With the aim of a better characterization of the somatic recombination process in Trichoderma pseudokoningii, a progeny from crossings between T. pseudokoningii strains contrasting for auxotroph markers was characterized by RAPD markers and PFGE (electrophoretic karyotype). Cytological studies of the conidia, conidiogenesis and heterokaryotic colonies were also performed. The genotypes of the majority of the recombinant strains analyzed were similar to only one of the parental strains and the low frequency of polymorphic RAPD bands suggested that the nuclear fusions may not occur into the heterokaryon. In some heterokaryotic regions the existence of intensely staining hyphae might be related to cell death. We proposed that a mechanism of somatic recombination other than parasexuality might occur, being related to limited vegetative compatibility after postfusion events, as described for other Trichoderma species.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a resistência de Guignardia citricarpa aos fungicidas carbendazim e piraclostrobina, por meio de avaliação do crescimento em meio de cultura, decomposição de tecido foliar e produção de corpos de frutificação. Para isso, o fungo G. citricarpa foi isolado de lesões de frutos de laranja (Citrus sinensis), produzidos em área com intensa aplicação de fungicida. Os isolados obtidos foram avaliados quanto à sensibilidade aos fungicidas piraclostrobina e carbendazim, nas dosagens de 0,5, 1 e 2 µg mL-1 de i.a., para se verificar o efeito da pressão de seleção causada pelo uso destes compostos em áreas citrícolas. Embora tenha sido observada redução efetiva no número de estruturas reprodutivas e na decomposição de folhas e frutos infectados com G. citricarpa, após a aplicação dos fungicidas, 7,5% dos isolados avaliados sobre meio de cultura apresentaram resistência a esse fungicida, o que indica que pode ocorrer seleção de isolados resistentes no campo. Para a piraclostrobina não foi observada resistência, o que indica que pode ser um composto alternativo para ser utilizado de forma alternada com carbendazim, para diminuir as chances de ocorrência de resistência do patógeno.

The objective of this work was to evaluate the resistance of Guignardia citricarpa to pyraclostrobine and carbendazim fungicides, through: growth analysis in culture media amended with the fungicides; leaf decomposition; and production of reproductive structures on leaves naturally infected with these fungi. G. citricarpa was isolated from symptomatic fruits of sweet orange (Citrus sinensis) cultivated in area with intense fungicide application. The sensibility to fungicides of G. citricarpa isolates was evaluated with pyraclostrobine and carbendazim, in the doses 0.5, 1 e 2 µg mL-1 a.i., to verify the effect of selection pressure caused by continuous use of these compounds. Although, reduction on leaf decomposition and on the number of reproductive structures were observed after application of pyraclostrobine and carbendazim, 7.5% of the isolates, evaluated in culture media, exhibited resistance to carbendazim, suggesting that the use of this agrochemical must be combined to other active principles in a consortium to reduce the chances of resistance occurrence. No resistance to pyraclostrobine was observed among tested isolates, what indicates that this could be an alternative compound to be used in combination to carbendazim, to minimize the chance of resistance occurrence.

A rubelose é uma doença causada pelo fungo Erythricium salmonicolor que atinge muitos hospedeiros, como citros, café, seringueira, eucalipto, Acacia sp., infectando principalmente os galhos. Rubelose é um sério problema para o Brasil, reduzindo a produção de citros em valores próximos de 10%. A diversidade do fungo E. salmonicolor em cultivares brasileiras ainda não foi avaliada. Este trabalho teve como objetivos: i) avaliar a variabilidade genética, por meio de RAPD, de 19 isolados de E. salmonicolor provenientes de diferentes regiões citrícolas de São Paulo e Minas Gerais, ii) avaliar a compatibilidade vegetativa e fusão de hifas do fungo E. salmonicolor. Após a análise por RAPD, foram observados 6 grupos distintos, os quais não apresentaram correlação com o local de origem e espécie hospedeira. No teste de compatibilidade vegetativa, houve encontro de hifas em todos os cruzamentos e 84% destes apresentaram fusão entre elas. Foi verificada compatibilidade entre linhagens, embora não tenha sido observada correlação com os haplótipos. Os resultados observados neste trabalho indicam a importância de futuros estudos sobre a fase sexual do fungo E. salmonicolor, uma vez que a anastomose de hifas precede a formação de heterocário, onde ocorrem os processos de recombinação sexual e parassexual responsáveis pela variabilidade genética em fungos filamentosos.

The Pink Disease is caused by Erythricium salmonicolor, which attacks broad hosts, such as citrus, coffee, rubber, Eucalyptus spp. and Acacia spp., infecting mainly branches. This disease became a serious problem in Brazil, reducing the citrus production up to 10%. However the genetic diversity and compatibility of the fungus E. salmonicolor from Brazilian citrus plants is not yet evaluated. Therefore, the aims of this study were to evaluate: i) the genetic variability of E. salmonicolor in the São Paulo and Minas Gerais States by the RAPD technique, and ii) the vegetative compatibility between these isolates. After RAPD analysis, six distinct groups were observed without correlation between the isolation site or host species. In the vegetative compatibility test, the contact of fungal hyphae between all evaluated crosses was observed, of which 84% presented hyphal fusion. Although the compatibility between strains was observed, no correlation between RAPD haplotypes and hyphal anastomosis was verified. These results show the importance of future studies on the sexual cycle of E. salmonicolor, since hyphal fusion, which precedes the formation of heterokaryons (sexual and parasexual reproduction) that could be responsible for the genetic variability in this species.

Cariótipos de oito linhagens selvagens do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae var. anisopliae foram obtidos em gel, por eletroforese em campo pulsado. As linhagens foram isoladas de insetos provenientes de seis estados brasileiros. As moléculas de DNA cromossômico de três linhagens foram separadas em sete bandas e, de cinco linhagens, em oito bandas. Polimorfismo de tamanho cromossômico também foi observado. O tamanho do DNA cromossômico de todas as linhagens variou de 7,7 a 0,9 Mb, utilizando-se DNA cromossômico de Aspergillus nidulans como padrão. O tamanho do genoma total foi estimado em pelo menos 29,7 Mb. Algumas correlações entre semelhanças e diferenças no cariótipo eletroforético e a ocorrência do ciclo parassexual como também a especificidade com insetos hospedeiros foram discutidas.

Electrophoretic karyotypes of eight wild-type strains of Metarhizium anisopliae var. anisopliae were obtained by pulsed-field gel electrophoresis. These strains were isolated from insects of six different Brazilian states. The chromosomal DNA molecules of three strains were separated into seven bands and of five strains into eight bands. Chromosome length polymorphisms were also observed. The size of the chromosomal DNA of all strains varied between 7.7 and 0.9 Mb using the Aspergillus nidulans chromosomes as size standards. The total genome size of these strains was estimated in at least 29.7 Mb. Some correlations between differences in karyotype and occurrence of parasexual cycle likewise the host specificity were discussed.

A linhagem Abnc de A. nidulans é portadora do gene bncA1 ("binucleated conidia"), que confere a característica de conídios bi e trinucleados, além de apresentar uma região duplicada do cromossomo I e translocada para o cromossomo II (I->II), gerando instabilidade genética com formação de setores deteriorados. Este trabalho analisou citologicamente a conidiogênese dos variantes deteriorados isolados da linhagem Abnc de A. nidulans, observando a ocorrência de alterações das estruturas que compõe o conidióforo e as variações no número de núcleos dos esterígmas e conídios. As análises citogenéticas da conidiogênese foram realizadas com períodos pré-determinados, sendo efetuada a coloração de Giemsa para observação dos núcleos, e análise por Microscopia Eletrônica de Varredura, para observação das estruturas que compõe o conidióforo. Os variantes deteriorados analisados apresentaram alterações na estrutura das células-pé, métulas e fiálides, redução do número de conidióforos e conídios, e formação de conidióforos secundários. Estas alterações no conidióforo podem estar relacionadas com os genes para o desenvolvimento, bristle e com atividade das proteínas NIMA e NINXcdc2 (envolvidas com o ciclo regulatório da morfogênese) as quais induzem a expressão de brislte, estabelecendo o caminho para a regulação e controle da expressão dos genes durante o desenvolvimento do conidióforo.

The Abnc strain of A. nidulans carries the bncA1 gene (binucleated conidia), which induces the formation of binucleate and trinucleate conidia, displaying a chromosome I duplicated area and shifted to the chromosome II (I->II), and bringing forth genetic instability with degenerated sectors. This work has considered in a cytological level the conidiogenesis of the deteriorated variants isolated from the Abnc strain of A. nidulans, observing the event at the level of structural alterations, which composes the conidiophore, and the variations in the number of sterigmata and conidia nuclei. Cytogenetic analyses of conidiogenesis were accomplished in predetermined periods, under Giemsa stain, to observe the nuclei and analysis through the Scanning Electronic Microscopy, and also the structures that composes the conidiophore. The analyzed, deteriorated variants presented alterations in the cell-foot, metulae and phialides structure, conidiophore number and conidias reduction, and the formation of secondary conidiophores. These alterations can be related to genes for the development, bristle, and activities of NIMA e NINXcdc2 (involved in morphogenesis regulatory cycle) that induce the expression of brislte, establishing the link to the regulation and expression of the genes control throughout the conidiophore development.

Com o objetivo de se caracterizar o processo de recombinação somática em Trichoderma pseudokoningii, foram realizados cruzamentos via anastomose de hifas entre duas linhagens desta espécie, contrastantes para os marcadores de auxotrofia. Foram realizados quatro cruzamentos, sendo analisadas um total de 1052 colônias obtidas a partir de suspensões de conídios provenientes das colônias heterocarióticas. Foram analisadas sessenta e oito colônias recombinantes em quatro gerações de crescimento, sendo verificados os marcadores de auxotrofia. Das 68 colônias, 58 se mostraram estáveis após quatro gerações de crescimento e as colônias restantes permaneceram instáveis, revertendo para as marcas de uma das linhagens parentais. A maioria das colônias se mostrou instável através das gerações de subcultivo, e após quatro gerações de crescimento estas apresentaram as marcas de auxotrofia leu ino met (auxotrofia para leucina, inositol e metionina, respectivamente). As colônias recombinantes instáveis apresentaram bordas irregulares de crescimento, esporulação esparsa e a freqüente formação de setores. Os resultados sugerem a ocorrência de mecanismos de recombinação no heterocário (recombinação somática), diferente daqueles descritos para o ciclo parassexual ou parameiose, sendo proposto a ocorrência da degradação no heterocário de núcleos provenientes de uma das linhagens parentais (parental não prevalente) e a incorporação de fragmentos cromossômicos nos núcleos íntegros da outra linhagem parental (parental prevalente). No entanto a parameiose, como originalmente descrita, não pode ser excluída.

Crossing experiments via hyphal anastomosis between two strains contrasting for auxotrophic markers of Trichoderma pseudokoningii were conducted to characterize the somatic recombination process in this specie. Four crossings were made and a total of 1052 colonies obtained from conidial suspensions of the heterokaryotic colonies were analyzed. Sixty-eight recombinant colonies, from four growing generations, were analyzed for the auxotrophic markers. Of the 68 colonies analyzed, 58 were stable after four generations and the remainders were unstable, reverting to one of the parentals. Most of the recombinant colonies were unstable through subculture and after four growing generations they showed the leu ino met markers (auxotrophic for leucin, inositol and metionin respectively). The unstable recombinant colonies showed irregular growing borders, sparse sporulation and frequent sector formation. The results suggest the occurrence of recombination mechanisms in the heterokaryon (somatic recombination), different from those described for the parasexual cycle or parameiosis. Therefore, we proposed the ocurrence of nuclei degradation from one parental (non prevalent parental) in the heterokaryon and that the resulting chromosomal fragments may be incorporated into whole nuclei of the another parental (prevalent parental). However the parameiosis as originally described cannot be excluded.

Fungos da família Herpotrichiellaceae, agentes comuns de cromoblastomicose e feohifomicose, foram isolados de amostras de solo e de material vegetal em decomposição, durante duas coletas realizadas na propriedade do Centro Nacional de Pesquisa de Florestas/EMBRAPA, localizada em Colombo, PR, Brasil. Após o isolamento, os fungos foram submetidos às análises óticas macro e microscópicas e eletrônica de varredura, além do estudo de seus padrões nutricionais. Das 17 colônias de fungos isoladas, 3 (17,6%) foram identificadas como espécies de importância clínica, tais como: Cladophialophora bantiana (Sacc.) de Hoog et al, Fonsecaea pedrosoi (Brumpt) Negroni e Phialophora verrucosa Medlar. As identificações basearam-se nos resultados dos testes fisiológicos e na comparação da morfologia dos isolados com linhagens referência do CBS (Centraal Bureau voor Schimmelcultures). Esta investigação revelou a existência sapróbia de espécies de fungos conhecidas como agentes de cromoblastomicose e feohifomicose. Tais doenças são tidas como autóctones na região estudada.

Herpotrichiellaceous fungi, common agents of chromoblastomycosis and phaeohyphomycosis, were searched in samples of rotten wood, leaf littler, bark and soil of the rhizosphere, collected in the Centro Nacional de Pesquisas de Florestas/EMBRAPA, Colombo, PR, Brazil. Morphological analyses of macro, optic and scanning electron microscopy, as well as the determination of the nutritional pattern of the isolated strains were carried out for a taxonomical study. In a total of 17 colonies, 3 isolates (17.6%) were identified as species of medical relevance: Cladophialophora bantiana (Sacc.) de Hoog et al., Fonsecaea pedrosoi (Brumpt) Negroni and Phialophora verrucosa Medlar. The identifications were based on the results of the analyses and on the comparison with CBS (Centraal Bureau voor Schimmelcultures) reference strains. This investigation revealed the saprophytic existence of species known as agents of chromoblastomycosis and phaeohyphomycosis. These diseases are considered autochthonous in the studied area.

Linhagens de Aspergillus nidulans que apresentam duplicação cromossômica Dp(I-II) foram caracterizadas por eletroforese em campo pulsado. Foram analisados variantes morfologicamente deteriorados e melhorados. O cariótipo eletroforético demonstrou que em ambas as linhagens duplicadas (A e B) a banda de 4,2 Mb, que corresponde ao cromossomo II, não estava presente e foi encontrada uma nova banda. Foram feitas hibridizações usando os genes uapA (cromossomo I) e wA (cromossomo II), que demonstraram que a nova banda corresponde ao cromossomo II mais o segmento duplicado do cromossomo I. O tamanho da duplicação foi determinado como aproximadamente 1,0 Mb. A análise das bandas cromossômicas da linhagem morfologicamente melhorada mostrou que o segmento duplicado do cromossomo I foi completamente perdido. Os variantes morfologicamente deteriorados V9 e V17 mostraram o mesmo cariótipo eletroforético apresentado pelas linhagens duplicadas. Contudo, o variante deteriorado V5 perdeu parte do cromossomo I e apresentou um rearranjo envolvendo o cromossomo V. Esse rearranjo pode ter resultado do tratamento mutagênico usado para a obtenção dos marcadores genéticos. Os resultados obtidos nesse trabalho demonstram que a técnica de eletroforese em campo pulsado é uma ferramenta excelente para a localização de rearranjos cromossômicos.

Pulsed-field gel electrophoresis was used to characterize strains of Aspergillus nidulans with a chromosomal duplication Dp(I-II). Morphologically deteriorated and improved variants of these strains were also analyzed. The electrophoretic karyotype demonstrated that in two duplicated strains (A and B) the 4.2 Mb band, which corresponds to chromosome II, was absent and a new band was observed. Hybridization studies using the uapA (chromosome I) and wA (chromosome II) genes demonstrated that the new band corresponded to chromosome II plus the duplicated segment of chromosome I. The size of the chromosomal duplication was approximately 1.0 Mb. Analysis of the chromosomal bands of a morphologically improved strain showed that the duplicated segment of chromosome I was completely lost. The morphologically deteriorated variants V9 and V17 had the same karyotype as the duplicated strains. However, the deteriorated variant V5 lost part of chromosome I and had a rearrangement involving chromosome V. This rearrangement may have resulted from the mutagenic treatment used to obtain the genetic markers. Pulsed-field gel electrophoresis was found to be an excellent tool for locating chromosomal rearrangements.

Com o objetivo de caracterizar os produtos de fusão de protoplastos de leveduras com características de importância para a indústria vinícola e seus segregantes, foram empregadas as técnicas de separação de bandas cromossômicas por eletroforese e de RAPD (amplificação ao acaso de DNA polimórfico). O cariótipo eletroforético foi realizado pelo método CHEF ("contour-clamped homogeneous eletric field eletrophoresis"), constatando-se a complementação de bandas cromossômicas no produto de fusão e padrões de ambos os parentais e padrões intermediários nos segregantes. A análise do padrão de amplificação dos fragmentos de DNA com dois primers evidenciou um padrão de bandas complementares nos produtos de fusão (diplóide) e padrão de bandas de um e de outro parental ou mesmo bandas intermediárias nos segregantes.

In order to characterize fusion products from yeast protoplasts and their segregants, with important features to the wine making industry, electrophoretic karyotyping and RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) were utilized. Electrophoretic karyotyping was performed by the CHEF ("contour-clamped homogeneous electric field electrophoresis") method, which allowed the detection of chromosomal band complementation in fusion products and the presence of patterns of both parental and intermediary strains in segregants. By utilizing two primers, an amplification pattern of DNA fragments was obtained. While fusion products (diploid) showed a pattern of complementary bands, segregants showed bands of either parental strains or even intermediary bands