RESUMO: O objetivo deste estudo foi avaliar a adesão e invasão de células HeLa por amotras de Campylobacter spp. (total n=63) isoladas de frangos (n=4), cães (n=4), primatas não-humanos (n=16), porcos (n=9), fezes de bezerros (n=18), e trato genital de bovinos (n=12). Trinta e duas amostras foram capazes de aderir e 13 invadiram células HeLa. As amostras invasivas incluíram 1 de 4 isolados de cão, 4 de 16 isolados de primatas não-humano (2 C. jejuni e 2 C. coli), 1 de 9 C. coli isoladas de porcos e 7 de 18 C. fetus subsp. fetus isoladas de fezes de bezerros. Apenas 25% dos isolados de frango e de cão e 23% dos isolados de suínos foram capazes de aderir a células HeLa, propriedade exibida por 65% das cepas obtidas a partir de fezes de bezerros e por 83% das amostras isoladas de trato genital bovino. O fenótipo aderente foi observado em 5 de 19, 6 de 15 e 21 de 29 amostras de C. jejuni, C. coli e C. fetus subsp. fetus, respectivamente, enquanto que 3 de 19, 3 de 15 e 7 de 29 amostras foram adicionalmente capazes de invadir as células HeLa, respectivamente. Amostras de C. jejuni, C. coli e C. fetus subsp. fetus isoladas de fezes de animais foram capazes de aderir e invadir as células HeLa, enquanto amostras de C. fetus subsp. fetus isoladas a partir de amostras de trato genital bovino não foram invasivas, em células HeLa. O presente estudo mostrou que amostras de C. jejuni isoladas de primatas não-humanos e cães, C. coli isoladas de primatas não-humanos e porcos, e C. fetus subsp. fetus isolados a partir de fezes de bezerros foram capazes de aderir e invadir células HeLa. Além disso, a falta de capacidade invasiva de amostras de C. fetus subsp. fetus isoladas de trato genital bovino pode ser importante na patogênese das doenças das vias genitais causadas por esta bactéria.

ABSTRACT: The objective of this study was to evaluate the adherence to and invasion of HeLa cells by Campylobacter spp. strains (total n=63) isolated from chickens (n=4), dogs (n=4), non-human primates (n=16), pigs (n=9), calf feces (n=18), and bovine genital tracts (n=12). Thirty-two strains adhered to and 13 invaded HeLa cells. Invasive strains included 1 of 4 dog isolates, 4 of 16 non-human primate isolates (2 C. jejuni and 2 C. coli), 1 of 9 C. coli strains isolated from pigs, and 7 of 18 C. fetus subsp. fetus isolated from calf feces. Only 25% of chicken and dog isolates and 23% of pig isolates were able to adhere to HeLa cells, a property of 65% of strains obtained from calf feces and 83% of bovine genital tract-isolated strains. The adherent phenotype was observed in 5 of 19, 6 of 15, and 21 of 29 strains of C. jejuni, C. coli, and C. fetus subsp. fetus, respectively, whereas 3 of 19, 3 of 15, and 7 of 29 strains were additionally able to invade HeLa cells, respectively. C. jejuni, C. coli, and C. fetus subsp. fetus strains isolated from animal feces are able to adhere and invade HeLa cells, whereas C. fetus subsp. fetus strains isolated from the bovine genital tract were not invasive in HeLa cells. The present study showed that C. jejuni isolated from primates and dogs, C. coli isolated from non-human primates and pigs, and C. fetus subsp. fetus isolated from calf feces have the ability to adhere to and to invade HeLa cells. Moreover, the lack of invasive ability by C. fetus subsp. fetus strains isolated from the bovine genital tract could be important in the pathogenesis of the genital tract diseases caused by this bacterium.

Resumo: Os critérios mais aceitáveis para o diagnóstico das infecções intramamárias em bovinos incluem tanto os resultados da cultura bacteriológica e dos indicadores de inflamação. Portanto, a informação sobre os procedimentos mais adequados a serem utilizados para identificação dos quartos infectados é necessária. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar um conjunto de critérios para identificação da infecção intramamária em bovinos pelo exame microbiológico (amostras individuais de leite simples ou em duplicata, e amostras de leite compostas), e comparar o isolamento do patógeno nas amostras de leite coletadas por distintos critérios com a contagem de células somáticas (CCS). Os valores de corte da CCS determinados pela curva de característica de operação do receptor demonstraram que a coleta de amostras de leite em duplicata apresentou o maior valor do índice de Youden, especialmente quando considerou-se o quarto mamário infectado se pelo menos uma das amostras de leite da duplicata apresentou resultado bacteriológico positivo independentemente do patógeno isolado. O coeficiente kappa dos resultados do exame microbiológico das amostras de leite individuais (amostra simples S1 e S2) foi de 0,85±0,019, indicando que a coleta de amostras de leite individual, ou seja, a coleta de uma amostra de leite por quarto mamário, pode ser utilizada nos programas de controle de mastite. Por outro lado, a coleta de amostras de leite compostas para detectar patógenos causadores de mastite deve ser limitada à detecção dos patógenos principais, considerando os valores preditivos encontrados no presente estudo. Portanto, os resultados do presente estudo indicam que a CCS e o exame microbiológico do leite, embora considerados como os critérios mais aceitos para o diagnóstico da mastite, devem ser utilizados de forma integrada em programas de controle de mastite. Além disto, os critérios de coleta de amostras de leite para o diagnóstico da mastite pelo exame microbiológico e seus valores preditivos devem ser considerados nos programas de controle de mastite.

Abstract: The most acceptable criteria for diagnosing bovine intramammary infections include results of bacteriological culture and measures of inflammation. Therefore, information on the diagnostic characteristics of the procedures used to identify infected quarters is required. Thus, this study was designed to evaluate a set of criteria to classify the infectious status of an udder at the quarter (single and duplicate milk samples) and cow (composite milk sample) levels, and to compare the infectious status with somatic cell counts (SCCs) of the samples. Here, the SCC thresholds determined by receiver operating characteristic curve analysis had a higher Youden index using mammary quarter duplicate milk samples as the gold standard for testing compared with single quarter and composite milk samples, especially for samples for which at least one of the duplicates was microbiologically positive, regardless of the mastitis pathogen isolated. The kappa coefficient for bacteriological results of the single quarter milk samples (single S1 and S2) was 0.85±0.019, indicating that single quarter milk sampling can be useful in mastitis control programs. Therefore, the use of composite milk samples to detect mastitis pathogens may be limited to the detection of major pathogens, given their predictive values. Thus, our findings suggest that the milk SCCs and microbiological examinations, although regarded as the most reliable indicators of ongoing mastitis, should be used in an integrated manner in mastitis control programs. Furthermore, the accuracy of single, duplicate and composite microbiological analyses to diagnosis mastitis should be considered for its implications in mastitis control strategies.

The aim of this study was to evaluate the growth of the B. abortus reference strains and field isolates on media containing different inhibitor agents. Reference strains were seeded on tryptose agar containing: i-erythritol (1.0 mg/mL), fuchsin (20 μg/mL and 80 μg/mL), thionin (2.5 μg/mL and 10 μg/mL), rifampicin (200 μg/mL) and safranin O (200 μg/mL). Field isolates were tested only on media containing i-erythritol, rifampicin and thionin. Furthermore, each suspension was also inoculated on tryptose agar incubated in air, to test its ability to grow without CO2. Sensitivity to fuchsin was similar among reference strains evaluated. Growth of S19, 544 and 2308 but not RB51 were inhibited on media containing rifampicin. Medium with safranin O showed no inhibition for RB51, 544 and 2308, but it partially inhibited the S19 growth as well as medium containing i-erythritol. Treatment/control growth ratio for 2308 on tryptose agar containing thionin (2.5 μg/mL) was approximatelly 1.0, whereas S19 and RB51 showed 0.85 and 0.89 ratios, respectively. Growth of 544, S19 and RB51 but not 2308 was completely inhibited on medium with thionin (10 μg/mL). All field strains grew on medium containing i-erythritol, but were completelly inhibited by rifampicin. With exception of A1 (B. abortus biovar 3) all field isolates grew on medium with thionin, although some strains showed a treatment/control growth ratio of 0.75–0.80 (10 μg/mL). These results showed that tryptose agar with thionin, i-erythritol or rifampicin could be useful for differentiating vaccine, challenge and field strains of B. abortus.

A diarreia é uma das doenças mais frequentes de bezerros com até 30 dias de idade e é uma importante causa de perdas econômicas. Sua etiologia é complexa e envolve a interação de diversos fatores infecciosos, nutricionais, imunológicos, gerenciais e ambientais. Os principais sinais clínicos são a diarreia, desidratação progressiva, acidose metabólica, desequilíbrio de eletrólitos e balanço energético negativo com ou sem hipoglicemia, que se não tratados, levam à morte do animal. Escherichia coli se destaca como um importante enteropatógeno envolvido na síndrome diarreica. Cepas de E. coli patogênicas são classificadas em grupos ou patotipos, de acordo com a produção de fatores de virulência e mecanismos pelos quais causam doença. Já foram identificados cinco patotipos de E. coli associados à diarreia em bezerros: E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli enteropatogênica (EPEC), E. coli enterohemorrágica (EHEC), E. coli produtora de toxina Shiga (STEC) e E. coli necrotoxigênica (NTEC). Nesse artigo apresentamos as principais características e os atuais conhecimentos sobre os patotipos de E. coli causadores de diarreia em bezerros.

Diarrhea is one of the most frequent diseases in calves up to 30 days of age and is a major cause of economic losses. Its etiology is complex and involves the interaction of various infectious, nutritional, immunological, environmental and managerial factors. The main clinical signs are diarrhea, progressive dehydration, metabolic acidosis, electrolyte imbalance and negative energy balance with or without hypoglycemia, which if left untreated, results in death of the animal. Escherichia coli stands as an important enteropathogen involved in diarrheal syndrome. Pathogenic E. coli strains are classified into groups or pathotypes based on the production of virulence factors and on the mechanisms by which they cause diarrhea. There are five E. coli pathotypes associated with diarrhea in calves: enterotoxigenic E. coli (ETEC), enteropathogenic E. coli (EPEC), enterohemorrhagic E. coli (EHEC), Shiga toxin - producing E. coli (STEC) and necrotoxigenic E. coli (NTEC). In this article, we present the main characteristics and an update on E. coli pathotypes causing calf diarrhea.

Para a produção de anticorpos monoclonais contra Campylobacter fetus subsp. venerealis foram utilizadas as linhagens de células de mieloma Sp2/0-Ag14 e células de baço de camundongos BALB/c imunizados com sonicado de C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354. A detecção dos anticorpos monoclonais foi realizada por ELISA indireto utilizando antígeno sonicado de C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354. A clonagem foi realizada por diluição limitante e os clones foram caracterizados por ELISA indireto utilizando um painel de bactérias escolhidas em função da prevalência e habitats: C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354, C. fetus subsp. fetus ADRI 1812, C. sputorum biovar sputorum LMG 6647, C. lari NCTC 11352 e Arcobacter skirrowii LMG 6621; e no "western blotting" utilizando antígenos sonicados de C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354 e C. sputorum biovar sputorum LMG 6647. Foram obtidos 15 clones produtores de anticorpos anti- C. fetus subsp. venerealis das classes IgM (1) e IgG (14). Quatro clones dentre os 15 clones obtidos foram produtores de anticorpos monoclonais espécie-específicos: dois clones reagiram com maior especificidade contra C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354 e dois clones reagiram com maior especificidade contra C. fetus subsp. fetus ADRI 1812. Nenhum dos clones reagiu contra C. sputorum biovar sputorum LMG 6647, comprovando a especificidade dos anticorpos monoclonais testados. Todos os clones reconheceram uma proteína de massa molecular de aproximadamente 148 kDa no sonicado de C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354.

Myeloma cells Sp2/0-Ag14 and spleen cells from BALB/c mouse immunized with sonicated Campylobacter fetus subsp. venerealis NCTC 10354 were fused with polyethylene glycol (PEG) for the selection of clones producing antibodies. Clones were obtained by limiting dilution and screened for the production of specific antibodies to C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354 by indirect ELISA and western blot against a panel of bacteria: C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354, C. fetus subsp fetus ADRI 1812, C. sputorum biovar sputorum LMG 6647, C. lari NCTC 11352, and Arcobacter skirrowii LMG 6621 for the ELISA and C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354 and C. sputorum biovar sputorum LMG 6647 for the western blotting. Fifteen clones producing monoclonal antibodies (MAbs) anti-C. fetus subsp. venerealis of the IgM (1) and IgG (14) classes were further screened for species-specificity. Four clones of the 15 obtained were producers of species-specific monoclonal antibodies (MAbs): two were specific for C. fetus subsp. venerealis and two were specific for C. fetus subsp. fetus. None of the clones were reactive against C. sputorum biovar sputorum LMG 6647. All clones recognized a protein with molecular mass of approximately 148 kDa from lysed C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354.

O presente estudo avalia a interferência do teste de tuberculinização no teste do interferon gama (INFg), estima a sensibilidade e a especificidade do INFg em condições brasileiras e simula a utilização dos testes múltiplos usando a tuberculinização comparada e o teste do INFg. Trezentos e cinquenta animais oriundos de dois rebanhos livres e dois rebanhos positivos foram submetidos à tuberculinização comparada e ao teste de INFg. A tuberculinização comparada foi realizada utilizando PPD aviária e bovina. O teste de INFg foi realizado utilizando o kit Bovigam® (CSL Veterinary, Austrália) de acordo com as especificações do fabricante. A sensibilidade e especificidade do teste de INFg foram calculadas pelo Modelo Bayesiano de Classe Latente. Esses parâmetros foram também estimados para os testes múltiplos. Os resultados do teste de INFg no D0 e D3 após o teste de tuberculinização foram comparados pelos testes estatísticos de McNemar e kappa. Os resultados das médias de densidade ótica do teste de INFg em ambos os dias foram similares. A sensibilidade e a especificidade do teste de INFg apresentaram resultados variando (95% intervalo de confiança) de 72 a 100% e 74 a 100%, respectivamente. A sensibilidade do teste em paralelo foi acima de 97,5% enquanto a especificidade do teste em série foi acima de 99,7%. O teste do INFg provou ser um método de diagnóstico muito útil.

This study aimed to evaluate the interference of tuberculin test on the gamma-interferon (INFg) assay, to estimate the sensitivity and specificity of the INFg assay in Brazilian conditions, and to simulate multiple testing using the comparative tuberculin test and the INFg assay. Three hundred-fifty cattle from two TB-free and two TB-infected herds were submitted to the comparative tuberculin test and the INFg assay. The comparative tuberculin test was performed using avian and bovine PPD. The INFg assay was performed by the BovigamTM kit (CSL Veterinary, Australia), according to the manufacturer's specifications. Sensitivity and specificity of the INFg assay were assessed by a Bayesian latent class model. These diagnostic parameters were also estimate for multiple testing. The results of INFg assay on D0 and D3 after the comparative tuberculin test were compared by the McNemar's test and kappa statistics. Results of mean optical density from INFg assay on both days were similar. Sensitivity and specificity of the INFg assay showed results varying (95% confidence intervals) from 72 to 100% and 74 to 100% respectively. Sensitivity of parallel testing was over 97.5%, while specificity of serial testing was over 99.7%. The INFg assay proved to be a very useful diagnostic method.

Foram identificadas diferenças no perfil protéico das amostras de Sponselee, Norma e Hardjoprajitno, com bandas protéicas entre 175, 47 kDA e 12,10 kDa. A amostra Sponselee foi a que apresentou maior número de bandas (12), seguida da Norma que apresentou 11 bandas e de Hardjoprajitno que apresentou 9 bandas. Todas as bandas observadas na amostra Sponselee possuíam correspondentes nas outras duas amostras. A amostra Norma não apresentou uma banda em torno de 35,77 kDa e a Hardjoprajitno não apresentou bandas em torno de 89,59 kDa, 35,77 kDa e 12,10 kDa. O reconhecimento dessas proteínas por soros hiperimunes contra cada uma das amostras também mostrou diferenças, sendo que o maior número de proteínas reconhecido em todas as amostras por todos os soros se encontrou entre 35,83 kDa e 29,19 kDa. Os soros contra bovino na amostra Norma só reconheceu proteínas de baixa massa molecular nas amostras Norma (6,80 kDa) e Hardjoprajitno (6,80 kDa e 5,30 kDa). Soro bovino contra a amostra Hardjoprajitno reconheceu uma proteína de 44,33 kDa todas às amostras e proteínas de 4,22 kDa nas amostras Sponselee e Norma e de 10,49 kDa e 6,16 kDa na Hardjoprajitno. As diferentes proteínas identificadas poderiam se constituir em alvos específicos para o desenvolvimento de testes diagnósticos e vacinas contra leptospirose bovina.

Differences in the protein profile of Leptospira sp. strains Sponselee, Norma and Hardjoprajitno were observed, with bands ranging from 175.47 kDa to 12.10 kDa. Strain Sponselee presented a 12-band profile, while strain Norma showed 11 and strain Hardjoprajitno showed 9 bands in the profile. All bands observed in Sponselee strain profile could match bands in the other two strains. Strain Norma lacks a band at 35.77 kDa and strain Hardjoprajitno lacks the bands at 89.59 kDa, 35.77 kDa and 12.10 kDa. The recognition profile from hyperimmune sera was also different for the studied serovar Hadjo strains. The majority of recognized proteins was in the range of 35.83 kDa to 29.19 kDa. Cattle sera against strain Norma only recognized low molecular mass proteins in strains Norma (6.80 kDa) and Hardjoprajitno (6.80 kDa and 5.30 kDa). Bovine sera against strain Hardjoprajitno recognized a 44.33 kDa protein in all studied strains and proteins of 4.22 kDa in strains Sponselee and Norma and of 10.49 kDa and 6.16 kDa in strain Hadjoprajitno. The different identified proteins could become specific targets to the development of diagnostic tests and vaccines against bovine leptospirosis.

O presente estudo avaliou a indução da produção de anticorpos contra Leptospira spp.por dez bacterinas, sendo nove polivalentes e uma monovalente experimental para a sorovariedade Hardjo amostra Norma. A concentração celular foi controlada e utilizou-se adjuvante de emulsão óleo em água. Um ensaio imunoenzimático (ELISA) indireto foi desenvolvido utilizando-se conjugado anti-IgG total para mensurar os níveis de anticorpos da classe IgG conferido pelas bacterinas utilizando três amostras diferentes: Hardjoprajitino, Norma e Hardjo-bovis. Paralelamente foi utilizado também o Teste de Soroaglutinação Microscópica (SAM) para mensurar os níveis de anticorpos contra as mesmas amostras. Encontraram-se títulos variáveis entre as bacterinas de acordo com o teste ELISA. Os títulos no SAM foram de pouca intensidade e de curta duração indicando a necessidade de controle celular para uma posterior padronização destes produtos. Com base nos resultados encontrados no presente estudo, a bacterina monovalente foi a que apresentou melhor desempenho.

The study evaluated the induction of antibody production against ten bacterins, nine polyvalent and one experimental monovalent to serovar Hardjo strain Norma. An indirect enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was developed using anti-IgG conjugate to measure total levels of IgG class antibodies conferred by bacterins using three different strains: Hardjoprajiitino, Norma and Hardjo-bovis. Microscopic Agglutination Test (MAT) was also used to measure immunoglobulin levels of the same strains. Variable ELISA titers were induced by the tested bacterins. The MAT titers found showed lower intensity and shorter duration, indicating the need to cellular control in further standardization of these vaccines. Based on results of this study, the monovalent bacterin showed best performance.

Objetivou-se descrever os aspectos clínicos, anátomo-histopatológicos e microbiológicos da paratuberculose em um rebanho Gir leiteiro no Estado da Paraíba. Uma vaca de oito anos que apresentava diarréia persistente, refratária a tratamento foi necropsiada para estudo anátamo-histopatológico. Também foram coletadas amostras de fezes de todos os 160 animais do plantel, com idade superior a 12 meses, para tentativa de isolamento de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. Ao exame clínico, o animal caso índice apresentou caquexia, diarréia profusa e desidratação grave. À necropsia, o animal apresentou-se emaciado e, ao exame detalhado do trato digestivo, foi observado espessamento da parede e superfície mucosa do íleo e intestino grosso. À microscopia, verificou-se intensa infiltração de macrófagos espumosos associado a raras células epiteliódes e gigantes do tipo Langerhans na lâmina própria e submucosa. À coloração de Ziehl-Neelsen foram observadas miríade de bacilos álcool-ácido resistentes no citoplasma destas células. Houve crescimento de colônias bacterianas em duas das 160 amostras de fezes após 150 dias de incubação em tubos com meio Herrold's egg-yolk suplementados com micobactina J e ausência de crescimento nos tubos com mesmo meio, mas sem suplementação. Os microrganismos isolados foram corados pelo Ziehl-Neelsen observando-se presença de grande quantidade de bacilos álcool-ácido resistente, com morfologia compatível ao gênero Mycobacterium. Baseado na história clínica, achados anátomo-histopatológicos e histoquímicos (Ziehl-Neelsen), e microbiológicos, firmou-se o primeiro diagnóstico de paratuberculose em Zebu na Paraíba.

This paper describes the clinical, pathological, and microbiologic aspects of paratuberculosis (Johne's disease) in a dairy Gyr herd in the State of Paraíba, northeastern Brazil. An eight years old cow with chronic unresponsive diarrhea was clinically examined and euthanized for pathological evaluation. Fecal samples from all 160 animals over 12 months of age from the herd were collected for isolation of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. Clinically, the index case cow was severely dehydrated, cachectic, with profuse mucous diarrhea. The main post-mortem findings were emaciation and thickened intestinal wall. Microscopically, the intestinal lamina propria and submucosa were infiltrated by macrophages, epithelioid cells, and Langhans giant cells with numerous alcohol-acid resistant bacilli in the cytoplasm. Two fecal samples displayed growth in slants of Herrold's egg-yolk agar supplemented with mycobactin J, 150 days after incubation. No growth was noticed in slants without mycobactin J. Microscopic examination of the isolated microorganisms stained by Ziehl-Neelsen revealed considerable amounts of alcohol-acid resistant bacilli, morphologically compatible with Mycobacterium spp. Based on the clinical signs, gross and histological lesions, growth time, bacterial morphology in Ziehl-Neelsen staining, and dependence of mycobactin J, the first diagnosis of paratuberculosis in Zebu cattle was made.

Transmission of Mycobacterium bovis from cattle to humans has been reported and can cause tuberculosis (Tb) and a problem in certain risk populations. Therefore, knowledge of resistance of M. bovis towards antibiotics used for therapy of human Tb could help avoiding cure delay and treatment cost increase when dealing with drug resistant organisms. We therefore evaluated the susceptibility of M. bovis isolates towards streptomycin, isoniazide, rifampicin, ethambutol, and ethionamide, the first line antibiotics for human Tb. Therefore, 185 clinical samples from cattle with clinical signs of tuberculosis were processed and submitted to culturing and bacterial isolates to identification and drug susceptibility testing using the proportion method. Among 89 mycobacterial strains, 65 were identified as M. bovis and none were resistant to any of the antibiotics used. Confirmation of present results by future studies, enrolling a large number of isolates and designed to properly represent Brazilian regions, may favor the idea of using isoniazide preventive therapy as part of a Tb control strategy in special situations. Also, nucleic acids from bacterial isolates were submitted to rifoligotyping, a recently described reverse hybridization assay for detection of mutations causing resistance towards rifampicin. Concordance between the conventional and the molecular test was 100%, demonstrating the use of such methodology for rapid evaluation of drug susceptibility in M. bovis.