RESUMO: O tumor venéreo transmissível canino (TVTC) é a linhagem de células somáticas mais antiga conhecida. É um câncer transmissível que se propaga naturalmente em cães e mutações genéticas já foram relatadas. O gene RASSF1 atua no reparo de danos ao DNA e presume-se que, quando suprimido ou com expressão gênica reduzida, o TVTC tende a progredir. A expressão do gene supressor de tumor, como RASSF1, foi quantificada em tecidos de dezessete animais e três culturas de células de tecidos tumorais. Em geral, o gene RASSF1 apresentou prevalência de subexpressão (65%) e ausência em 35% dos demais tecidos analisados. Células isoladas de culturas de tecidos tumorais também demonstraram 67% com expressão diminuída e 33% com expressão elevada, com diferença significativa entre os níveis de expressão gênica em amostras de tecido quando comparadas às culturas de células, com tecidos apresentando níveis mais baixos de expressão gênica em comparação com células. Anteriormente, relatamos que tanto o microambiente tumoral quanto o sistema imunológico do hospedeiro parecem influenciar a tumorigênese e o estágio do TVTC. Este é o primeiro artigo a demonstrar a expressão de RASSF1 no TVTC, possivelmente alterando sua tumorigênese e auxiliando no aumento da progressão tumoral.

ABSTRACT: Canine transmissible venereal tumor (CTVT) is the oldest known somatic cell lineage. It is a transmissible cancer that propagates naturally in dogs and reportedly contains gene mutations. RASSF1 participates in DNA damage repair, and its downregulation, results in tumor progression. Hence, RASSF1 is a tumor suppressor gene. Its expression was quantified in tumors from seventeen animals and three cell cultures derived from tumors. In general, RASSF1 was underexpressed in 65%, and absent in 35% of tumor samples. Cells from tumor tissue cultures showed decreased expression of RASSF1 in 67% and elevated expression in 33% of samples tested. The tumor tissues showed significantly lower levels of RASSF1 expression compared to cultured cells. Previously we reported that both the tumor microenvironment and the host immune system appear to influence the tumorigenesis and stage of CTVT. This is the first article to demonstrate the expression of RASSF1 in CTVT. Decreased RASSF1 possibly helps tumor progression.

Resumen Antecedentes: La osteoartritis es una enfermedad degenerativa compleja en la cual varios factores contribuyen al daño articular. Objetivo: Comparar el efecto del ácido hialurónico (HA) y acetónido de triamcinolona (TA), solos o en combinación, en el proceso de diferenciación condrogénica in vitro de células madre mesenquimales (MSCs). Métodos: Las MSCs fueron divididas en cuatro grupos: Control, HA, TA y HA/TA, y cultivadas por 14 días en medio de diferenciación condrogénica para cada tratamiento. El potencial de diferenciación condrogénica fue analizado por medio de histología e inmunohistoquímica. Resultados: Las MSCs tratadas con HA y HA/TA, presentaron características histológicas similares a los condrocitos nativos, y la matriz extracelular (ECM) de MSCs tratadas con TA fue más compacta y organizada. La tinción de glicosaminoglicanos fue intensa en el Control, moderada en TA, ligera en HA/TA, y sin tinción en HA. La inmunoreactividad para colágeno tipo II fue más alta en las MSCs y ECM tratadas con TA. Conclusión: El análisis histológico muestra que el HA influencia un desarrollo morfológico similar a los condrocitos de las MSCs, pero con baja expresión de moléculas específicas de cartílago. La TA promueve la formación de una ECM compacta y organizada.

Resumo Antecedentes: A osteoartrite é uma doença degenerativa complexa, na qual vários fatores contribuem ao dano articular. Objetivo: Comparar o efeito do ácido hialurônico (HA) e Triancinolona acetonida (TA), só ou combinado no processo de diferenciação condrogênica in vitro de células tronco mesenquimais (MSCs). Métodos: MSCs foram divididas em 4 grupos: Controle, HA, TA y HA/TA e cultivadas por 14 dias com meio de diferenciação condrogênica e seus respectivos tratamentos. O potencial de diferenciação condrogênica foi acessado por meio de histologia e imunohistoquímica. Resultados: Histologicamente, MSCs tratadas com HA e HA/TA apresentaram características semelhantes de condrócitos nativos, e a matriz extracelular de MSCs tratadas com TA foi mais compacta e organizada. A coloração para glicosaminoglicanos foi intensa no Controle, moderada no TA, leve no HA/TA e sem coloração com HA. Para os grupos tratamento, a imunoreatividade para colágeno tipo II foi maior nas células e matriz extracelular tratadas com TA. Conclusão: Mediante análise histológica, o HA influenciou o desenvolvimento morfológico semelhante a condrócitos das MSCs, mas com baixa expressão de moléculas específicas de cartilagem. A TA promoveu a formação de uma matriz extracelular compacta e organizada.

Abstract Background: Osteoarthritis is a complex degenerative disease with several factors contributing to joint damage. Objective: To compare the potential effect of hyaluronic acid (HA) and triamcinolone acetonide (TA), alone or combined, on the in vitro chondrogenic differentiation process of mesenchymal stem cells (MSCs). Methods: MSCs were divided into four groups: Control, HA, TA, and HA/TA combined. Each treatment group was cultured for 14 days in chondrogenic differentiation medium. The chondrogenic differentiation potential was assessed by histology and immunohistochemistry. Results: The HA and HA/TA-treated MSCs presented histological characteristics similar to native chondrocytes. The extracellular matrix (ECM) of TA-treated MSCs was compact and organized. Glycosaminoglycan staining was intense in Control, moderate in TA, slight in HA/TA, and undetectable in HA. Type II collagen immunoreactivity was high in the TA-treated ECM and MSCs. Conclusions: Histological analysis shows that HA influences morphological development similar to chondrocytes of the MSCs, but with low expression of specific cartilage molecules. The TA promotes formation of a compact and organized ECM.

RESUMO: A osteopontina é uma glicofosfoproteina implicada em diferentes processos fisiológicos e patológicos, sendo conhecida por estar envolvida na progressão e metástase de vários cânceres nos humanos, no entanto, essa relação é ainda pouco explorada na veterinária. O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão da osteopontina nos carcinomas mamários caninos e sua relação com biomarcadores bem estabelecidos para esta neoplasia. Para isto, foi avaliada a expressão de OPN, EGRH, HER2 e c-Kit juntamente com a taxa de Ki67 em 43 carcinomas mamários. A osteopontina foi expressa pelas células epiteliais neoplásicas em todos os carcinomas, assim como, nas células estromais do microambiente tumoral. Foi demonstrada uma relação entre uma alta expressão de osteopontina e positividade para EGFR (P<0.001) e superexpressão de HER2 (P=0.012). Em conclusão, alta expressão de OPN parece estar relacionada com mau prognóstico e ativação da via MAPK, devido a sua associação com EGRF e HER2, os quais são membros desta via de sinalização.

ABSTRACT: Osteopontin is a glycophosphoprotein implicated in different physiologic and pathologic processes and is known to be involved in progression and metastasis of various cancers in humans, but this relation is still little explored in the veterinary. The aim was to evaluate the expression of osteopontin in canine mammary carcinomas and its relation with well-established canine mammary tumor biomarkers. For that, expression of OPN, EGFR, HER2, and c-Kit were evaluated along with Ki67 rate in 43 mammary carcinomas. Osteopontin was demonstrated to be expressed by neoplastic epithelial cells in all carcinomas as well as in stromal cells from the tumor microenvironment. Relation between high osteopontin expression and EGFR positivity (P<0.001) and HER2 overexpression (P=0.012) was demonstrated. In conclusion, high OPN expression seems to be related to poor prognosis and MAPK pathway activation, given the association with EGFR and HER2, members of the MAPK signaling pathway.

ABSTRACT: Mammary carcinomas are relatively common ailments among female canines aged around 10 years old, presenting an important morbidity with an average survival of five years. The cytoinclusion technique is frequently employed in human medicine as the investigative method of choice as it quickly provides resources for the determination of the correct therapeutic response, however, the effectiveness of the technique in canines remains understudied in veterinary medicine. This study aims at evaluating the degree of correlation with immunohistochemical marking for cytokeratin 5 (CK5), oestrogen and progesterone receptors (ER and PR) between the cytoinclusion and the histopathology technique in mammary carcinomas. Twenty-five samples of mammary carcinoma, both for the cytoinclusion and histopathological techniques were submitted for histological processing; microscope slides were created for hematoxylin-eosin (HE) staining and the immunohistochemical technique (IHC) was assessed for the ER, PR and CK5 receptors. Through the HE staining, we reached a concordance rate of 100% between the cytoinclusion and the histopathological analysis in the diagnosis of carcinomas. The immunohistochemical assay presented sensitivity of 85.71%, 95.45% and 100% and Cohen’s kappa of 0.78, 0.84 and 0.95 for ER, PR and CK5, respectively, as well as 100% specificity and P<0.01 for all three markers. Therefore, cytoinclusion represents an accessible, fast and low-cost method, offering high sensitivity for the cytomorphological and immunohistochemical diagnosis of mammary carcinoma in female canines.

RESUMEN: Los carcinomas mamarios son relativamente comunes en hembras caninas con edades de alrededor 10 años y representan un importante factor de morbilidad para estas hembras; la técnica de citoinclusión es frecuentemente empleada en medicina humana como un método de diagnóstico que permite proveer información rápida para la determinación de una conducta terapéutica correcta, sin embargo, la efectividad de esta técnica permanece poco estudiada en medicina veterinaria. El objetivo del estudio fue evaluar el grado de correlación entre marcadores inmunohistoquímicos para citokeratina 5 (CK5), receptores de estrógenos y progesterona (RE y RP) entre la técnica de citoinclusión y la técnica histopatológica en carcinoma mamario. Veinticinco muestras de carcinoma mamario para la técnica de citoinclusión e histopatológica fueron sometidas a procesamiento histológico, láminas fueron confeccionadas para la tinción mediante hematoxilina y eosina (HE), y la técnica de inmunohistoquímica para identificar la expresión de RE, RP y CK5. Mediante la tinción de la HE fue encontrado una proporción de concordancia del 100% entre el análisis de citoinclusión e histopatológico de carcinoma mamario. El análisis inmunohistoquímico evidenció una sensibilidad del 85,71%, 95,45% y 100% y un índice kappa de Cohen de 0,78, 0,84 y 0,95 para RE, RP y CK5, respectivamente, así como 100% de especificidad P<0,01 en todos los marcadores. De esta forma, la citoinclusión representa un método rápido, accesible y de bajo costo, que ofrece alta sensibilidad para el diagnóstico citomorfológico e inmunohistoquímico en carcinoma mamario de perras.

Resumo: Os anticorpos anti-vimentina, anti-lisozima, anti-alfa 1 antitripsina, anti-CD3 e anti-CD79α foram empregados para a caracterização de culturas primárias de tumor venéreo transmissível canino (TVT). Amostras para cultura primária e imuno-histoquímica foram coletadas de oito cães com diagnóstico clínico e citológico de TVT. Para validar o resultado inmunocitoquímico nas culturas de TVT foi realizada a contagem de cromossomos. Para a análise estatística o teste de Mann-Whitney foi empregado a um nível de significância de p<0.05. As culturas e os tecidos de TVT apresentaram intensa reatividade para vimentina, moderada a leve para Lisozima, moderada para alfa-antitripsina e não houve marcação para CD3 e CD79α. Finalmente, todas as culturas apresentaram números de cromossomos que variaram de 56 a 68. Este é o primeiro relato que apresenta o uso da immunocitoquímica para a caracterização de culturas de TVT. Assim, e devido ao fato de se observar semelhança entre a imunomarcação em células e tecidos, sugere-se que o uso desta técnica possa auxiliar na confirmação de culturas primárias do tumor, fato muito importante porque a utilização da cultura do tumor pode permitir o acesso a informação relevante sobre resposta potencial a um tratamento e conhecimento do comportamento biológico do tumor.

Abstract: Immunochemistry with anti-vimentin, anti-lysozyme, anti-alpha 1 antitrypsin, anti-CD3 and anti-CD79α antibodies has been used for characterization of primary cell culture in the transmissible venereal tumor (TVT). Samples for primary cell culture and immunohistochemistry assays were taken from eight dogs with cytological and clinical diagnosis of TVT. To validate the immunochemical results in the primary cell culture of TVT, a chromosome count was performed. For the statistical analysis, the Mann-Whitney test with p<0.05 was used. TVT tissues and culture cells showed intense anti-vimentin immunoreactivity, lightly to moderate immunoreactivity for anti-lysozyme, and mild for anti-alpha-antitrypsin. No marking was achieved for CD3 and CD79α. All culture cells showed chromosomes variable number of 56 to 68. This is the first report on the use of immunocytochemical characterization in cell culture of TVT. Significant statistic difference between immunochemistry in tissue and culture cell was not established, what suggests that the use of this technique may provide greater certainty for the confirmation of tumors in the primary culture. This fact is particularly important because in vitro culture of tumor tissues has been increasingly used to provide quick access to drug efficacy and presents relevant information to identify potential response to anticancer medicine; so it is possible to understand the behavior of the tumor.

Foi realizado um estudo retrospectivo dos resultados dos exames citológicos provenientes dos arquivos do Serviço de Citopatologia do Laboratório de Patologia Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, São Paulo, entre janeiro de 1994 e dezembro de 2008. Do total de 139.986 animais atendidos no Hospital Veterinário da instituição, 11.468 (8,2%) foram encaminhados para exame citológico. Desses diagnósticos, 57,28% corresponderam a lesões neoplásicas, 19,28% a lesões inflamatórias e 14,79% a processos não neoplásicos (imunológicos, degenerativos, hiperplásicos ou displásicos). Não foi possível concluir o diagnóstico por meio do exame citológico em 7,28% dos casos e não haviam informações diagnósticas registradas em 1,37% dos casos. Dentre os animais que mais receberam indicação para exame citológico destacaram-se os caninos (92,06%), seguidos pelos felinos (4,08%), bovinos (1,77%) e equinos (1,30%). Lesoes neoplásicas foram as mais comumente observadas e foram mais prevalentes nos cães (59,18%), afetando principalmente animais com idade média de 119,60 meses e principalmente fêmeas (61,61%). O incremento anual observado ao longo dos 15 anos de aplicação da citologia demonstra que o exame citológico é um método de suma importância para confirmar, sugerir ou afastar o diagnóstico de diversas afecções, inclusive neoplasia, em todas as espécies animais.

A retrospective study was conducted over the results of cytological examination in the files of the Department of Cytopathology, Laboratory of Animal Pathology, School of Veterinary Medicine and Animal Science, São Paulo State University, Botucatu, SP, Brazil, from January 1994 to December 2008. Out of 139,986 animals referred to the teaching Veterinary Hospital, 11,468 (8.2%) were submitted to cytological examination. From these animals, 57.28% had a neoplastic lesion, 19.28% had inflammatory lesions, and 14.79% had non-neoplastic processes (immune-mediated, degenerative, hyperplastic, or dysplastic condition). By means of cytology, 7.28% of the cases were unable to be diagnosed, and there was no recorded diagnostic information in 1.37% of cases. The species that more commonly had samples submitted to cytology was the dog (92.06%), followed by cats (4.08%), cattle (1.77%), and horses (1.30%). As to the predominance of the observed processes, greater importance was given to neoplastic lesions. These were prevalent in dogs (59.18%), with a mean age of 119.60 months, and affecting mainly females (61.61%). The annual increase observed over the 15 years of application of cytology demonstrates that the cytological examination is a method of great importance to confirm, suggest, or exclude the diagnosis of various diseases, including cancer, in all animal species.

Objetivo: evaluar la expresión del trasposón LINE-1 insertado en el oncogén c-myc como una alteración genética específica en células de Tumor Venéreo Transmisible canino espontáneo con fenotipos linfocitoideos o plasmocitoideos. Métodos: se tomaron muestras citológicas de 35 caninos naturalmente afectados por Tumor Venéreo Transmisible (TVT), separándolas en dos grupos de acuerdo al fenotipo predominante. La identificación del marcador molecular LINE-1/c-myc fue posible mediante la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) usando los primers myc.s y LINE. A, específicos para el segmento LINE-1. Resultados: el resultado del alineamiento de las secuencias obtenidas a partir del DNA de cada uno de los fenotipos de TVT no presentó variación entre ellos y al compararlas con el alineamiento de otras secuencias depositadas en el GenBank, pudo observarse que se trata de un reordenamiento LINE- 1/c-myc. Conclusiones: teniendo en cuenta la naturaleza agresiva del fenotipo plasmocitoide, se estableció que no hay polimorfismo genético entre los grupos analizados, siendo necesario realizar nuevos estudios tendientes a establecer diferencias moleculares asociadas con la agresividad de los diferentes fenotipos del TVT canino.

Objective: this study aimed to evaluate the LINE-1 transposon inserted in c-myc gene as a specific genetic alteration in cells of spontaneous canine Transmissible Venereal Tumor (TVT) with either lymphocytoid or plasmacytoid phenotypes. Methods: tumoral biopsies from 35 dogs were collected by puncture or exfoliation. Polymerase Chain Reaction (PCR) was carried out with primers myc.s and LINE. A, specific to the LINE-1 segment to detect the presence of LINE-1/c-myc molecular marker. Results: sequence alignment of DNA samples from lymphocytoid and plasmacytoid TVT cells did not show polymorphisms, and the comparison with sequences from the GenBank identified them as a LINE-1/c-myc rearrangement. Conclusions: considering the aggressive nature of the plasmacytoid phenotype, there is no apparent relation between LINE-1/c-myc and the malignancy of TVT. Further studies are needed to establish molecular differences associated with the aggressiveness of the various phenotypes of canine TVT.

Objetivo: foi avaliado o elemento de transposição LINE-1 inserido no gene c-myc como alteração genética específica nas células do TVT espontâneo canino nos grupos fenotípicos previamente classificados como linfocitóide e plasmocitóide. Métodos: amostras da lesão de 35 cães foram colhidas por punção ou esfoliação. Para identificar o marcador molecular LINE-1/c-myc nas amostras foi utilizada a técnica de Reação em Cadeia da Polimerase empregando-se os primers myc.s e LINE. A, específicos para o segmento LINE-1. Resultados: o resultado do alinhamento das sequências obtidas das amostras de DNA das células de TVT linfocitóide e plasmocitóide não apresentou polimorfismos e, por meio do alinhamento com outras sequências depositadas no GeneBank, identificou-se que trata-se do rearranjo LINE-1/c-myc. Conclusões: parece não haver relação entre este aspecto molecular analisado com a agressividade do tumor.