Abstract We aimed to verify the changes in the microbial community during bioremediation of gasoline-contaminated soil. Microbial inoculants were produced from successive additions of gasoline to municipal solid waste compost (MSWC) previously fertilized with nitrogen-phosphorous. To obtain Inoculant A, fertilized MSWC was amended with gasoline every 3 days during 18 days. Inoculant B received the same application, but at every 6 days. Inoculant C included MSWC fertilized with N–P, but no gasoline. The inoculants were applied to gasoline-contaminated soil at 10, 30, or 50 g/kg. Mineralization of gasoline hydrocarbons in soil was evaluated by respirometric analysis. The viability of the inoculants was evaluated after 103 days of storage under refrigeration or room temperature. The relative proportions of microbial groups in the inoculants and soil were evaluated by FAME. The dose of 50 g/kg of inoculants A and B led to the largest CO2 emission from soil. CO2 emissions in treatments with inoculant C were inversely proportional to the dose of inoculant. Heterotrophic bacterial counts were greater in soil treated with inoculants A and B. The application of inoculants decreased the proportion of actinobacteria and increased of Gram-negative bacteria. Decline in the density of heterotrophic bacteria in inoculants occurred after storage. This reduction was bigger in inoculants stored at room temperature. The application of stored inoculants in gasoline-contaminated soil resulted in a CO2 emission twice bigger than that observed in uninoculated soil. We concluded that MSWC is an effective material for the production of microbial inoculants for the bioremediation of gasoline-contaminated soil.

RESUMO A inoculação de micro-organismos solubilizadores de fosfato, em conjunto ou não com fungos micorrízicos, pode ser alternativa para a redução dos custos de produção de eucalipto por meio da diminuição dos gastos com fertilizantes fosfatados. Dessa forma, objetivou-se com este trabalho isolar e caracterizar bactérias solubilizadoras de fosfato da rizosfera de Eucalyptussp., visando à sua coinoculação com fungos ectomicorrízicos. Entre os 24 isolados de bactérias originários do solo rizosférico de eucalipto, 12 são do filo γ-Proteobacteria e pertencentes à família Enterobacteriaceae (Enterobacter, Kluyvera e Klebsiella); 9 do filo β-Proteobacteria (Burkholderia); 1 do filo Actinobacteria (Curtobacterium); e 1 do filo Firmicutes (Enterococcus). O índice de solubilização de fosfato, calculado dividindo-se o diâmetro do halo de clareamento pelo diâmetro da colônia, variou de 0 a 11, sendo Enterococcus avium a espécie com o maior potencial de solubilização de CaHPO4in vitro. A produção de acidez em meio glicose-extrato de levedura pelos isolados bacterianos rizosféricos foi significativa, no entanto a capacidade de solubilização de CaHPO4 não se correlacionou com a acidificação do meio. Alguns isolados bacterianos promoveram forte inibição do crescimento de Pisolithus sp., isolado H4111, enquanto outros não causaram esse fenômeno. Os isolados RE 56 (Enterococcus avium), RE 41 (Burkholderia cepacea), RE 52 e RE 30 (ambos Burkholderia pyrrocinia) foram aqueles que apresentaram maior potencial para utilização em experimentos de coinoculação com fungos ectomicorrízicos.

ABSTRACT The inoculation of phosphate solubilizing microorganisms, with or without mycorrhizal fungi, can be an alternative to reduce de production costs of eucalyptus due to the decrease in phosphate fertilization spending. Thus, the objective of this work was to isolate and characterize phosphate solubilizing bacteria from the rhizosphere of Eucalyptus sp. aiming their co-inoculation with ectomycorrhizal fungi. Among the 24 isolates of bacteria originating from the rhizosphere soil of Eucalyptus, 12 are from phylum γ-Proteobacteria belonging to the family Enterobacteriaceae (Enterobacter, Kluyvera and Klebsiella); 9 from β-Proteobacteria (Burkholderia); one from Actinobacteria (Curtobacterium) and one from Firmicutes (Enterococcus). The phosphate solubilization index, calculated by dividing the diameter of the halo of bleaching by the diameter of the colony, ranged from 0 to 11, with the species Enterococcus avium showing the greatest potential to solubilize CaHPO4 in vitro. The production of acidity in the Glucose-Yeast Extract media by the rhizosphere bacterial isolates was significant, however, CaHPO4 solubilization ability is not correlated with the acidification of the medium. Some bacterial isolates promoted strong inhibition of growth of Pisolithus sp., isolate H4111, while others did not cause this phenomenon. The isolates RE 56 (Enterococcus avium), RE 41 (Burkholderia cepacea), RE 52 and RE 30 (both Burkholderia pyrrocinia) were those which showed the highest potential for utilization in co-inoculation experiments with ectomycorrhizal fungi.

O uso de fosfatos naturais, aliado ao adequado manejo de microrganismos do solo solubilizadores de fosfato, é uma alternativa para reduzir os custos da adubação fosfatada. No entanto, ambas as práticas requerem a avaliação prévia do potencial da microbiota rizosférica em solubilizar fontes de P pouco reativas em condições de campo. O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial da microbiota do solo de solubilizar os fosfatos de Ca, Fe, Al, além dos fosfatos naturais de Araxá e Catalão em amostras de solo rizosférico e não rizosférico de plantio do hibrido Eucalyptus grandis × E. urophylla, localizados em três pontos de uma topossequência típica da Zona da Mata de Minas Gerais. Adicionalmente, avaliou-se a atividade de fosfatases ácidas e alcalinas sob as mesmas condições experimentais. A microbiota rizosférica das plantas do topo e da baixada apresentou maior potencial de solubilização de fosfato de Ca (5.745,09 e 6.452,80 μg de P, respectivamente), enquanto o solo da encosta não apresentou diferenças entre as fontes inorgânicas testadas. O fosfato de Catalão foi a fonte de fosfato natural com maior potencial de solubilização (1.209,71 μg de P) pela microbiota do solo nas condições avaliadas. O pH final do meio de cultura correlacionou-se negativamente com os valores de P solubilizado, indicando que a acidificação do ambiente foi um dos mecanismos de solubilização utilizados pela microbiota rizosférica in vitro. A atividade das fosfatases ácida e alcalina foi maior na rizosfera de plantas do topo, área com maior teor de matéria orgânica. Não foi observada correlação clara entre o potencial de solubilização de fosfato ou a atividade das fosfatases com o diâmetro médio à altura do peito das árvores do plantio. Este estudo demonstra o efeito da topografia no potencial de solubilização da microbiota do solo, que é influenciada positivamente pelo teor de matéria orgânica do solo.

The use of rock phosphates, combined with proper management of soil microorganisms able to solubilize phosphate, is an alternative for reducing the costs of P fertilization. However, both practices require prior assessment of the potential of the rhizospheric microbiota in solubilizing P sources with low reactivity under field conditions. The objective of this study was to evaluate the potential of soil microbes to solubilize Ca, Fe, and Al phosphates, as well as Araxá and Catalão rock phosphates, in rhizospheric and bulk soil samples from hybrid Eucalyptus grandis × E. urophylla plantations located at three points in a typical toposequence from the state of Minas Gerais. Additionally, we evaluated the activity of acid and alkaline phosphatases under the same experimental conditions. The rhizospheric microbiota of plants from the top of the slope and from the lowland showed higher solubilization potential of Ca phosphate (5,745.09 and 6,452.80 μg P, respectively), whereas the soil from along the slope showed no difference among the inorganic sources tested. Catalão rock phosphate was the natural phosphate source with highest solubilization potential (1,209.71 μg P) by soil microbiota under the conditions evaluated. The final pH of the culture medium was negatively correlated with the values of solubilized P, indicating that acidification of the environment is one of the mechanisms used by soil microbiota in phosphate solubilization in vitro. The activity of acid and alkaline phosphatases was higher in the rhizosphere of plants from the top of the slope, an area with higher organic matter content. No clear correlation between phosphate solubilization potential or phosphatase activity with the average diameter at breast height of trees was observed. This study demonstrates the effect of topography on the solubilization potential of soil microbes, which is positively influenced by the organic matter content of the soil.

Culturas monoxênicas de fungos micorrízicos arbusculares (FMAs) em raízes transformadas têm sido utilizadas para melhor compreensão desses fungos, porém, poucas espécies foram estabelecidas in vitro com sucesso. O objetivo do trabalho foi estabelecer culturas monoxênicas de Gigaspora decipiens e Glomus clarum e verificar o efeito da temperatura e pH na produção de esporos. As culturas foram obtidas de esporos desinfestados e germinados em Agar-água. Após a germinação foram transferidos para placas de Petri contendo raízes de cenoura transformadas, em meio mínimo. Após 4 a 6 dias formou-se novos esporos e estruturas típicas. O efeito da temperatura (22, 25, 28 e 32ºC) e pH (4,0; 4,5; 5,5 e 6,5) na produção de esporos foram analisados por 3 meses, obtendo-se curvas sigmoidais. Os esporos aumentaram a partir de 22ºC, atingindo valores maiores em 28ºC e em 32ºC reduziu-se a produção. A maior produção de esporos de G. decipiens ocorreu em pH 6,5, enquanto G. clarum em pH 4,0. O cultivo de outras espécies faz-se necessário visando o conhecimento de aspectos particulares da simbiose até hoje não elucidados, incluindo-se os efeitos dos fatores ambientais sobre a produção dos esporos das diversas espécies de FMAs.

Monoxenic cultures of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) in transformed roots have been used to better understand the symbiosis with these fungi, but few species have been successfully established in vitro. The object was to establish monoxenic cultures of Gigaspora decipiens and Glomus clarum and to verify the effects of temperature and pH on spore formation. Cultures were established from superficially disinfested spores that were germinated on an agar and water. After germination, the spores were transferred to Petri dishes containing transformed carrot roots. After 4-6 days formed newly formed spores and structures typical. The effects of temperature (22, 25, 28 or 32ºC) and pH (4.0, 4.5, 5.5 or 6.5) on the production of spores were assessed over three months, resulting in sigmoidal growth curves. The spore increased from 22ºC, reaching higher values 28oC and 32oC there was a reduction in the production. The highest spore production of G. decipiens occurred in a pH of 6.5, whereas for G. clarum was pH of 4.0. The cultivation of other species is still necessary to elucidate particular aspects of the symbiosis that so far are unclear, including the effects of environmental factors on the production of spores of different AMF species.

The common bean is one of the most important legumes in the human diet, but little is known about the endophytic bacteria associated with the leaves of this plant. The objective of this study was to characterize the culturable endophytic bacteria of common bean (Phaseolus vulgaris. leaves from three different cultivars (Vermelhinho, Talismã, and Ouro Negro) grown under the same field conditions. The density of endophytic populations varied from 4.5 x 10² to 2.8 x 10³ CFU g-1 of fresh weight. Of the 158 total isolates, 36.7% belonged to the Proteobacteria, 32.9% to Firmicutes, 29.7% to Actinobacteria, and 0.6% to Bacteroidetes. The three P. vulgaris cultivars showed class distribution differences among Actinobacteria, Alphaproteobacteria and Bacilli. Based on 16S rDNA sequences, 23 different genera were isolated comprising bacteria commonly associated with soil and plants. The genera Bacillus, Delftia, Methylobacterium, Microbacterium, Paenibacillus, Staphylococcus and Stenotrophomonas were isolated from all three cultivars. To access and compare the community structure, diversity indices were calculated. The isolates from the Talismã cultivar were less diverse than the isolates derived from the other two cultivars. The results of this work indicate that the cultivar of the plant may contribute to the structure of the endophytic community associated with the common bean. This is the first report of endophytic bacteria from the leaves of P. vulgaris cultivars. Future studies will determine the potential application of these isolates in biological control, growth promotion and enzyme production for biotechnology.

A formação de ectomicorrizas por isolados monocarióticos e dicarióticos de Pisolithus microcarpus (Cooke & Massee) G. Cunn. em Eucalyptus grandis W. Hill ex Maid. foi estudada usando-se o método de síntese in vitro em placas de Petri. A formação de ectomicorrizas foi observada para todas as linhagens testadas. Ectomicorrizas formadas pelas linhagens monocarióticas apresentaram manto de hifas circundando a raiz e rede de Hartig limitada à camada da epiderme, típica de ectomicorrizas de angiospermas. As percentagens de colonização, correspondendo ao número de ectomicorrizas em relação ao total de raízes laterais curtas, variaram de 23 a 62%. Algumas linhagens monocarióticas estimularam a formação de raízes laterais curtas, promovendo aumentos médios de 109% em comparação com o controle. A presença de alguns dos isolados no meio de síntese in vitro estimulou a produção de raízes laterais de maior diâmetro. As dimensões das raízes laterais e das ectomicorrizas variaram com o isolado inoculado, indicando variações dentro da população testada na capacidade de provocar mudanças morfológicas nas raízes da planta hospedeira. O dicário M5M11 apresentou maiores valores para produção de raízes laterais, número de ectomicorrizas e percentagem de colonização em comparação com os isolados monocarióticos correspondentes, M5 e M11, indicando a possibilidade de se selecionar isolados compatíveis eficientes para a produção de dicários superiores. O conjunto de isolados monocarióticos testado variou quanto à capacidade de colonização das raízes de E. grandis e de causar mudanças morfológicas nas raízes relacionadas ao metabolismo secundário, constituindo sistema-modelo para o estudo da genética, da fisiologia e dos processos morfogenéticos envolvidos na formação de ectomicorriza entre Pisolithus e Eucalyptus.

The formation of ectomycorrhizas by monokaryotic and dikaryotic isolates of Pisolithus microcarpus (Cooke & Massee) G. Cunn. in Eucalyptus grandis W. Hill ex Maid. was studied by in vitro synthesis in Petri dishes. The formation of ectomycorrhizas was observed for all strains tested. Ectomycorrhizas formed by the monokaryotic strains presented a sheath of hyphae around the roots and a Hartig net limited to the epidermis layer, typical of the angiosperm ectomycorrhizas. Colonization rates, a measure of the number of ectomycorrhizas in relation to the total number of lateral root tips, varied from 23 to 62%. Some monokaryotic strains stimulated the formation of lateral roots, promoting increases of up to 109% above the control. The presence of some of the isolates in the in vitro synthesis medium stimulated the production of thicker lateral root tips. The dimensions of the lateral roots tips and ectomycorrhizas varied from one isolate to the next, indicating a variation in their capacity to provoke morphological changes in the host plant roots. The dikaryotic strain M5M11 presented higher values for lateral root yield, number of ectomycorrhizas, and colonization percentage than the corresponding monokaryotic strains, M5 and M11. This indicated the possibility of selecting compatible performing monokaryotic isolates for the yield of superior dikaryotic strains. The set of monokaryotic strains tested varied greatly in their ability to colonize E. grandis roots and cause secondary metabolism-related morphological changes in roots, providing a wealth of model systems for the study of genetic, physiological, and morphogenetic processes involved in Pisolithus-Eucalyptus ectomycorrhiza formation.

O eucalipto apresenta ótimo crescimento em solo com baixa fertilidade, mas pouco se sabe sobre a participação das ectomicorrizas e de ácidos orgânicos na aquisição e no acúmulo de nutrientes pela planta em campo. A produção de ácido oxálico e sua relação com as concentrações de P, Ca, Mg e K foram avaliadas em ectomicorrizas e raízes laterais finas de híbrido de Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla, de 2,5 anos de idade, na região de Viçosa, MG. A área de estudo apresenta topografia típica em meia laranja, de vertente côncavo-convexa. Foram também avaliadas as concentrações desse composto no solo rizosférico, não rizosférico e ectomicorrizosférico. As maiores percentagens de colonização micorrízica foram observadas na área de encosta, onde havia limitada disponibilidade de nutrientes e alta saturação de Al. As concentrações de ácido oxálico + oxalato corresponderam, em mg kg-1: folhas, 324,6; ectomicorrizas, 208,3; raízes laterais finas não colonizadas, 183,1. Já no solo, as concentrações foram maiores no solo ectomicorrizosférico, com 183,7 mg kg-1, seguido pelo solo rizosférico, com 134,3 mg kg-1, e pelo solo não rizosférico, com 76,0 mg kg-1. As maiores concentrações de ácido oxálico e P (p < 0,05) nas ectomicorrizas da área do topo, 117,3 mg kg-1 e 6,3 g kg-1, respectivamente, sugerem que as populações de fungos ectomicorrízicos nesta área têm papel importante na solubilização e disponibilização de nutrientes para o hospedeiro. Não foram observadas correlações positivas significativas entre a produção de ácido oxálico e as concentrações de Ca nas raízes laterais finas e nas ectomicorrizas de eucalipto.

Eucalypt is highly efficient at growing in nutrient-poor soils, but little is known about the role of ectomycorrhizas and organic acids in nutrient uptake and storage under field conditions. Oxalic acid production and its relationships with Ca, P, K, and Mg concentrations were evaluated in the ectomycorrhizas and fine lateral roots of a 2.5 year-old Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla hybrid grown in a mountainous area at Viçosa, MG, Brazil. Oxalic acid concentrations were also evaluated in rhizospheric, non-rhizospheric, and ectomycorhizospheric soil. Mycorrhizal colonization was highest in a slope area with limited nutrient availability and high Al saturation. The oxalic acid concentration was 324.6 mg kg-1 in the leaves; 208.3 mg kg-1 in ectomycorrhizas; and 183.1 mg kg-1in non-mycorrhizal fine lateral roots. The concentrations in the soil were highest in the ectomycorhizospheric soil, 183.7 mg kg-1, followed by the rhizospheric soil, 134.3 mg kg-1, and finally, by the non-rhizospheric soil, 76.0 mg kg-1. The highest oxalic acid and P concentrations in the ectomycorrhizas found in the hilltop area, 117.3 mg kg-1and 6.3 mg kg-1, respectively, suggest that the population of ectomycorrhizal fungi in this area plays an important role in nutrient solubilization and supply to the host plant. No significant positive correlations were observed between oxalic acid production and Ca concentrations in the fine lateral roots and ectomycorrhizas of the eucalypt trees.

O eucalipto é eficiente na aquisição de Ca do solo, mas pouco se sabe sobre a participação das ectomicorrizas e dos ácidos orgânicos nesse processo em campo. O acúmulo de cristais de Ca (CaOx) foi avaliado em, aproximadamente, 2.100 raízes laterais finas e ectomicorrizas do híbrido de Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla, cultivado por 2,5 anos em área com topografia típica em meia laranja, com vertente côncavo-convexa, na região de Viçosa, MG. Técnicas de microscopia óptica e microscopia eletrônica de varredura foram usadas para a visualização dos CaOx. Em 73,7 % das raízes, ocorreu abundante acúmulo de drusas e grânulos de CaOx nas células do córtex. A presença conspícua de CaOx foi observada em 56,2 % das ectomicorrizas e em 17,5 % das raízes laterais finas não colonizadas, evidenciando o papel das micorrizas no acúmulo de Ca em eucalipto. A forma predominante dos CaOx foram as drusas nas ectomicorrizas e os grânulos cristalinos nas raízes. Os dez morfotipos de ectomicorrizas observados na área diferiram quanto à presença e à morfologia dos CaOx, o que pode representar distintas capacidades dos fungos ectomicorrízicos em fornecer Ca para a planta hospedeira. A análise da superfície do manto das ectomicorrizas por microscopia eletrônica de varredura não evidenciou a presença de CaOx nessa estrutura, confirmando que, nas condições avaliadas, o acúmulo de cristais limita-se ao córtex radicular. Este é o primeiro relato da ocorrência de CaOx em ectomicorrizas de eucalipto no Brasil, com dados que comprovam que há mecanismos de armazenamento de Ca nas ectomicorrizas em áreas com baixa disponibilidade do elemento.

Eucalypt is efficient at taking up Ca from the soil, however little is known about the contribution of ectomycorrhizas and organic acids to this process under field conditions. The accumulation of calcium oxalate crystals (CaOx) was evaluated in, approximately, 2,100 fine lateral roots and ectomycorrhizas of a 2.5-year-old Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla hybrid, grown in a mountainous area at Viçosa, MG, Brazil. Optical and scanning electron microscopy techniques were used for CaOx observation. Abundant accumulation of calcium as druses or grains in the root cortex cells was observed in 73.7 % of the fine lateral roots. The conspicuous presence of CaOx was observed in 56.2 % of the ectomycorrhizal and in 17.5 % of the nonmycorrhizal fine lateral roots, evidencing the role of the ectomycorrhizal association in calcium storage of eucalypt roots. In the ectomycorrhizal root, druses were the predominant CaOx form, while in nonmycorrhizal roots crystalline grains were more frequent. The 10 ectomycorrhizal morphotypes observed varied in relation to the CaOx content in the root cortex, possibly representing distinct capacities of each ectomycorrizal fungi to supply Ca to the host plant. The analysis of the mantle surface of the different ectomycorrhizal morphotypes by scanning electron microscopy did not detect the presence of CaOx in this structure, confirming that under the conditions evaluated, CaOx accumulation in the association is limited to the root cortex. This is the first report on the occurrence of CaOx in eucalypt ectomycorrhizas in Brazil, with data that demonstrate the existence of calcium storage mechanisms in the ectomycorrhizas in areas with low calcium availability.

Os basidiósporos de Pisolithus sp. contêm grande quantidade de lipídeos, indicando provisão para futura germinação na rizosfera da planta hospedeira. No entanto, pouco se conhece a respeito do acúmulo, da composição e da mobilização dos lipídeos durante a formação e germinação dos esporos. Neste trabalho, o armazenamento de lipídeos e a análise da composição em ácidos graxos durante a basidiosporogênese foram estudados utilizando-se técnicas de microscopia de luz e cromatografia gasosa. O basidiocarpo fúngico apresentou abundantes corpos lipídicos no interior de suas hifas, basídios e basidiósporos. Esse fato evidencia considerável transporte de C dentro do basidiocarpo para suprir a demanda de C durante a formação dos esporos. A composição de ácidos graxos revelou a presença de 24 compostos com cadeias variando de 9 a 18 átomos de C, sendo tanto saturados ou contendo uma ou duas insaturações. A composição de ácidos graxos variou de acordo com o estádio de desenvolvimento dos peridíolos. Nos basidiósporos livres, os compostos predominantes foram 16:0, 16:1w5c, 18:1w9c e 18:2w6,9c/18:0ante, com concentrações de 76, 46, 192 e 51 µg g-1 do ácido graxo de matéria seca, respectivamente. Esses resultados indicam que o ácido oléico é o principal constituinte das reservas lipídicas nos basidiósporos de Pisolithus sp. Outros trabalhos estão sendo realizados para determinar os fatores que desencadeiam a mobilização de lipídeos durante a germinação de esporos.

The basidiospores of Pisolithus sp. contain large amounts of lipids, indicating provision for future germination in the host rhizosphere. However, the accumulation, composition, and mobilization of lipids during formation and germination of these spores are largely unknown. In this study, lipid storage and fatty acid composition during basidiosporogenesis were analyzed in fresh basidiocarps using bright-field microscopy and gas chromatography. Abundant lipid bodies are found in the hyphae, basidia, and basidiospores of fungal basidiocarps. This evidences a considerable C transport in the basidiocarp to meet the C demand during basidiospore formation. Fatty acid composition analysis revealed the presence of 24 compounds with chains of 9 to 18 C atoms, either saturated or insaturated, with one or two insaturations. The fatty acid composition and content varied according to the developmental stage of the peridioles. In free basidiospores, the predominant compounds were 16:0, 16:1w5c, 18:1w9c, and 18:2w6,9c/18:0ante, at concentrations of 76, 46, 192, and 51 µg g-1 dry matter, respectively. Our results indicate that oleic acid is the major constituent of lipid reserves in Pisolithus sp. basidiospores. Further studies are being conducted to determine the factors that induce lipid mobilization during spore germination.

A germinação de basidiósporos de Pisolithus spp. dá origem a monocários, caracterizados por possuírem um único núcleo haplóide por célula. No campo, o eucalipto associa-se a micélios dicarióticos de Pisolithus spp., não havendo relatos sobre a capacidade dos monocários em estabelecer a associação ectomicorrízica com a planta hospedeira nessas condições. Embora os monocários de Pisolithus sp. sejam capazes de formar a associação ectomicorrízica in vitro, nada se sabe sobre a capacidade dessas estirpes em promover a absorção de nutrientes e o crescimento do eucalipto. O objetivo deste trabalho foi estudar a formação de ectomicorrizas por isolados monocarióticos e dicarióticos de Pisolithus sp. em Eucalyptus grandis, sob condições de casa de vegetação, bem como investigar as relações entre o estabelecimento da associação e o crescimento e a absorção de P, Ca, Mg, K, Cu e Zn pelas plantas. Caracterizou-se, também, a produção de massa seca micelial e a absorção de nutrientes pelos isolados fúngicos in vitro. Os isolados monocarióticos e dicarióticos testados variaram na produção de massa seca micelial e na capacidade de absorção de nutrientes. Em geral, os monocários apresentaram maiores índices de eficiência de utilização de nutrientes do que os dicários. Todos os isolados monocarióticos e dicarióticos formaram ectomicorrizas típicas quando associados com E. grandis. A presença dos isolados fúngicos monocarióticos associados às raízes laterais resultou em aumento do diâmetro radial das células da epiderme radicular, característico das ectomicorrizas de eucalipto, indicando que os monocários, à semelhança dos dicários, são capazes de produzir reguladores de crescimento. As médias de percentagem de colonização das raízes pelos isolados monocarióticos e dicarióticos variaram de 12 a 76 %. A absorção de Ca, Mg e K foi estimulada de forma expressiva pela presença das ectomicorrizas, com aumentos de até 760 vezes, demonstrando a relevância dessa associação no suprimento desses macronutrientes, especialmente o Ca. Alguns isolados monocarióticos são tão eficientes quanto os dicários na colonização radicular e na absorção de nutrientes. A caracterização dos monocários de Pisolithus sp. é necessária para se estabelecer a seleção e o cruzamento dos isolados com características desejáveis, visando ao melhoramento genético e à maior eficiência da associação simbiótica. Este trabalho constitui o primeiro relato das interações nutricionais entre monocários de Pisolithus sp. e a planta hospedeira.

The germination of Pisolithus spp. basidiospores originates monokaryons, characterized by having a single haploid nucleus per cell. In the field, eucalypts are associated with dykaryons of Pisolithus spp., there being no reports on the capacity of monokaryons to establish the ectomycorrhizal association with the host plant under such conditions. Although Pisolithus spp. monokaryons have been shown to form ectomycorrhizas in vitro, there is no information on the ability of these strains to promote nutrient uptake and growth of eucalypts. The objective of this study was to investigate the formation of ectomycorrhizae by monokaryotic and dikaryotic isolates of Pisolithus sp. in Eucalyptus grandis under greenhouse conditions, and the relationships between the establishment of ectomycorrhizae and the host plant growth and uptake of P, Ca, Mg, K, Cu, and Zn. The fungal isolates were highly variable in dry mycelial mass production and in their ability to take up macro- and micronutrients. Generally, the nutrient use efficiency of monokaryons was higher than that of dikaryons. All tested monokaryotic and dikaryotic isolates were able to form typical ectomycorrhizae when associated with E. grandis. The presence of monokaryotic isolates associated with the lateral roots of E. grandis resulted in typical increases in the radial diameter of the root epidermal cells, characteristic of eucalypt ectomycorrhizae, indicating that monokaryons, similarly to dikaryons, are capable of producing growth regulator compounds. The mean root colonization percentage of the monokaryotic and dikaryotic isolates varied from 12 to 76 %. The Ca, K, and Mg uptake was highly stimulated by the presence of ectomycorrhizae, with up to 760-fold increases, suggesting that the association must play a significant role in supplying the host with these nutrients, especially Ca. Some monokaryotic isolates are as efficient as the dikaryons at promoting root colonization and nutrient uptake. The characterization of Pisolithus sp. monokaryons is a basic requirement for the selection and crossing of isolates with desirable traits, aiming at the genetic improvement of fungal strains and a higher efficiency of the ectomycorrhizal association. This is the first report on the nutritional interactions between Pisolithus sp. monokaryons and the host plant.

A síntese de proteínas de choque térmico é uma alteração fisiológica transiente na célula de organismos expostos a temperaturas supra-ótimas. A resposta fisiológica ao choque térmico é dependente, particularmente, do tipo de célula e da capacidade dos organismos em responder às alterações do meio. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o crescimento micelial e a síntese de proteínas de choque térmico de dois isolados de Pisolithus sp. (RV82 e RS24) e de um isolado de Paxillus involutus em temperaturas supra-ótimas. No trabalho, foram feitas análises de crescimento micelial em placa de Petri com meio apropriado para o crescimento sob condições de temperaturas subletais, letais e de choque térmico. As proteínas nos micélios dos isolados foram marcadas com aminoácido radioativo (³H-leucina), e a radioatividade, quantificada em solução de cintilação. A síntese das proteínas de choque térmico (HSPs) foi avaliada em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE e 2D-PAGE). Demonstrou-se, com ³H-leucina, que os fungos ectomicorrízicos apresentaram respostas diferenciadas em relação ao crescimento micelial quando expostos a temperaturas supra-ótimas. Os dois isolados de Pisolithus sp., RS24 e RV82, mostraram-se mais tolerantes a altas temperaturas, quando comparado ao isolado de P. involutus. Os isolados de Pisolithus sp. diferem quanto à síntese de proteínas de estresse, com a síntese de HSPs de alta e de baixa massa molecular. Em resposta ao choque térmico, o isolado RV82 sintetizou proteínas putativas dos grupos HSP70, HSP28 e HSP26 e as sHSPs (15-18 kDa), enquanto o isolado RS24 sintetizou as dos grupos HSP86, HSP60, HSP55 e HSP35 e as sHSPs (12-18 kDa). A baixa tolerância a temperaturas elevadas do isolado de P. involutus foi atribuída à ausência de síntese de proteínas putativas do grupo HSPs em condições de choque térmico. Os resultados sugerem que os isolados de fungos ectomicorrízicos diferem quanto ao mecanismo de indução de termotolerância.

In most organisms, the synthesis of heat shock proteins is a transient physiological change in the cell exposed to supra-optimal temperatures. The physiological response to heat shock is particularly dependent on the cell type and on the capacity of the organisms to respond to environmental alterations. In this study the mycelial growth and synthesis of heat shock proteins of two Pisolithus isolates (RV82 and RS24) and one Paxillus involutus isolate to supra-optimal temperatures was evaluated. Mycelial growth was evaluated under sublethal, lethal and heat shock temperature conditions with appropriate growth medium on Petri plates. Proteins in the mycelium of the isolates were marked using radioactive amino acid (³H-leucine) and the radioactivity was quantified in scintillation solution. Synthesis of heat shock proteins (HSPs) were evaluated by polyacrylamide gels (SDS-PAGE and 2D-PAGE). The two Pisolithus isolates RS24 and RV82 were more tolerant to high temperatures than P. involutus. The Pisolithus isolates differed regarding the synthesis of stress proteins since high and low molecular mass proteins were synthesized. In response to the heat shock, the RV82 isolate synthesized putative heat shock proteins of the groups HSP70, HSP28, HSP26 and sHSPs (15-18 kDa), while the RS24 isolate synthesized putative heat shock proteins of the groups HSP86, HSP60, HSP55, HSP35 and sHSPs (12-18 kDa). The low heat tolerance of the P. involutus isolate was attributed to its incapacity of synthesizing HSPs. Our results suggest that the induction of the thermotolerance mechanism differs among ectomicorrhizal fungi isolates.

Vinte e nove isolados do fungo ectomicorrízico Pisolithus sp., de diferentes regiões geográficas e hospedeiros, foram testados quanto à capacidade de formar ectomicorrizas em plântulas de Eucalyptus grandis e E. urophylla sob condições de casa de vegetação. Os isolados apresentaram grande variação na capacidade de formar ectomicorrizas com ambas as espécies de eucalipto. Todos os isolados originalmente obtidos de Eucalyptus, 9 originalmente obtidos de Pinus spp. e dois isolados de hospedeiros desconhecidos formaram micorrizas com E. grandis e E. urophylla. A taxa de colonização radicular dos isolados originalmente obtidos de Pinus e dos isolados de hospedeiros desconhecidos variou de 0 a 5,2 %. A taxa de colonização para esses isolados foi menor do que as obtidas para os isolados originalmente obtidos de Eucalyptus (0,8 a 89,4 %). Três isolados obtidos de hospedeiros desconhecidos não formaram micorrizas com nenhuma das espécies de Eucalyptus. A característica mais marcante para distinção das ectomicorrizas formadas pelos isolados de Pinus e pelo de Eucalyptus foi a cor do manto fúngico. Esses dados corroboram resultados prévios obtidos em laboratório, indicando que os isolados estudados devem representar ao menos duas espécies distintas dentro do gênero Pisolithus.

Twenty-nine isolates of the ectomycorrhiza fungus Pisolithus sp. from different geographical and host origins were tested for their ability to form ectomycorrhizae on Eucalyptus grandis and E. urophylla seedlings under greenhouse conditions. The ectomycorrhiza-forming capacity of isolates varied greatly from one eucalypt species to the other. All isolates from Eucalyptus, nine from Pinus spp. and two isolates from unknown hosts formed mycorrhizae with E. grandis and E. urophylla. Root colonization rates varied from 0 to 5.2 % for all Pinus isolates and those from unknown hosts. Colonization rates for these isolates were lower than those observed for Eucalyptus isolates (0.8 to 89.4 %). Three isolates from unknown hosts formed mycorrhizae with neither Eucalyptus species. The main characteristic for distinguishing Pinus from Eucalyptus isolates was mantle color. These data corroborate previous results obtained in our laboratory indicating that the isolates tested represent at least two distinct different species within the genus Pisolithus.

A germinação de sementes e o desenvolvimento de protocórmios de Oncidium flexuosum (Orchidaceae) induzidos simbioticamente são descritos pela primeira vez. As sementes de O. flexuosum foram inoculadas com dez fungos micorrízicos rizoctonióides, previamente isolados de micorrizas de dez espécies de orquídeas neotropicais do Brasil, incluindo O. flexuosum. Foram utilizados um isolado pertencente à espécie Epulorhiza repens, dois pertencentes à Epulorhiza epiphytica, seis de Ceratorhiza spp. e um de Rhizoctonia sp. Sementes inoculadas com o isolado M2 de Ceratorhiza sp., originalmente isolado do sistema radicular de O. flexuosum em habitat natural, promoveu a germinação das sementes em sete dias e em, aproximadamente, 30 % das plântulas, houve formação de folhas após 50 dias de incubação, apresentando pelotons em algumas células do protocórmio e das radicelas. Os demais isolados promoveram a germinação das sementes; entretanto, não promoveram um desenvolvimento ótimo dos protocórmios. Sementes incubadas na ausência de fungos micorrízicos não germinaram. A especificidade e a alta dependência de O. flexuosum pela associação micorrízica ficaram claras. Aspectos relativos à especificidade, anatomia da interação fungo-planta e a importância da seleção de estirpes fúngicas, previamente ao uso de fungos micorrízicos para o cultivo simbiótico a partir de sementes de O. flexuosum são discutidos.

Symbiotic in vitro seed germination and protocorm development of Oncidium flexuosum is described for the first time. O. flexuosum seeds were inoculated with ten mycorrhizal isolates, originally obtained from the mycorrhiza of ten neotropical Brazilian orchid species, including O. flexuosum. One of the isolates belongs to Epulorhiza repens, two to Epulorhiza epiphytica, six to Ceratorhiza spp., and one to Rhizoctonia sp. Seeds inoculated with the M2 isolate of Ceratorhiza sp., originally isolated from the root system of wild O. flexuosum, promoted seed germination within 7 days and about 30% of the seedlings produced leaves after 50 days of incubation, all of which presented pelotons in some protocorm and rhizoid cells. The other isolates stimulated seed germination, although they did not lead to an ideal protocorm development. Seeds incubated in the absence of the mycorrhizal fungi failed to germinate. The degree of specificity and dependence of O. flexuosum from mycorrhizal fungi thus was evident. Aspects of the specificity, anatomy of the plant-fungus interaction and the importance of the fungal strain selection prior to the use of mycorrhizal fungi for the symbiotical O. flexuosum cultivation from seeds are discussed.

Este experimento foi conduzido com o objetivo de avaliar a fermentação da proteína de três fontes de nitrogênio (tripticase, farelo de soja e farinha de peixe), com ou sem monensina ou extrato de própolis. Foram feitas incubações utilizando 7,2 mL de tampão de McDougall, 2,0 mL de inóculo, 0,2 mL de solução etanólica contendo ou não monensina ou própolis e 84,4, 150 ou 112,5 mg/10 mL de tripticase, farelo de soja e farinha de peixe, respectivamente, em arranjo fatorial 3x3. Os frascos foram incubados anaerobicamente a 39ºC em banho-maria durante 120 horas, coletando-se amostras do meio ao longo do tempo de incubação para determinação de amônia, proteína microbiana, proteína solúvel e degradabilidade da proteína. A farinha de peixe causou menor produção de amônia que a tripticase e o farelo de soja no tratamento controle, devido à sua menor degradabilidade. Tanto a monensina como a própolis reduziram a produção de amônia nos tratamentos contendo tripticase e farelo de soja, induzindo ao acúmulo de proteína solúvel no meio de incubação. A síntese de proteína microbiana foi similar para os três alimentos, com presença ou não dos inibidores, exceto no caso da própolis que a estimulou no tratamento contendo farinha de peixe. Observou-se maior degradabilidade da proteína bruta nos tratamentos controle para o farelo de soja (73%), em relação à farinha de peixe (42%). A monensina reduziu a degradação da tripticase e do farelo de soja, pela inibição da produção de amônia, e a própolis aumentou a degradação da farinha de peixe, pelo aumento da concentração de proteína solúvel no meio. Devido ao efeito in vitro da própolis sobre a atividade de fermentação, há necessidade de realização de pesquisas para verificar o efeito da mesma sobre a fermentação ruminal e sobre o desempenho dos animais.

This experiment had as objective to evaluate protein fermentation of three nitrogen sources (trypticase, soybean meal and fish meal), with or without monensin or propolis extract addition. Incubations were done by using 7.2 mL of McDougall buffer, 2.0 mL of inocula, 0.2 mL of ethanolic solution with or without monensin or propolis and 84.4, 150 or 112.5 mg/10 mL of trypticase, soybean meal and fish meal, respectively, in a 3x3 factorial arranjement. The flasks were incubated anaerobically at 39ºC in water bath during 120 hours, and samples were collected from the media over time for ammonia, microbial protein, soluble protein and protein degradability determinations. Fish meal caused lesser ammonia production than trypticase and soybean meal in control treatment, due to its lower degradability. Monensin and propolis decreased ammonia production in the trypticase and soybean meal treatments, leading to accumulation of soluble protein in the media. The microbial protein synthesis was similar among the three feed sources and with presence or absence of inhibitors, except in the case of propolis that estimulated synthesis in the fish meal treatment. There was greater protein degradability of the control treatment for soybean meal (73%) than fish meal (42%). Monensin reduced degradation of trypticase and soybean meal, by inhibiting ammonia production, and propolis increased degradation of fish meal, by increasing soluble protein concentration in the media. Due to the in vitro effect of propolis on fermentation activity, it is necessary to carry out researches in order to verify its effect on ruminal fermentation and animal performance.

Neste estudo, foram avaliados os efeitos da supressão e do ressuprimento de fosfato (Pi) sobre a fotossíntese e eficiência fotoquímica de plantas de Medicago sativa cv. Flórida 77, em diferentes estádios do desenvolvimento vegetativo (V3, V4) e reprodutivo (R6, R8). O ensaio foi conduzido em casa de vegetação e as plantas cultivadas na solução nutritiva de HOAGLAND & ARNON (1950), contendo 0,14mmol L-1 de Pi. A supressão de Pi por dez dias reduziu os teores de fósforo nas folhas amostradas, em todos os estádios do desenvolvimento. Entretanto, com o ressuprimento, somente nos estádios vegetativos, os valores foram semelhantes ao tratamento controle. A fotossíntese por área foliar, em todos os estádios do desenvolvimento diminuiu com a supressão de Pi. De modo geral, o ressuprimento de Pi à solução nutritiva resultou em recuperação na fotossíntese, excetuando-se as plantas no estádio V3, uma indicação de que o período de supressão não causou danos permanentes no aparato fotossintético. Os teores dos pigmentos fotossintéticos e a eficiência fotoquímica do fotossistema II (FS II), avaliada pela relação Fv/Fm, não foram alterados quando as plantas foram submetidas à supressão de Pi. Esse resultado demonstra que o transporte de elétrons através do FS II não limitou a fotossíntese nas folhas amostradas, sob supressão de Pi, sugerindo que a supressão causou efeito mais pronunciado na etapa bioquímica da fotossíntese.

This work evaluated the phosphate (Pi) suppression and ressupply on photosynthesis and photochemical efficiency from Medicago sativa plants cv. Florida 77, in different growth stages (V3 and V4) and reproductive (R6 and R8). The experiment was performed in a greenhouse, the plants being cultivated in HOAGLAND & ARMOND (1950) nutritive solution containing 0,14mmol L-1 of Pi. Pi suppression for ten days reduced Pi levels in sampled leaves, in all growth stages. However, with the re-supply only in the vegetative stages the values were similar to the control treatments. Photosynthesis per foliar area in all growth stages decreased with Pi suppression. In general, Pi ressupply into the nutritive solution resulted in recovery of photosynthesis, except for V3 plants, indicating that the suppression period did not cause permanent damage to the photosynthetic apparatus. Levels of photosynthetic pigments and the photosystem II (PS-II) photochemical efficiency evaluated as the Fv/Fm ratio were not altered when plants were submitted to Pi suppression. These results show that electons transport through PS-II did not limit photosynthesis in the sampled leaves under Pi supression, suggesting that Pi suppression caused a more pronunciated effect in the biochemical step of photosynthesis.