RESUMO A pleuropneumonia suína, causada pelo Actinobacillus pleuropneumoniae, é uma importante doença respiratória, responsável por prejuízos e queda de produtividade nas criações. Este trabalho teve como objetivo determinar a ocorrência de A. pleuropneumoniae em amostras de campo, mediante a adaptação e emprego de uma técnica de nested-PCR dirigida ao gene Apx IV. Definiu-se a sensibilidade analítica das técnicas de PCR e nested-PCR utilizando a amostra padrão A. pleuropneumoniae sorotipo III, em concentrações de DNA variando entre 30 µg/mL a 0,01 ng/ mL. Um total de trinta e sete amostras de campo encaminhadas ao Instituto Biológico entre 1995 a 2007 foram analisadas pelas técnicas de PCR e nested-PCR. A avaliação da sensibilidade analítica revelou que a PCR possui capacidade de gerar sinal a partir de 2 ng/mL de DNA extraído e a nested-PCR a partir de 0,4 ng/mL. Uma vez que a nested-PCR apresentou sensibilidade analítica cinco vezes maior se comparada à PCR para detecção de A. pleuropneumoniae em amostra padrão, o seu emprego pode minimizar a ocorrência de resultados tipo “falso-negativo”. Dentre as amostras testadas, dez foram positivas à nested-PCR, sendo observada a ocorrência de A. pleuropneumoniae em nove diferentes animais, um deles javali. A presente técnica de nested-PCR pode ser utilizada para detecção direta de A. pleuropneumoniae em amostras de campo, mesmo após congelamento da amostra por longos períodos e sem necessidade de isolamento bacteriano prévio.

ABSTRACT Porcine pleuropneumonia, caused by Actinobacillus pleuropneumoniae, is an important respiratory disease, responsible for economic losses and reduced productivity. The aim of this study was to determine occurrence of A. pleuropneumoniae in field samples, using an adapted nested-PCR reaction targeting the Apx IV gene. Different DNA concentrations (from 30 µg/mL to 0.01 ng/mL) of A. pleuropneumoniae serotype III reference strain were used to determine the level of sensitivity of first generation and nested-PCR reactions. Thirty-seven field samples sent to Instituto Biológico from 1995 to 2007 were tested by PCR and nested-PCR. Determination of the level of sensitivity showed that PCR could amplify to 2 ng/mL of extracted DNA and nested-PCR to 0.4 ng/mL. Since the nested reaction exhibited a level of sensitivity 5 times greater than the PCR reaction to detect a reference strain, using nested-PCR could minimize the occurrence of false-negative results. Among tested samples, 10 of them were nested-PCR positive, showing occurrence of A. pleuropneumoniae in 9 different animals (including one wild boar). This nested-PCR reaction can be used for direct detection of A. pleuropneumoniae in field samples, even after frozen storage for long periods, without the need for previous bacterial isolation.

Em vacas leiteiras, a disenteria de inverno (DI) é uma doença infecciosa sazonal mundialmente relatada que ocasiona uma marcada queda na produção de leite; no hemisfério Norte, onde a doença é classicamente reconhecida, o coronavirus bovino (BCoV) tem um importante papel como agente etiológico. Entretanto, no hemisfério Sul, pesquisas etiológicas aprofundadas em casos de DI nunca forma realizadas. Este estudo objetivou a pesquisa de BCoV utilizando nested-RT-PCR, rotavírus utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e ELISA, bactérias com métodos bacteriológicos clássicos e PCR para fatores de virulência e parasitas pela técnica de flutuação em açúcar em 21 amostras fecais de vacas de uma fazenda durante um surto de DI no estado de São Paulo, Sudeste do Brasil. BCoV foi encontrado em todas as 21 amostras, enquanto que rotavírus foi encontrado em duas vacas sintomáticas. Escherichia coli, Yersinia intermedia, Providencia rustigiani, Proteus penneri, Klebsiella terrigena e Enterobacter aglomerans foram encontradas tanto em amostras de vacas sintomáticas quanto assintomáticas. O estudo de fatores de virulência para E. coli revelou que as amostras isoladas eram todas apatogênicas. Cistos de Eimeria sp. e ovos de Strongyloidea foram encontrados em baixos números em quatro animais sintomáticos, com uma co-infestação. Tais resultados sugerem o BCoV como o principal agente etiológico em casos de DI no Brasil, uma conclusão que, somada aos padrões clínicos e epidemiológicos da doença aqui estudada, concordam com aqueles descritos em outras regiões. Estes achados fornecem base o desenvolvimento de medidas preventivas e também contribuem para o entendimento sobre a etiologia da DI.

Winter dysentery (WD) is a seasonal infectious disease described worldwide that causes a marked decrease in milk production in dairy cows. In the Northern hemisphere, where the disease is classically recognized, bovine coronavirus (BCoV) has been assigned as a major etiologic agent of the disease. Nonetheless, in the Southern hemisphere, an in-deep etiological survey on WD cases had not been carried out. This study aimed to survey for BCoV by nested-RT-PCR, rotavirus by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and ELISA, bacteria by classical bacteriological methods and PCR for virulence factors and parasites by sugar flotation test on fecal samples of 21 cows from a farm during an outbreak of WD in São Paulo state, Southeastern Brazil. BCoV was detected in all 21 samples, while rotavirus was detected in two symptomatic cows. Escherichia coli, Yersinia intermedia, Providencia rustigianii Proteus penneri, Klebsiella terrigena and Enterobacter aglomerans were detected in samples from both asymptomatic and healthy cows in different associations. The study of E. coli virulence factors revealed that the strains isolated were all apathogenic. Cysts of Eimeria sp. and eggs of Strongyloidea were detected at low numbers in four of the symptomatic cows, with one co-infestation. These results suggest BCoV as the main etiologic agent of the cases of WD in Brazil, a conclusion that, with the clinical and epidemiological patterns of the disease studied herein, match those already described elsewhere. These findings give basis to the development of preventive measures and contribute to the understanding of the etiology of WD.

Descreve-se a pesquisa de BCoV e rotavírus em 13 mostras fecais de vacas de surtos de disenteria utilizando uma nested PCR dirigida ao gene RdRp e PAGE, respectivamente. Todas as amostras fecais foram positivas para BCoV e nenhuma delas apresentou-se positiva para rotavírus em PAGE. O encontro de coronavírus bovino em amostras fecais de vacas com disenteria sugere que este vírus possa ser o agente primário envolvido na etiologia dos casos aqui relatados.

ABSTRACT Rotavirus is one of the most important etiological agents in infant gastroenteritis and diarrhea in neonatal animals. The purpose of this study was the optimization of isolation of rotaviruses in MA104 (fetal kidney Rhesus monkey) cells by the comparison of culture, taking into account the number of samples, different treatments with trypsin, number of serial passages, and positivity by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Twenty diarrheic fecal samples of calves and piglets from São Paulo, State, Brazil, all positive for rotavirus in ELISA and PAGE, were submitted to four isolation protocols: in treatment 1, the inoculum was left on the monolayer and the maintenance medium was trypsin-free; treatment 2 was the same as treatment 1 except that the inoculum was discarded; in treatment 3 the inoculum was left on the monolayer and the maintenance medium had 5 µg/mL of trypsin; treatment 4 was the same as the monolayer treatment 3, except that the maintenance medium had 10 µg/mL of trypsin. Fifteen samples were successfully isolated, representing an efficacy of 75% (15/20). Treatment 3 was the most suitable because the lower number of serial passages and lower cytotoxity to the cells, with statistical significance (p < 0.001) using Freedman's and Wilcoxon's tests. animals MA MA10 fetal monkey culture trypsin PAGE. PAGE . (PAGE) Paulo State Brazil protocols trypsinfree free trypsin-free discarded µgmL µg mL isolated 75 15/20. 1520 15/20 15 20 (15/20) p 0.001 0001 0 001 Freedmans Freedman s Wilcoxons Wilcoxon tests MA1 (PAGE 7 152 15/2 (15/20 0.00 000 00 15/ (15/2 0.0 (15/ 0. (15 (1 (

RESUMO Os rotavírus são importantes agentes virais envolvidos nas gastroenterite infantil e da diarréia dos animais neonatos. O objetivo deste trabalho foi otimizar o isolamento de rotavírus levando-se em conta o número de amostras, diferentes tratamentos com tripsina, número de passagens seriadas e monitoramento das mesmas através de eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE). Foram utilizadas 20 amostras fecais diarréicas, positivas para rotavírus por meio de ELISA e PAGE, oriundas de bezerros e leitões, as quais foram submetidas a quatro protocolos usando tripsina. No tratamento 1 o inóculo foi mantido e o meio de manutenção não continha tripsina; no tratamento 2 o inóculo foi dispensado e o meio de manutenção sem tripsina; no tratamento 3 o inóculo foi mantido e o meio de manutenção continha tripsina na concentração de 5 µg/mL; no tratamento 4 o inóculo foi mantido e o meio de manutenção continha tripsina na concentração de 10 µg/mL. Todos os inóculos continham tripsina na concentração de 5 mg/mL. Dentre as amostras estudadas, 15 foram isoladas com sucesso, o que representa uma eficiência de 75% (15/20). Dentre os protocolos, o tratamento 3 foi o que apresentou melhor desempenho, considerando-se o número de passagens seriadas, a ausência de citotoxidade e significância estatística (p < 0,001), quando se aplicou o teste de Freedman e o teste de Wilcoxon. neonatos levandose levando PAGE. PAGE . (PAGE) diarréicas leitões µg/mL µgmL µg mL mgmL mg mg/mL estudadas sucesso 75 15/20. 1520 15/20 (15/20) desempenho considerandose considerando p 0,001, 0001 0,001 , 0 001 0,001) Wilcoxon (PAGE 7 152 15/2 (15/20 000 0,00 00 15/ (15/2 0,0 (15/ 0, (15 (1 (