1mg L-1 kinetin and 0.2mg L-1 benzilaminopurine. The MS medium without growth regulators proved to be appropriate for elongation and rooting of shoots and the use of the composed substrate of vermiculite + MS salts was effective for acclimatization. Histological analysis revealed that the origin of the shoots in both cultivars occurred through indirect organogenesis.

Este trabalho teve como objetivo a obtenção de plantas de Eucalyptus camaldulensis a partir de folhas cotiledonares e o estudo da anatomia dos tecidos durante a calogênese e organogênese para determinar a origem das gemas. Folhas cotiledonares foram cultivadas em meios de cultura MS, WPM e JADS suplementados com 2,7 µM de ANA e 4,44 µM de BAP. Os melhores resultados para a regeneração de gemas foram obtidos com os meios MS e WPM. Para o alongamento e enraizamento, o meio de cultura MS/2 contendo 0,2% de carvão ativado apresentou-se eficiente para ambas as etapas. A aclimatização foi realizada mediante a abertura dos frascos na sala de crescimento por 48 horas, seguido da transferência para casa-de-vegetação com nebulização intermitente. Estudos histológicos foram conduzidos e revelaram que a calogênese teve início nas células do parênquima paliçádico e que as gemas adventícias formaram-se a partir dos calos, indicando a organogênese indireta.

The present work aimed at regenerating plants of Eucalyptus camaldulensis from the cotyledonary explants and describing the anatomy of the tissues during callogenesis and organogenesis processes, in order to determine the origin of the buds. The cotyledonary leaves of E. camaldulensis were cultured in Murashige and Skoog (MS), WPM and JADS media supplemented with 2.7 µM NAA and 4.44 µM BAP. The best results for bud regeneration were obtained on MS and WPM media (57.5 and 55% of calluses formed buds, respectively). Shoot elongation and rooting (80%) were obtained on MS/2 medium (with half-strength salt concentration) with 0.2% activated charcoal. Acclimatization was performed in the growth chamber for 48 h and then the plants were transferred to a soil:vermiculite mixture and cultured in a greenhouse. Histological studies revealed that the callogenesis initiated in palisade parenchyma cells and that the adventitious buds were formed from the calluses, indicating indirect organogenesis.

A implementação, para espécies florestais, de técnicas de melhoramento baseadas em métodos de transformação genética, permitirá reduzir os longos ciclos de melhoramento e evitar a manipulação de árvores adultas. Isto implica dispor de um protocolo de regeneração que permita o desenvolvimento de plantas a partir de tecidos transformados. Este trabalho teve como objetivo otimizar este protocolo de regeneração para Eucalyptus camaldulensis. Folhas cotiledonares foram cultivadas em meio de cultura MS suplementado com combinações de ácido naftalenoacético (ANA) e 6-benzilaminopurina (BAP). O tratamento mais eficiente em termos de regeneração indireta de gemas foi 2,7 µmol L-1 de ANA combinado com 4,44 µmol L-1 de BAP, o qual foi utilizado nos experimentos posteriores. A manutenção dos explantes no escuro durante os trinta primeiros dias elevou a porcentagem de explantes com calos e reduziu a morte dos explantes, em comparação com os que permaneceram na luz. Modificações da composição mineral do meio MS foram comparadas e mostraram que a redução de metade dos sais foi tão eficiente para a formação de gemas (54% dos explantes) quanto o meio completo (47%). O meio de cultura com a concentração de íons nitrato e amônio reduzida à metade e 0,2% de carvão ativado apresentou-se adequado para o alongamento e enraizamento das brotações que atingiram uma altura de 1 a 8 cm depois de 30 dias. O processo completo representa um protocolo eficiente para a regeneração de plantas de Eucalyptus camaldulensis, uma vez que reduz o número de etapas para a obtenção de plantas completas.

Breeding methods based on genetic transformation techniques need to be implemented for Eucalyptus camaldulensis to shorten the long breeding cycles and avoid manipulation of adult trees; that requires the development of plant regeneration protocols enabling development of plants from transformed tissues. The present work aimed to optimise the regeneration process already established for the species. Cotyledonary leaves of E. camaldulensis were cultured in MS medium supplemented with naphthaleneacetic acid (NAA) and 6-benzylaminopurine (BAP) combinations. The most efficient treatment for bud indirect regeneration (2.7 µmol L-1 NAA and 4.44 µmol L-1 BAP) was used for further experiments. When explants were kept in the dark during the first 30 days, the percentage of explants forming calluses increased and explant necrosis was reduced in comparison with light-cultured explants. Mineral medium modifications were compared and half-strength MS mineral medium turned out to be as efficient as full-strength medium, producing 54% and 47% of explants with buds, respectively. For shoot elongation, MS medium with half-strength nitrate and ammonium salts, and 0.2% activated charcoal yielded rooted shoots 1 to 8 cm high after one month. The procedure is an efficient protocol for E. camadulensis plant regeneration, reducing the stages necessary for the obtention of complete plants.