Resumo: O objetivo deste trabalho foi padronizar e validar um imunoensaio enzimático indireto competitivo (ic-Elisa), como ferramenta de baixo custo, para monitorar a presença de aflatoxina em amendoim comum (Arachis hypogaea) e “branqueado”, na cadeia de produção. A presença de aflatoxina B1, o teor de umidade e a atividade de água foram analisados em 60 amostras da cultivar de amendoim Runner IAC 886, das safras 2014/2015 e 2015/2016 da região da Alta Paulista, no Estado de São Paulo. A validação apresentou linearidade adequada (R2 = 0,999) e limite de detecção e quantificação de 1,13 e 3,59 μg kg-1, respectivamente. Taxas de recuperação de 104, 102 e 107% para as concentrações de 4, 10 e 20 μg kg-1 de aflatoxina B1, respectivamente, também foram registradas. O ic-Elisa mostrou boa repetibilidade, com alta precisão intradia com 1,87% de coeficiente de variação (CV), e de precisão interdia com 6,75% de CV. O teor de umidade variou de 4,0 a 7,2% (média de 5,8 %), e a atividade de água, de 0,4848 a 0,6997 (média de 0,5990), para as amostras testadas. A aflatoxina B1 esteve presente em concentrações que variaram entre 1,13 e 29,2 μg kg-1, com apenas duas amostras (3,3%) que excederam o limite máximo permitido de 20 μg kg-1. O ic-Elisa desenvolvido aqui é uma ferramenta acessível para o monitoramento rápido da contaminação por aflatoxinas na cadeia produtiva de amendoim.

Abstract: The objective of this work was to standardize and validate an indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ic-Elisa), as a low-cost tool, to monitor the presence of aflatoxin in common and blanched peanuts (Arachis hypogaea) in the production chain. The presence of aflatoxin B1, moisture content, and water activity were analyzed in 60 samples of the peanut cultivar Runner IAC 886, from the 2014/2015 and 2015/2016 harvests of the region of Alta Paulista, in the state of São Paulo, Brazil. The validation showed an adequate linearity (R2 = 0.999), and limits of detection and quantification of 1.13 and 3.59 μg kg-1, respectively. Recovery rates of 104, 102, and 107% at the concentrations of 4, 10, and 20 μg kg-1 aflatoxin B1, respectively, were also recorded. The ic-Elisa showed a good reproducibility with a high-intraday precision, with 1.87% coefficient of variation (CV), and interday precision with 6.75% CV. The moisture content ranged from 4.0 to 7.2% (mean of 5.8%), and the water activity from 0.4848 to 0.6997 (mean of 0.5990) for the tested samples. Aflatoxin B1 was present in concentrations ranging from 1.13 to 29.2 μg kg-1, with only two samples (3.3%) exceeding the maximum allowed limit of 20 μg kg-1. The ic-ELISA developed here is an accessible tool for the rapid monitoring of aflatoxin contamination in the peanut production chain.

INTRODUÇÃO: Durante a histoplasmose, os antígenos solúveis de Histoplasma capsulatum (CFAg) podem ser liberados naturalmente pelas células leveduriformes. Considerando que os CFAg constituem um alvo específico durante a infecção, no presente estudo nós investigamos a liberação de CFAg durante a histoplasmose murina experimental, e avaliamos a resposta imune humoral do hospedeiro contra antígenos de alta MM (hMMAg; >150 kDa), altamente imunogênicos. MÉTODOS: Camundongos foram infectados com 2.2x10(4) leveduras de H. capsulatum, cepa IMT/HC128. Os níveis de CFAg solúveis, IgG anti-CFAg, IgG anti-hMMAg, e também de imunocomplexos circulantes (CIC) IgG-hMMAgs foram determinados por ELISA nos dias 0, 7, 14 e 28 após a infecção. RESULTADOS: Após a infecção por H. capsulatum, observamos um aumento progessivo de CFAg circulantes, IgG anti-CFAg, IgG anti-hMMAg, e também de CIC IgG-hMMAgs. Os hMMAg apresentaram alta porcentagem de carboidratos e, pelo menos, dois componentes imunogênicos. CONCLUSÕES: Mostramos pela primeira vez que os hMMAg de H. capsulatum cepa IMT/HC128 induzem resposta imune humoral e levam à formação de CIC durante a histoplasmose experimental.

INTRODUCTION: During histoplasmosis, Histoplasma capsulatum soluble antigens (CFAg) can be naturally released by yeast cells. Because CFAg can be specifically targeted during infection, in the present study we investigated CFAg release in experimental murine histoplasmosis, and evaluated the host humoral immune response against high-molecular-mass antigens (hMMAg. >150 kDa), the more immunogenic CFAg fraction. METHODS: Mice were infected with 2.2x10(4) H. capsulatum IMT/HC128 yeast cells. The soluble CFAg, IgG anti-CFAg, IgG anti-hMMAg, and IgG-hMMAg circulating immune complexes (CIC) levels were determined by enzymelinked immunosorbent assay, at days 0, 7, 14, and 28 post-infection. RESULTS: We observed a progressive increase in circulating levels of CFAg, IgG anti-CFAg, IgG anti-hMMAg, and IgG-hMMAg CIC after H. capsulatum infection. The hMMAg showed a high percentage of carbohydrates and at least two main immunogenic components. CONCLUSIONS: We verified for the first time that hMMAg from H. capsulatum IMT/HC128 strain induce humoral immune response and lead to CIC formation during experimental histoplasmosis.

Nitric oxide (NO) is a free radical synthesized from L-arginine by different isoforms NO-synthases. NO possesses multiple and complex biological functions. NO is an important mediator of homeostasis, and changes in its generation or actions can contribute or not to pathological states. The knowledge of effects of NO has been not only important to our understanding of immune response, but also to new tools for research and treatment of various diseases. Knowing the importance of NO as inflammatory mediator in diverse infectious diseases, we decided to develop a revision that shows the participation/effect of this mediator in immune response induced against Giardia spp. Several studies already demonstrated the participation of NO with microbicidal and microbiostatic activity in giardiasis. On the other hand, some works report that Giardia spp. inhibit NO production by consuming the intermediate metabolite arginine. In fact, studies in vitro showed that G. lamblia infection of human intestinal epithelial cells had reduced NO production. This occurs due to limited offer of the crucial substrate arginine (essential aminoacid for NO production), consequently reducing NO production. Therefore, the balance between giardial arginine consumption and epithelial NO production could contribute to the variability of the duration and severity of infections by this ubiquitous parasite.

INTRODUÇÃO: Diferentes níveis sorológicos de IgG/IgE contra a fração de alta massa molecular (hMM) (~366kDa) de Paracoccidioides brasiliensis têm sido encontrados na PCM aguda e crônica. Considerando a inexistência de investigação sobre esta fração em isolados clínicos de P. brasiliensis, o objetivo deste estudo foi investigar a presença da fração hMM (~366kDa) no preparado livre de células (CFA) de P. brasiliensis obtidos de isolados clínicos. MÉTODOS: CFA de 10 isolados e de cepa de referência (Pb18) foram submetidas à eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) seguida de captura de imagem e análise por densitometria. Adicionalmente, CFA de 20 isolados e de Pb18 foram analisados por ELISA captura (cELISA) utilizando anticorpos policlonal (polAb) ou monoclonal (mAb) para fração hMM. RESULTADOS: A presença do componente de hMM foi observada em todas as amostras analisadas por SDS-PAGE/densitometria e por cELISA. Adicionalmente, o teste de correlação de Pearson demonstrou forte relação entre os níveis de fração hMM usando pAb e mAb (R = 0.853) no cELISA. CONCLUSÕES: Conclui-se que a fração hMM está presente em todos os isolados clínicos de P. brasiliensis analisados e no isolado referencial, sugerindo a possibilidade dos mesmos serem utilizados como fonte desta fração antigênica. Este trabalho também introduz pela primeira vez o método de cELISA para detecção da fração hMM de P. brasiliensis, sugerindo que detecção utilizando anticorpos polAb ou mAb é viável e essa metodologia poderá ser útil para investigação futura desta fração solúvel (~366kDa) em soros de pacientes com PCM.

INTRODUCTION: Different serum levels of the IgG/IgE for Paracoccidioides brasiliensis high mass molecular (hMM) fraction (~366kDa) in the acute and chronic forms of the disease have been reported. Considering the nonexistence of hMM fraction investigation involving clinical isolates of P. brasiliensis, the present study aimed to investigate the presence of the hMM fraction (~366kDa) in cell free antigens (CFA) from P. brasiliensis clinical isolates. METHODS: CFA from 10 clinical isolates and a reference strain (Pb18) were submitted to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by gel image capturing and densitometer analysis. Additionally, CFA from 20 isolates and Pb18 were analyzed by capture ELISA (cELISA) using polyclonal (polAb) or monoclonal (mAb) antibodies to the hMM fraction. RESULTS: The presence of the hMM component was observed in CFA of all samples analyzed by SDS-PAGE/densitometry and by cELISA. In addition, Pearson's correlation test demonstrated stronger coefficients between hMM fraction levels using pAb and mAb (R = 0.853) in cELISA. CONCLUSIONS: The soluble hMM fraction was present in all the P. brasiliensis clinical isolates analyzed and the reference strain Pb18, which could be used as a source of this antigen. The work also introduces for first time, the cELISA method for P. brasiliensis hMM fraction detection. Analysis also suggests that detection is viable using polAb or mAb and this methodology may be useful for future investigation of the soluble hMM fraction (~366kDa) in sera from PCM patients.

Este trabalho avaliou as frações de proteínas séricas, HDL-colesterol e imunoglobulina G e imunoglobulina E totais em pacientes com paracoccidioidomicose aguda e crônica por eletroforese, reação enzimática e ensaio imunoenzimático. Os resultados demonstraram aumento dos níveis de imunoglobulina G e imunoglobulina E totais, alfa-2 e gama-globulinas, mais evidente na forma aguda que na forma crônica, e não nos níveis de HDL-colesterol. Houve correlação entre níveis de imunoglobulina E total e gama-globulinas e fração alfa-2 e beta-globulinas na forma aguda e entre beta e gama-globulinas nas formas aguda e crônica. Concluindo, alterações nos níveis de imunoglobulina G e imunoglobulina E totais e no perfil eletroforético podem ser importantes marcadores para prognóstico e acompanhamento terapêutico da PCM, especialmente por ser a eletroforese de proteínas um exame laboratorial simples que pode ser empregado em situações onde a sorologia específica para PCM não está disponível. Adicionalmente, níveis da fração gama-globulinas acima de 2,0g/dL podem sugerir que o paciente esteja desenvolvendo uma forma mais grave de PCM.

This study evaluated serum protein fractions, HDL-cholesterol, total immunoglobulin G and total immunoglobulin E levels in patients with acute and chronic paracoccidioidomycosis, by means of electrophoresis, enzymatic reaction and immunoenzymatic assay. The results demonstrated elevated levels of total immunoglobulin G, total immunoglobulin E, alpha-2 and gamma-globulins, which were more evident in acute than in chronic PCM, but no increase in HDL-cholesterol levels. There was a correlation between the levels of total immunoglobulin E and gamma-globulins and the alpha-2 and beta-globulin fractions in the acute form and between beta and gamma-globulins in both the acute and the chronic form. In conclusion, changes in total immunoglobulin G and immunoglobulin E levels and in the electrophoretic profile may be important markers for the prognosis and therapeutic follow-up of PCM cases, especially because protein electrophoresis is a simple laboratory test that can be applied when specific PCM serological tests are not available. In addition, levels of the gamma-globulin fraction greater than 2.0g/dl may suggest that the patient is developing a more severe form of PCM.

ELISA competitivo indireto (ic-ELISA) baseado em anticorpos monoclonais foi desenvolvido para a detecção de ocratoxina A (OTA) em café verde, torrado e instantâneo. Os reagentes imunológicos necessários à reação consistiram de OTA-BSA (4,76 mg/mL), anti-OTA.7 MAb (diluído 2x10³) e anti IgG-HRP (diluído 10³), apresentando limite de detecção de 3,73 ng OTA/g. Os coeficientes de correlação (r) entre o imunoensaio e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foram de 0,98 (café verde), 0,98 (torrado) e 0,86 (instantâneo). Ic-ELISA detectou valores superestimados de OTA em relação a CLAE, com valor ELISA/CLAE variando de 0,66 - 1,46 (café verde), 0,96 - 1,11 (torrado) e 0,93 - 1,82 (instantâneo). As recuperações médias de OTA adicionada em café (5 - 70 ng/g) foram de 81,53 % (café verde), 46,73 % (torrado) e 64,35 % (instantâneo) por ELISA, em relação a 80,54 %, 45,91 % e 55,15 % por CLAE, respectivamente. A interferência de matriz no imunoensaio foi minimizada pela diluição das amostras previamente à análise por ELISA. O ic-ELISA desenvolvido pode ser considerado uma técnica alternativa simples, sensível e específica para análise de OTA, contribuindo para a qualidade e segurança de produtos de café.

An indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ic-ELISA) for ochratoxin A (OTA) detection in green, roasted and instant coffees was developed using anti-OTA monoclonal antibody. Immunological reagents prepared were OTA-BSA (4.76 mg/mL), anti-OTA.7 MAb (2x10³-fold dilution) and HRP-anti IgG (10³-fold dilution). The detection limit was 3.73 ng OTA/g and correlation coefficients (r) between this immunoassay and high performance liquid chromatography were 0.98 for green coffee, 0.98 for roasted and 0.86 for instant. OTA levels detected by ic-ELISA were higher than by HPLC, with ELISA/HPLC ratio of 0.66 - 1.46 (green coffee), 0.96 - 1.11 (roasted) and 0.93 - 1.82 (instant). ELISA recoveries for OTA added to coffee (5 - 70 ng/g) were 81.53 % for green coffee, 46.73 % for roasted and 64.35 % for instant, while recoveries by HPLC were 80.54 %, 45.91 % and 55.15 %, respectively. Matrices interferences were minimized by samples dilution before carrying out the ELISA assay. The results indicate that MAb-based ic-ELISA could be a simple, sensitive and specific screening tool for OTA detection, contributing to quality and safety of coffee products.

Actinobacillus actinomycetemcomitans produz protease ativa sobre imunoglobulina G humana, sendo um dos mecanismos importantes de escape do microrganismo. No presente trabalho, foi analisada a atividade proteolítica de sobrenadante de cultivo de A. actinomycetemcomitans ATCC 43718 sobre imunoglobulina G humana em função de concentração, tempo de cultivo do microrganismo e tempo de incubação com IgG, por ensaio imunoenzimático. Adicionalmente, foi determinada a fração com atividade de protease por meio de análise de eluatos de cromatografia em coluna de Sephadex G 150. Os resultados obtidos demonstraram que A. actinomycetemcomitans liberou protease ativa sobre imunoglobulina G humana em sobrenadante de cultivo, sendo a sua maior atividade evidenciada na concentração de 27,5 mig proteína/mL, com tempo de cultivo de 72 horas e com 24 horas de incubação com IgG. A massa molecular da fração ativa de protease foi compreendida entre 43 a 150 kDa.

Actinobacillus actinomycetemcomitans produces a protease to human immunoglobulin G that is an important evasion mechanism. In this study, the proteolytic activity of A. actinomycetemcomitans strain ATCC 43718 on human immunoglobulin G associated with culture supernatant concentrations, the growth period and the period of incubation with immunoglobulin G were evaluated by an enzyme linked immunosorbent assay. The protease fraction was detected by Sephadex G 150 chromatography. The results showed that A. actinomycetemcomitans produced a protease to human immunoglobulin G in the culture supernatant, and the highest activity was achieved witen the concentration was 27.5 mug protein/mL, after culturing for 72 hours and incubating with IgG for 24 hours. The molecular mass of the protease active fraction was from 43 to 150 kDa.

O comportamento de células vegetativas do Bacillus thuringiensis foi estudado em solo não esterilizado. Após o inóculo grande parte das células morrem e o restante esporula em 24 horas. Não foi observada conjugação provavelmente porque poucas células sobrevivem no solo e rapidamente esporulam, mostrando que este não é o ambiente propício para a multiplicação e conjugação desta bactéria. A toxina purificada, portanto livre de células, diminui rapidamente sua quantidade em solo não esterilizado. Provavelmente a ligação da toxina na fração argilosa do solo é a principal responsável por este fenômeno.

Bacillus thuringiensis is a Gram positive, sporangial bacterium, known for its insecticidal habilities. Survival and conjugation ability of B. thuringiensis strains were investigated; vegetative cells were evaluated in non-sterile soil. Vegetative cells decreased rapidly in number, and after 48 hours the population was predominantly spores. No plasmid transfer was observed in non-sterile soil, probably because the cells died and the remaining cells sporulated quickly. Soil is not a favorable environment for B. thuringiensis multiplication and conjugation. The fate of purified B. thuringiensis toxin was analyzed by extractable toxin quantification using ELISA. The extractable toxin probably declined due to binding on surface-active particles in the soil.

A leucotoxina de Actinobacillus actinomycetemcomitans é considerada seu principal fator de virulência com potencial de causar agressão às defesas do hospedeiro. No presente trabalho, foram analisados os níveis séricos e salivares de anticorpos antileucotoxina de A. actinomycetemcomitans em soros e salivas de pacientes com periodontite juvenil localizada (PJL) e controles saudáveis. Adicionalmente, foi realizada a análise de complexo imune (CI) nas amostras de saliva. Foram utilizados os métodos ELISA clássico com a leucotoxina obtida por gel filtração em Sephadex G-200 e ELISA de captura utilizando IgG de coelho anti-A. actinomycetemcomitans FDC Y4 leucotóxico adsorvido com uma cepa da mesma espécie, porém, não leucotóxica. Os resultados obtidos demonstraram níveis séricos de IgG significativamente mais elevados em pacientes com PJL em relação aos controles sadios, tanto por ELISA clássico como por ELISA de captura (p < 0,05). No entanto, não foram observadas diferenças entre os níveis de IgG, IgA-S e CI nas salivas dos indivíduos examinados. Estes resultados sugerem que, embora A. actinomycetemcomitans apresente vários fatores de virulência que afetam a resposta imune do hospedeiro, ocorre resposta imune à leucotoxina nos pacientes com PJL. Esse aumento de IgG na circulação sangüínea pode contribuir na defesa do hospedeiro, limitando a lesão nas regiões periodontais amplamente colonizadas por A. actinomycetemcomitans.

The leukotoxin produced by Actinobacillus actinomycetemcomitans is considered the major virulence factor with potential to cause damage to the host defenses. The present work analyzed the serumal and salivary levels of antibodies against the leukotoxin produced by A. Actinomycetemcomitans, in patients with Localized Juvenile Periodontitis (LJP) and in healthy controls. Additionally, analysis of the immune complex (IC) was carried out in saliva samples . The classic ELISA method, with leukotoxin obtained through Sephadex G-200 gel filtration, and the capture ELISA method, using rabbit anti-A. Actinomycetemcomitans (leucotoxic, FDC Y4, IgG) adsorbed with a non-leukotoxic strain of A. actinomycetemcomitans, were used. The results obtained demonstrated significantly higher serumal levels of IgG in patients with LJP, when they were compared with the healthy controls, both for the classic and capture ELISA methods (p < 0.05). However, no significant differences were observed between the salivary levels of IgG, SIgA and IC in the examined individuals. These results suggest that even though A. actinomycetemcomitans presents virulence factors that affect the immune response, there is immune response to leukotoxin in LJP patients. This increase of IgG in the blood stream might contribute to host defense, limiting the lesion to the periodontal regions already colonized by A. actinomycetemcomitans.

Foram comparados os níveis de IgG e IgA séricas e de IgG e IgA secretora (IgA-S) salivares reativas com Actinobacillus actinomycetemcomitans (Aa) e dosadas IgM, IgG e IgA séricas totais em pacientes com Periodontite de Incidência Precoce (PIP), Periodontite de Adulto (PA) e controles saudáveis (sem doença periodontal). Os níveis de anticorpos para Aa foram determinados por ELISA, e a dosagem de Igs séricas totais foi realizada por imunodifusão radial simples, utilizando-se como antígenos extrato sonicado de uma mistura de cinco isolados de Aa provenientes de pacientes com PIP e extrato sonicado de Aa de referência FDC Y4. Não foi observada diferença significativa entre os níveis séricos de anticorpos IgG e IgA e os níveis salivares de anticorpos IgG e IgA-S para Aa nos grupos PIP (n = 9), PA (n = 20) e indivíduos sadios (n = 20). Esses resultados sugerem a inexistência de alterações significativas na resposta imune humoral anti-Aa em pacientes com periodontite. A dosagem de Igs séricas totais também não revelou diferença estatisticamente significante entre pacientes com PIP (n = 9), PA (n = 9) ou controles saudáveis (n = 9).

We compared levels of sera immunoglobulin IgG and IgA, and salivary IgG and secretory IgA (IgA-S) reactive to Actinobacillus actinomycetemcomitans (Aa). Doses of total sera IgM, IgG, and IgA of patients with early-onset (EOP) and adult (AP) periodontitis, and healthy controls without periodontal disease were assessed. Igs to Aa were determined by ELISA. Total sera Igs were quantified by simple radial immunodiffusion, using a mixture of sonicated extracts of five isolates obtained from EOP patients confirmed as Aa, and sonicated extract of Aa reference strain FDC Y4 as antigens. No significant differences were found between sera IgG and IgA and salivary IgG and IgA-S levels among groups EOP (n=9), AP (n=20), and control (n=20). These results suggest that there was no significant alteration of the Aa humoral immune response level in patients with periodontitis. By quantification of total sera Igs, we found no statistically significant differences between EOP (n=9) and AP (n=9) patients or healthy controls (n=9).

A resposta linfoproliferativa a Actinobacillus actinomycetemcomitans (Aa) e ao mitógeno fitohemaglutinina (PHA) foi avaliada comparativamente em grupos de pacientes com Periodontite de Incidência Precoce (PIP), Periodontite de Adulto (PA) e controles saudáveis sem doença periodontal. Como antígenos foram utilizados a mistura de extratos sonicados de cinco isolados provenientes de pacientes com PIP, confirmados como Aa, e os extratos sonicados de Aa de referência ATCC 29522, ATCC 29523 e FDC Y4. Os resultados da resposta linfoproliferativa a Aa não demonstraram diferenças estatisticamente significantes em pacientes com PIP (n = 9) ou PA (n = 20) em relação ao grupo controle (n = 20). Utilizando os extratos sonicados de Aa previamente aquecidos ou não, foi detectada a presença de fator ou fatores termolábeis com capacidade de suprimir a resposta linfoproliferativa específica, indicando a necessidade do aquecimento do extrato para a real avaliação da resposta linfoproliferativa. Frente ao mitógeno PHA, não foram observadas diferenças significativas entre os grupos, sugerindo a não indução do estado de imunossupressão em pacientes com periodontites. Experimentos subseqüentes com extratos aquecidos ou não demonstraram a presença de fator ou fatores termoestáveis com capacidade de suprimir a resposta a PHA, diferenciando-se da resposta específica. A presença desses fatores, que serão caracterizados posteriormente, poderia explicar a não detecção de alteração na resposta imune celular nos pacientes com periodontite.

The purpose of this study was to compare the lymphoproliferative response to Actinobacillus actinomycetemcomitans (Aa) and to phytohemaglutinin (PHA) mitogen, in groups of patients with early-onset periodontitis (EOP, n = 9), adult periodontitis (AP, n = 20), and healthy controls without periodontal disease (n = 20). As antigens, a mixture of sonicated extracts of five isolates obtained from EOP patients, and sonicated extracts of Aa reference strains ATCC 29522, ATCC 29523, and FDC Y4 were used. No statistically significant difference was observed between the three groups as to the lymphoproliferative response to Aa. The use of previously heated and unheated Aa sonicated extracts demonstrated the existence of heat-labile factor or factors capable of depressing the specific lymphoproliferative response. This indicates the necessity of using a heated extract for a valid evaluation of lymphoproliferative response. As for the lymphoproliferative response to the PHA mitogen, no significant differences between groups were observed. This suggests that there was no induction of immunosuppression in the patients with periodontitis. In addition, in experiments with heated or unheated Aa extracts, the presence of heat-stable factor or factors capable of suppressing the PHA response was noticed. The presence of these factors could explain why no alteration of the cellular immune response was detected in the patients with periodontitis.