RESUMO O objetivo deste estudo foi isolar Clostridium perfringens e C. difficile em cachorro-do-mato (Cerdocyon thous) da região Nordeste do Brasil. Amostras de fezes de 18 cachorros-do-mato mantidos em cativeiro e oriundos de quatro estados da região Nordeste do Brasil (Alagoas, Bahia, Paraíba e Pernambuco) foram coletadas e submetidas a isolamento de C. perfringens e C. difficile. As colônias sugestivas de C. perfringens foram analisadas para os genes que codificam as principais toxinas de C. perfringens (alfa, beta, épsilon e iota), toxina beta-2 (cpb2), enterotoxina (cpe) e NetB- (netB) e NetF- (netF). As cepas de C. difficile foram analisadas por PCR-multiplex para o gene tpi, toxinas A (tcdA) e B (tcdB) e um gene de toxina binária (cdtB). Alíquotas de amostras de fezes positivas para C. difficile toxigênico foram submetidas a um ELISA comercial para avaliar a presença de toxinas A/B. Clostridium perfringens (tipo A) foi isolado de cinco (27%) amostras, e apenas uma amostra foi positiva para o gene da toxina beta-2 (cpb2). Duas (11%) amostras de fezes foram positivas para C. difficile, mas negativas para toxinas A/B. Estes dois canídeos silvestres também foram positivos para C. perfringens tipo A. Este é o primeiro relato de C. difficile em cachorro-do-mato.

ABSTRACT The aim of the present study was to isolate Clostridium perfringens and C. difficile in crab-eating fox (Cerdocyon thous) from Northeastern Brazil. Stool samples of 18 captive crab-eating foxes from four states of Northeastern Brazil (Alagoas, Bahia, Paraíba e Pernambuco) were collected and subjected to C. perfringens and C. difficile isolation. Suggestive colonies of C. perfringens were then analyzed for genes encoding the major C. perfringens toxins (alpha, beta, epsilon and iota), beta-2 toxin (cpb2), enterotoxin (cpe), and NetB- (netB) and NetF- (netF) encoding genes. C. difficile strains were analyzed by multiplex-PCR for a housekeeping gene (tpi), toxins A (tcdA) and B (tcdB) and a binary toxin gene (cdtB). Unthawed aliquots of stool samples positive for toxigenic C. difficile were subjected to a commercial ELISA to evaluate the presence of A/B toxins. Clostridium perfringens (type A) was isolated from five (27%) samples, and only one sample was positive for beta-2 enconding gene (cpb2). Two (11%) stool samples were positive for C. difficile, but negative for A/B toxins. These two wild canids were also positive for C. perfringens type A. This is the first report of C. difficile in crab-eating fox.

Teve-se por objetivo avaliar e padronizar as metodologias in vitro, ELISA e ToBI-test modificado, para a análise de toxoide épsilon, em comparação com a metodologia in vivo TCP. Foram utilizados os seguintes toxoides épsilon: padrão NIBSC e os lotes 375/07, 532/08, 551/08, 373/07 e 378/07, os quais foram avaliados por métodos in vivo, TCP, e in vitro, ELISA e ToBI-test. A análise do título de toxoide épsilon por meio dos métodos in vitro foi realizada a partir de uma curva-padrão, estabelecida previamente. Os principais resultados mostram que os valores de absorbância foram semelhantes para todos os toxoides, não apresentando diferença significativa entre os toxoides mais concentrados e menos concentrados. No ToBI-test, o coeficiente de correlação de 96,76%, obtido na curva-padrão, demonstra a eficiência da curva para avaliação do toxoide épsilon. O coeficiente de correlação entre os títulos de toxoide obtidos pelo TCP e ToBI-test foi superior a 90%. Conclui-se que o tipo de ELISA utilizado não apresenta poder discriminativo para toxoides com diferentes concentrações, inviabilizando a técnica para esse fim. O ToBI-test pode ser utilizado como um método de triagem sensível e eficaz para a detecção de toxoide épsilon de C. perfringens tipo D.

This study aimed to assess and standardize the ELISA and modified ToBI test in vitro methods in order to verify the potency of epsilon toxicoid in comparison with the in vivo TCP method. The following epsilon toxoids were used: NIBSC standard from batches 375/07, 532/08, 551/08, 373/07 and 378/07. These were evaluated using a TCP test, ELISA and ToBI tests. The results indicate that the correlation ratio between the dilutions of standard NIBSC toxicoid and absorbance values of 89.44% obtained with the ELISA method support the use of the curve to evaluate epsilon toxoids. However, it was observed that the absorbance values were similar for all toxoids, thus presenting no significant difference between higher and lower concentration toxoids. For the ToBI test, the correlation ratio of 96.76, obtained in the curve pattern, demonstrates the effectiveness of the curve to be used in the epsilon toxoid evaluation. The correlation ratio between the titration degrees of toxoids obtained through TCP and ToBI tests was higher than 90%. It is concluded that the type of ELISA test used does present discriminative power for toxoids with different concentrations, which does not support the use of this technique for such a purpose. The ToBI test can be used as a screening method for it is sensitive and effective to detect epsilon toxicoid produced by C. perfringens type D.

RESUMO Clostridium novyi tipo B é o patógeno responsável pela hepatite necrótica, causada pela ação da toxina alfa. O controle desta enfermidade é baseado na imunização dos animais com vacinas que contenham na sua composição toxóide alfa de C. novyi tipo B. O teste de potência deste imunógeno é realizado a partir de soros de coelhos imunizados, por meio da técnica de soroneutralização em camundongos. Portanto objetivou-se padronizar um teste de potência de toxóide alfa de C. novyi tipo B em linhagem de célula VERO, como método alternativo ao bioensaio animal. O coeficiente de correlação obtido pelas técnicas in vitro e in vivo foi de 98,38%, indicando ser possível a utilização do modelo estudado na substituição do modelo animal para teste de potência de toxoide alfa de C. novyi tipo B.

ABSTRACT Clostridium novyi type B is the pathogen responsible for necrotizing hepatitis caused by the action of alpha toxin. The control of this disease is based on immunization of animals with vaccines containing alpha toxoid of C. novyi type B in its composition, and the evaluation of this toxoid is made by seroneutralization in mice. Therefore, the present study was aimed to standardize a test of the power of alpha toxoid of C. novyi type B cell line VERO, as an alternative to animal bioassay The correlation coefficient obtained by the in vitro and in vivo techniques was 98.38%, indicating the possible use of the model to replace the animal model to test the power of alpha toxoid of C. novyi type B.

Padronizou-se um teste para detecção de anticorpos neutralizantes in vitro, em cultura de células. O modelo in vitro mostrou-se mais sensível que os testes com animais, permitindo a detecção de títulos de toxina e antitoxina alfa mais baixos. Os títulos observados na soroneutralização in vivo e in vitro, apresentaram correlação de 99,12%, demonstrando ser a cultura de células uma alternativa viável na avaliação da potência de vacinas, triagem de sementes vacinais e titulação de toxina alfa de Clostridium septicum.

Aiming to investigate in vitro alternatives, a test for neutralizing antibody detection using cell culture was developed. This test was more sensitive than previous animal models, allowing for detection of substantially lower alpha toxin and anti-alpha toxin titers. Titers observed during in vivo and in vitro seroneutralization had a correlation of 99.12%, indicating that cell culture is a viable alternative in the evaluation of vaccine potency, screening of vaccinal seeds, and Clostridium septicum alpha toxin titration.

RESUMO As mionecroses são enfermidades altamente fatais, representadas pelo carbúnculo sintomático e edema maligno. Com o objetivo de determinar a ocorrência dos diferentes clostrídios envolvidos nas mionecroses em bovinos no Brasil, foi realizado um estudo retrospectivo a partir de 30 casos suspeitos de carbúnculo sintomático e edema maligno. Empregou-se a técnica de estreptavidina biotina peroxidase em tecidos de bovinos fixados em formol e incluídos em parafina de arquivos de patologia de diferentes estados do país. Foram detectados 21 Clostridium chauvoei (70%), cincoClostridium septicum(17%), seguidos de doisC. chauvoeiassociado aoC. septicum (7%), um C. chauvoei mais Clostridium sordellii (3%) e um C. chauvoei mais Clostridium novyi tipo A (3%). Este é o primeiro diagnóstico de C. novyi tipo A no Brasil, e o primeiro relato da ocorrência de C. chauvoei associado à lesão no miocárdio. Os achados da maior ocorrência de C. chauvoei e C. septicum corroboram com estudos anteriores no país. Estes dados sobre a ocorrência dos agentes responsáveis pelas mionecroses em diferentes estados do país são de extrema importância frente às decisões relativas ao controle dessas enfermidades.

ABSTRACT Clostridial myonecroses are highly fatal diseases, characterized by black leg and malignant oedema. In order to determine the occurrence of the different agents involved in Brazilian clostridial myonecrosis, a retrospective study was conducted concerning 30 suspected cases of blackleg and gas gangrene using a streptavidin-biotin peroxidase technique in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues of cattle from the archives of pathology of different states of Brazil. The clostridia predominantly detected wereClostridium chauvoei(70%), followed by Clostridium septicum (5 cases or 17%), C. chauvoei plus C. septicum (2 cases or 7%), C. chauvoei plus Clostridium sordellii (1 case or 3%), C. chauvoei plus Clostridium novyi type A (1 case or 3%). This is the first diagnosis of C. novyi type A in Brazil. The findings of the higher occurrence of C. chauvoei and C. septicum concur with previous works in Brazil. This article also includes the first report in Brazil of the occurrence of C. chauvoei associated with a lesion in the myocardium. Thus, this study supplies important data about the occurrence of the agents responsible for clostridial myonecrosis in different states of Brazil, these data being important for decisions relative to control of these diseases.

Clostridium perfringens é um habitante normal da microbiota intestinal de frangos, sendo um agente potencialmente patogênico, causador de enterite necrótica e colangio-hepatite. A concentração inibitória mínima (CIM) de sete drogas utilizadas na terapêutica, como agentes promotores de crescimento ou na prevenção de coccidiose foi determinada pelo método de diluição em ágar para 55 estirpes de C. perfringens isoladas do intestino de frangos de corte. Todas as estirpes revelaram alta sensibilidade à penicilina, avilamicina, narasin e monensina, apenas 7,3% demonstraram CIM intermediário para lincomicina e 89.1% foram consideradas sensíveis. Para tetraciclina e bacitracina, 41,8% e 47.3% das amostras, respectivamente, foram consideradas resistentes.

Clostridium perfringens is a normal inhabitant of the intestinal tract of chickens as well as a potential pathogen that causes necrotic enteritis and colangio hepatitis. The minimum inhibitory concentration (MIC) of seven different compounds used for therapy, growth promotion or prevention of coccidiosis was determined by agar dilution method for 55 C. perfringens strains isolated from the intestines of broiler chickens. All strains showed high susceptibility to penicillin, avilamycin, monensin and narasin. Only 7.3% of the strains showed an intermediated sensitivity to lincomycin, and 49 (89.1%) were considered susceptible. For tetracycline and bacitracin, 41.8% and 47.3% of strains, respectively, were considered resistant.

RESUMO Clostridium perfringens é o agente responsável pela enterite necrótica em leitões, caracterizada por diarréia, perda de peso e morte. O presente estudo objetivou a tipificação de C. perfringens a partir de fezes de leitões diarréicos pela técnica da PCR multiplex, utilizando iniciadores específicos para os genes das toxinas alfa (cpa), beta (cpb), beta-2 (cpb-2), épsilon (etx), iota (ia) e enterotoxina (cpe). Foram utilizadas 65 amostras fecais de leitões com idade variando entre sete a 36 dias. O material foi semeado em ágar gema de ovo com cicloserina. Colônias sugestivas de C. perfringens foram submetidas à coloração pelo método de Gram e caracterização bioquímica. Após certificado o crescimento e pureza, os clostrídios foram subcultivados em ágar sangue. Os extratos de DNA para amplificação da PCR foram obtidos por lise direta de uma colônia isolada, não sendo realizada a purificação do DNA. Bacilos anaeróbicos Gram-positivos foram isolados de 59 das 65 amostras fecais testadas. Vinte e sete foram identificadas como C. perfringens e tipificadas, sendo 21 (77,8%) do tipo A, cinco destas apresentavam o gene cpb-2; cinco (18,5%) eram do tipo C, quatro destas apresentavam o gene cpb-2; uma amostra (3,7%) era do tipo D e nenhuma foi positiva para o gene iA ou cpe. Neste estudo Clostridium perfringens tipo A foi o mais prevalente em fezes de leitões diarréicos.

ABSTRACT Clostridium perfringens causes necrotic enteritis in piglets, characterized by diarrhea, weight loss and death. The purpose of this study was to genotype C. perfringens strains isolated from diarrheic piglets by multiplex PCR, using specific primers for genes of alpha (cpa), beta (cpb), beta-2 (cpb2), epsilon (etx), enterotoxin (cpe) and iota (ia) toxins. Sixty-five samples from diarrheic piglets ranging from 7 to 36 days of age were studied. The material was seeded into egg-yolk agar with cicloserine. Colonies with suspicion of C. perfringens were subjected to Gram staining and biochemical identification. After certification for purity, bacteria were subcultivated in blood agar and one single colony was used as a DNA template for PCR amplification after direct bacterial lysis. No DNA purification procedure was used. Anaerobic Gram-positive bacilli were isolated from 59 out of 65 fecal samples tested. Among these, 27 were identified as C. perfringens and typified by multiplex PCR. Twenty-one (77.8%) of these isolates were type A, of which 5 had thecpb-2 gene. Five (18.5%) were type C and 4 of them contained the cpb-2 gene. One (3.7%) was type D, while no strains were positive for ia or cpe genes. This study demonstrated that Clostridium perfringens A is the most common type in feces of diarrheic piglets.

A prototoxina epsílon de Clostridium perfringens tipo D foi produzida, purificada e destoxificada por estoiquiometria. Diferentes quantidades de iodo foram incorporadas à estrutura protéica da prototoxina e a toxicidade dos derivados foi analisada em estudos in vivo. Verificou-se que a toxicidade diminuiu à medida que os átomos de iodo foram incorporados à prototoxina. A análise eletroforética demonstrou a estabilidade das amostras quando armazenadas a 4ºC, -20ºC e -80ºC. A prototoxina iodada foi estocada por um período de quatro meses.

Purified epsilon prototoxin of Clostridium perfringens type D was produced, purified, and detoxified by the stoiechiometric method of non-radioactive iodine incorporation. Different degrees of iodination were perfomed and the toxicity of the derivatives were analysed by in vivo studies. Toxicity decreased inversely to the iodine incorporation. Eletrophoretic analysis showed different levels of stability of samples kept under different temperatures 4ºC, - 20ºC, and -80 ºC. The iodinated prototoxins were stocked for a period of four months.

RESUMO Clostridium septicum, um organismo ubiquitário, é o principal patógeno responsável pelo quadro de edema maligno. Devido à ação citotóxica da toxina alfa as infecções geralmente são fatais. Para o controle da doença é utilizada a vacinação com toxóide alfa. Neste trabalho, avaliouse a eficiência de 12 vacinas comerciais contra clostridioses, que continham em sua composição C. septicum, através da soroneutralização em camundongos com soros de coelhos e bovinos vacinados. As vacinas codificadas como T1, T2, T4, T10 e T11 apresentaram títulos de antitoxina alfa superiores ao nível mínimo exigido pelo teste de 2,5 UI/mL. As demais vacinas não induziram a formação de anticorpos. Em sua maioria, as vacinas comercializadas no Brasil, contra C. septicum, foram ineficientes em estimular resposta imune compatível com os níveis de teste recomendados para controle deste produto.

ABSTRACT Clostridium septicum, a ubiquitous organism, is the main pathogen causing malignant edema. Because of its strong cytotoxic alpha toxin, infections are often lethal. Losses in livestock can be prevented through vaccination with alpha-toxoid vaccines. The antibody response to the C. septicum component of 12 commercial vaccines was evaluated by the mouse serum neutralization test using rabbit and bovine sera. The vaccines coded as T1, T2, T4, T10 and T11 induced titers of alpha antitoxin higher than the minimum test level of 2.5 IU/mL. None of the other vaccines induced the formation of antibodies. The majority of the C. septicum vaccines commercialized in Brazil were unable to induce an immune response as recommended for the control of this product.

Padronizou-se uma técnica de reação em cadeia da polimerase múltipla (PCR multiplex) para detecção de Clostridium chauvoei e Clostridium septicum em culturas puras. Foram utilizados pares de iniciadores para segmentos específicos dos genes que codificam a flagelina de C. chauvoei e a toxina alfa de C. septicum. Para avaliaçã o da PCR multiplex, foram testados 16 isolados clínicos de C. chauvoei e 15 isolados de C. septicum provenientes de ruminantes, quatro sementes vacinais de cada um desses agentes. Amostras de referência de ambos os microrganismos foram usadas como controle. Para avaliar a especificidade, DNAs genômicos dos seguintes microrganismos foram usados: C. sordellii, C. novyi tipo A, C. novyi tipo B, C. perfringens tipo A, C. haemolyticum, C. botulinum tipo D, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli e Salmonella typhimurium. Todos os isolados e sementes vacinais de C. chauvoei e C. septicum foram detectados pela técnica. Não foram observadas reações cruzadas com as outras espécies de clostrídios, outras espécies bacterianas ou entre C. Chauvoei e C. septicum. As menores concentrações de DNA de C. chauvoei e C. septicum detectadas foram 45pg/µl e 30pg/µl, respectivamente. A PCR multiplex pode ser utilizada para a identificação específica de C. chauvoei e C. septicum em culturas puras.

Multiplex PCR was optimized to detect Clostridium chauvoei and Clostridium septicum in pure cultures. In each reaction, a pair of primers for a specific segment of the flagellin gene of C. chauvoei and a pair of primers for a specific segment of alpha toxin gene of C. septicum were employed. Reference strains of both microorganisms were used as control. The multiplex PCR was evaluated by testing 16 clinical isolates of C. chauvoei from ruminants, 15 clinical isolates of C. septicum from ruminants and, four vaccine strains of each one of these agents. Reference strains of both microorganisms were used as control. To evaluate the specificity, genomic DNA of the following microorganisms was used: C. sordellii, C. novyi type A, C. novyi type B, C. perfringens type A, C. haemolyticum, C. botulinum type D, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, and Salmonella typhimurium. All the isolates and vaccine strains of C. chauvoei and C. septicum were positive by PCR assay and cross reactions were not observed with the other species of clostridia, the other bacterial species or amongst both investigated agents. The smallest concentrations of DNA detected from C. chauvoei and C. septicum were 45pg/µl and 30pg/µl, respectively. The multiplex PCR was useful for the specific identification of C. chauvoei and C. septicum in pure cultures.

Descreve-se a aplicabilidade de uma técnica de imunofluorescência direta, para o diagnóstico de mionecroses causadas por clostrídios, a partir de tecidos fixados em formol e incluídos em parafina. Essa técnica pode auxiliar no diagnóstico do carbúnculo sintomático e da gangrena gasosa, contribuindo para determinar a real prevalência dessas doenças no país.

This report describes a case of bovine enterotoxaemia in Morro da Garça, Minas Gerais, Brazil. Clostridium perfringens type D was isolated in pure culture and was characterized by biochemical reactions and PCR. By the mouse neutralization test, the presence of epsilon toxin from intestinal content was detected.

Empregaram-se os métodos cromatográficos de afinidade metálica e de imunoafinidade para purificação da toxina beta em sobrenadante de cultivo de Clostridium perfringens tipo C. Observaram-se, na eletroforese das primeiras frações eluidas nos dois métodos de purificação, uma banda de peso molecular aproximado de 38kDa, característica da forma monomérica de toxina beta de Clostridium perfringens tipo C, e bandas de peso moleculares superiores, referentes às suas formas oligoméricas. Maior rendimento foi obtido com a utilização do método de imunoafinidade.

Foi adotado o tratamento intermitente da tuberculose com isoniazida em 240 bovinos de um rebanho naturalmente infectado pelo M. bovis. No início do tratamento 36,6% dos animais foram reagentes positivos e 2,9% inconclusivos. Todos os animais do rebanho receberam isoniazida por via oral em doses de 25mg/kg de peso vivo, administrada três vezes por semana, às segundas, quartas e sextas-feiras, durante 10 meses, perfazendo 120 doses. A cura de 98,9% dos animais tratados foi verificada por meio da dessensibilização alérgica realizada pela tuberculinização e controle bacteriológico de 39 animais abatidos. O tratamento neste rebanho não resultou em seleção de cepas resistentes a isoniazida, comprovada pelo teste de sensibilidade a essa droga, realizado em cultura de M. bovis isolada de um animal não curado.

The intermittent treatment with isoniazid was adopted in 240 bovines from a naturally infected herd. At the beginning of the treatment, 36.6% of the animals were positive reactors and 2.9% inconclusive reactors. The drug was administered orally at a dose of 25mg/kg of live weight, three times a week (on Mondays, Wednesdays and Fridays) during 10 months in a total of 120 doses. The cure of 98.9% of the treated animals was verified by the allergic desensitization demonstrated through the tuberculin test and the bacteriological control of 39 slaughtered animals. The treatment in this herd did not cause selection of isoniazid-resistant strains as demonstrated by the isoniazid sensitivity test carried out in M. bovis culture isolated from a non-cured animal.

Diarrhea in suckling piglets caused by Clostridium perfringens type A was diagnosed in industrial (technified) swine farms of the states of Minas Gerais and São Paulo (Brazil), based on isolation and identification of bacterium by biochemical tests, detection of alpha toxin in animal bioassays, and PCR. This seems to be the first report of clostridial enterotoxaemia in piglets by C. perfringens type A in Brazil and allowed specific procedures to control the disease.