Abstract One hundred and sixty-six cats from two animal shelters were subjected to enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), indirect immunofluorescence antibody test (IFAT), conventional polymerase chain reaction (cPCR), quantitative PCR (qPCR) and parasitological tests (PA) for the diagnosis of Leishmania spp. Among them, 15% (25/166), 53.6% (89/166), 3.6% (06/166) and 1.8% (03/166) were positive by ELISA, IFAT, both PCRs and PA, respectively. The sequencing of ITS-1 PCR amplicons revealed a 100% match with Leishmania infantum. After the Leishmania spp. survey, 12 cats were selected and divided into two groups for clinical, hematological, and biochemical analysis: six L. infantum positive cats (G1) and six Leishmania spp. negative cats (G2). All the cats were negative for feline immunodeficiency virus (FIV) and feline leukemia virus (FeLV). A statistical analysis indicated significantly low platelet counts and significant hyperproteinemia associated with hypoalbuminemia in positive cats (p<0.05). Our results suggest that in endemic areas, cats with clinical signs of feline leishmaniosis (such as skin lesions, weight loss and/or enlarged lymph nodes) and that exhibit hematological and biochemical changes, such as low platelet counts and hyperproteinemia with hypoalbuminemia, should be tested for Leishmania spp. infection. sixtysix sixty enzymelinked enzyme linked ELISA , (ELISA) IFAT (IFAT) cPCR, cPCR (cPCR) qPCR (qPCR PA (PA spp them 15 25/166, 25166 25/166 25 166 (25/166) 536 53 6 53.6 89/166, 89166 89/166 89 (89/166) 36 3 3.6 06/166 06166 06 (06/166 18 1 8 1.8 03/166 03166 03 (03/166 respectively ITS1 ITS ITS- 100 survey L G1 G (G1 G2. G2 . (G2) FIV (FIV FeLV. FeLV (FeLV) p<0.05. p005 p p<0.05 0 05 (p<0.05) areas lesions andor or nodes changes infection (ELISA (IFAT (cPCR 2516 25/16 2 16 (25/166 5 53. 8916 89/16 (89/166 3. 06/16 0616 (06/16 1. 03/16 0316 (03/16 10 (G (G2 (FeLV p00 p<0.0 (p<0.05 251 25/1 (25/16 891 89/1 (89/16 06/1 061 (06/1 03/1 031 (03/1 p0 p<0. (p<0.0 25/ (25/1 89/ (89/1 06/ (06/ 03/ (03/ p<0 (p<0. (25/ (89/ (06 (03 p< (p<0 (25 (89 (0 (p< (2 (8 ( (p

Resumo Cento e sessenta e seis gatos de dois abrigos foram submetidos ao diagnóstico de Leishmania spp. por ensaio imunoenzimático (ELISA), imunofluorescência indireta (RIFI), reação em cadeia pela polimerase convencional (cPCR) e quantitativa (qPCR) e métodos parasitológicos (PA). Destes, 15% (25/166), 53,6% (89/166), 3,6% (06/166) e 1,8% (03/166) foram positivos por ELISA, RIFI, as duas PCRs e PA, respectivamente. O sequenciamento dos produtos amplificados da PCR ITS-1 foi 100% idêntico à Leishmania infantum. Após o inquérito, 12 gatos foram selecionados para compor dois grupos para análises de hematologia e bioquímica: 6 gatos positivos para L. infantum (G1) e 6 gatos Leishmania spp. negativos (G2). Todos os gatos foram negativos para o vírus da imunodeficiência felina (FIV) e o da leucemia felina (FeLV). Foi observada uma diminuição na contagem de plaquetas e uma hiperproteinemia e hipoalbuminemia significativas em gatos positivos (p<0,05). Esses resultados sugerem que, em áreas endêmicas, os gatos com sinais clínicos de leishmaniose felina (tais como lesões dermatológicas, perda de peso e/ou linfonodos aumentados), associados a alterações hematológicas e bioquímicas, como contagem reduzida de plaquetas e hiperproteinemia com hipoalbuminemia, devem ser testados para leishmaniose felina. spp ELISA , (ELISA) RIFI (RIFI) cPCR (cPCR qPCR (qPCR PA. PA . (PA) Destes 15 25/166, 25166 25/166 25 166 (25/166) 536 53 53,6 89/166, 89166 89/166 89 (89/166) 36 3 3,6 06/166 06166 06 (06/166 18 1 8 1,8 03/166 03166 03 (03/166 respectivamente ITS1 ITS ITS- 100 inquérito bioquímica L G1 G (G1 G2. G2 (G2) FIV (FIV FeLV. FeLV (FeLV) p<0,05. p005 p p<0,05 0 05 (p<0,05) que endêmicas tais dermatológicas eou ou aumentados, aumentados aumentados) bioquímicas (ELISA (RIFI (PA 2516 25/16 2 16 (25/166 5 53, 8916 89/16 (89/166 3, 06/16 0616 (06/16 1, 03/16 0316 (03/16 10 (G (G2 (FeLV p00 p<0,0 (p<0,05 251 25/1 (25/16 891 89/1 (89/16 06/1 061 (06/1 03/1 031 (03/1 p0 p<0, (p<0,0 25/ (25/1 89/ (89/1 06/ (06/ 03/ (03/ p<0 (p<0, (25/ (89/ (06 (03 p< (p<0 (25 (89 (0 (p< (2 (8 ( (p

ABSTRACT Visceral leishmaniasis (VL) is a neglected tropical disease caused by the Leishmania infantum parasite. The protozoan is able to infect several domestic and wild mammals. Since the first report on Leishmania spp. infection in horses in South America, leishmaniasis in equids has been highlighted in Brazil. A molecular epidemiological survey was carried out to verify the occurrence of Leishmania spp. DNA in horses and donkeys, in leishmaniases endemic areas in Sao Paulo State, Brazil. To this end, blood samples were obtained from 107 horses and 36 donkeys and subjected to DNA extraction followed by PCR targeting the ITS-1 region. Among the horses and donkeys, 1.87% (2/107) and 8.33% (3/36) were positive by PCR, respectively. The DNA sequencing of the ITS-1 amplification products confirmed L. infantum DNA in these animals. Our results suggest that horses and donkeys from non-VL and VL endemic areas of São Paulo State may be infected by the parasite.

RESUMO: Leishmania infantum é agente etiológico da leishmaniose canina. Por meio de análises parasitológicas e moleculares, a presença do parasita foi investigada em órgãos reprodutivos de cães machos e fêmeas. Amostras de tecidos dos órgãos reprodutivos de 8 cães machos e 16 fêmeas diagnosticados com leishmaniose foram avaliadas por histoquímica, imunohistoquímica e PCR. Apesar de não terem sido observadas lesões macroscópicas ou microscópicas nos órgãos reprodutivos desses cães, formas amastigotas de L. infantum foram observadas em amostras teciduais do testículo e útero. A PCR e o sequenciamento do DNA extraído desses tecidos revelaram sequências 100% idênticas a L. infantum depositadas no GenBank. Nossos resultados sugerem que os testículos e o útero podem abrigar o parasita, sem associação com lesões macroscópicas ou microscópicas, o que pode ter uma grande importância na transmissão venérea e vertical da leishmaniose entre cães.

ABSTRACT: Leishmania infantum causes canine leishmaniasis. Using parasitological and molecular analyses, we identified L. infantum in the reproductive organs of male and female dogs. Using histochemistry, immunohistochemistry, and PCR, we examined tissue samples from the reproductive organs of 8 male dogs and 16 female dogs diagnosed with leishmaniasis. Despite the absence of macroscopic or microscopic lesions in these organs, we observed L. infantum amastigotes in tissue samples from the testis and the uterus. PCR and sequencing of these tissues revealed sequences that matched 100% with L. infantum DNA available at GenBank. The presence of L. infantum amastigotes and DNA in testicular and uterine tissue samples suggested that these organs can harbor the parasite without associated macroscopic or microscopic lesions, and this can be especially important in the vertical and venereal transmission of leishmaniasis in dogs.

Resumo O objetivo deste estudo foi comparar testes moleculares usados para diagnosticar Leishmania spp., em cães apresentando diferentes estágios de infecção. Amostras de sangue e suabe conjuntival (SC) de cães classificados em quatro estágios clínicos foram submetidas a diferentes PCRs (primers 13A/13B, MC1/MC2, LITSR/L5.8S e LEISH-1/LEISH-2). Para o estudo, 22,3% (48/215) dos cães foram classificados como sem sinais clínicos, 67,5% (145/215) estágio I (doença leve), 7,0% (15/215) estágio II (doença moderada) e 3,2% (7/215) estágio III (doença grave). Os resultados mostraram que, em amostras de sangue, 13A/13B detectou número significativamente maior de cães positivos no estágio I (25/145) e no total (42/215) (p≤0,05). No entanto, quando as amostras de SC foram testadas, nenhuma diferença foi observada (p>0,05). Por outro lado, no sangue, MC1/MC2 detectou significativamente menos cães positivos sem sinais clínicos (0/48), em estágio I (0/145) e no total (1/215) (p≤0,05). Da mesma forma, em amostras de SC, MC1/MC2 também apresentou menor detecção (1/215) (p≤0,05). Assim, a PCR em amostras de sangue com 13A/13B tem maior capacidade de detectar cães positivos, principalmente no início da doença do que outros primers, e o par de primers MC1/MC2 não é uma boa escolha para detectar infecção por Leishmania infantum em cães.

Abstract The aim of this study was to compare molecular tests used to diagnose Leishmania spp. in dogs with different stages of infection. Blood and conjunctival swab (CS) samples from dogs classified in four clinical stages were subjected to different PCR protocols (13A/13B, MC1/MC2, LITSR/L5.8S and LEISH-1/LEISH-2 primers). To the study, 22.3% (48/215) of dogs were classified as without clinical signs, 67.5% (145/215) stage I (mild disease), 7.0% (15/215) stage II (moderate disease) and 3.2% (7/215) stage III (severe disease). The results showed that in blood samples, 13A/13B detected a significant higher number of positive dogs in stage I (25/145) and in total (42/215) (p≤0.05). However, when CS samples were tested, no difference was observed (p>0.05). On the other hand, in blood samples, MC1/MC2 detected significantly fewer positive dogs classified as without clinical signs (0/48), in stage I (0/145) and in total (1/215) (p≤0.05). Likewise, in CS samples, this primers showed also lower detection (1/215) (p≤0.05). So than, we can conclude that PCR on blood samples with 13A/13B primers has greater capacity to detect positive dogs, mainly at the initial of clinical disease than do other primers and MC1/MC2 are not a good choice to detect Leishmania infantum infection in dogs.

Abstract: INTRODUCTION: Conjunctival swab PCR was evaluated as a tool to diagnose visceral leishmaniasis in dogs. METHODS: Conjunctival swab PCR was compared to indirect immunofluorescence antibody test and blood PCR. RESULTS: Indirect immunofluorescence was significantly correlated with conjunctival swab PCR (p < 0.05), but not with blood PCR (p > 0.05). In addition, conjunctival swab PCR was significantly associated with presence of clinical symptoms (p < 0.05), whereas blood PCR was associated with absence of clinical symptoms (p < 0.05). CONCLUSIONS: Results indicate that conjunctival swab PCR is useful in epidemiological surveys of canine visceral leishmaniasis.

Resumo Avaliou-se a presença de anticorpos contra Toxoplasma gondii, Neospora caninum e Leishmania spp.; assim como a presença de DNA de Leishmania spp. em cães de Pirassununga-SP, e associou-se sua soropositividade ao local de origem dos animais. Foram coletadas 373 amostras de sangue do canil municipal e de clínicas veterinárias locais, que foram analisadas pelo teste de Imunofluorescência Indireta (RIFI). Do total, 300 amostras foram testadas para T. gondii e N. caninum, das quais 45% (135/300) foram positivas para T. gondii e 24,3% (73/300) para N. caninum. Para Leishmania spp. foram avaliadas 373 amostras pela RIFI, sendo 4,6% (17/373) positivas. Adicionalmente, 145 amostras foram testadas utilizando-se a PCR e, dessas amostras, 0,7% (1/145) foi positiva. Considerando-se os resultados, pode-se concluir que esses parasitos estão presentes na cidade de Pirassununga - SP e que os animais tiveram contato com os protozoários. Faz-se, dessa forma, necessária a divulgação de meios de prevenção às doenças, com o intuito de manter o controle sobre as mesmas, tanto na saúde animal quanto na saúde humana, em relação à leishmaniose e à toxoplasmose.

Abstract We examined the presence of antibodies against the parasites Toxoplasma gondii, Neospora caninum, and Leishmania spp., as well the presence of DNA from Leishmania spp., in dogs from Pirassununga - SP. The seropositivity rate was compared with the animals’ originating location. Three hundred seventy-three blood samples from the county’s kennel and local veterinary clinics were collected and analyzed. A total of 300 samples were tested for T. gondii and N. caninum using an indirect immunofluorescence antibody test (IFAT); 45% (135/300) were positive for T. gondii and 24.3% (73/300) were positive for N. caninum. Three hundred seventy-three samples were tested for Leishmania spp. using the IFAT. Of these, 4.6% (17/373) were positive. Additionally, 145 samples were tested using a polymerase chain reaction (PCR); of these samples, 0.7% (1/145) was positive. Considering the results, we conclude that these parasites are present in the city of Pirassununga - SP and that the animals have contact with the protozoan. It is therefore necessary to create methods for disease prevention to maintain both animal and human health in regard to leishmaniasis and toxoplasmosis.

A importância do cão como fonte de infecção da leishmaniose visceral já é conhecida, mas o papel dos gatos como reservatórios das leishmanioses ainda não está totalmente esclarecido. O presente estudo avaliou a eficácia da PCR de suabe conjuntival (PCR-SC) na detecção de gatos infectados por Leishmania spp. Foram encontrados sete (13,5%) gatos positivos para Leishmania spp. na PCR de suabe conjuntival, dentre 52 animais de Pirassununga - SP e Ilha Solteira - SP testados. Sendo positivos 28,6% (02/07) dos gatos do município de Pirassununga e 11,1% (5/45) dos gatos do município de Ilha Solteira. Os resultados demonstraram que o suabe de conjuntiva ocular foi capaz de detectar gatos infectados por esse protozoário. A coleta de amostras da conjuntiva mostrou ser um método simples, menos invasivo e pouco estressante para os gatos e seus proprietários, o que pode facilitar estudos sobre a frequência e distribuição da leishmaniose felina.

The relevance of the dog as a source of visceral leishmaniasis infection is known, but the role of cats as reservoir hosts for leishmaniasis is not yet fully clear. This study assessed the efficacy of conjunctival swab PCR (CS-PCR) in the detection of cats infected by Leishmania spp. The results were seven (13.5%) cats positive for Leishmania spp. in the PCR, in 52 cats tested from Pirassunuga-SP and Ilha Solteira-SP. From the city of Pirassununga – SP 28.6% (2/7) were positive and from the city of Ilha Solteira – SP 11.1% (5/45) were positive. The results showed that CS-PCR was capable of detecting cats infected by this protozoan. Conjunctival swab samples proved easier to perform in cats, which might facilitate studies on the frequency and distribution of feline leishmaniasis.