RESUMO Objetivo: Caracterizar as vias do influxo de cálcio envolvidas no aumento sustentado da concentração intracelular de cálcio na célula endotelial, essencial para a síntese e a liberação de fatores relaxantes. Métodos: Analisamos o efeito de derivados pirazólicos sintetizados recentemente, descritos como inibidores seletivos para canais ORAI (BTP2/Pyr2 e Pyr6) e TRPC3 (Pyr3 e Pyr10), nos relaxamentos dependentes de endotélio e cálcio extracelular, produzidos por acetilcolina e tapsigargina, em anéis pré-contraídos da aorta torácica de rato. Resultados: As respostas de acetilcolina e tapsigargina foram completamente revertidas por Pyr2 e Pyr6 (1 a 3μM). Pyr3 (0,3 a 3μM) produziu reversão rápida dos relaxamentos de acetilcolina (6,2±0,08mg.s−1) e tapsigargina (3,9±0,25mg.s−1), enquanto o bloqueador mais seletivo para TRPC3, Pyr10 (1 a 3μM), não apresentou efeito. ML204 (1 a 3μM), bloqueador seletivo de TRPC4, descrito há pouco tempo, reverteu os relaxamentos induzidos por acetilcolina de forma completa, mas afetou minimamente aqueles produzidos por tapsigargina. Os derivados pirazólicos ou ML204 não afetaram os relaxamentos estimulados com GSK1016790A (TRPV4-agonista). Ainda, após pré-incubação com Pyr2 e Pyr6, acetilcolina e tapsigargina provocaram relaxamentos transitórios semelhantes em magnitude e cinética àqueles observados na ausência de cálcio extracelular. Os relaxamentos do nitroprussiato de sódio e as contrações induzidas pela fenilefrina (aorta sem endotélio) não foram afetados pelos compostos pirazólicos (1 a 3μM). Conclusão: Essas observações revelaram uma complexidade desconhecida das vias de influxo de cálcio no endotélio da aorta de rato, que resultam na produção e na liberação de óxido nítrico. Vias distinguíveis farmacologicamente medeiam o influxo estimulado por acetilcolina (ORAI TRPC, diferentes de TRPC3 TRPC4) e tapsigargina (TRPC4 não requerido).

ABSTRACT Objective: To characterize the calcium influx pathways implicated in the sustained elevation of endothelial intracellular calcium concentration, required for the synthesis and release of relaxing factors. Methods: We evaluated the effect of the newly synthesized pyrazole derivatives, described as selective inhibitors for ORAI (BTP2/Pyr2 and Pyr6) and TRPC3 (Pyr3 and Pyr10) channels, upon endothelium- and extracellular calcium-dependent relaxations stimulated by acetylcholine and thapsigargin, in pre-constricted rat thoracic aortic rings. Results: Acetylcholine and thapsigargin responses were completely reverted by Pyr2 and Pyr6 (1 to 3μM). Pyr3 (0.3 to 3μM) caused a rapid reversal of acetylcholine (6.2±0.08mg.s−1) and thapsigargin (3.9±0.25mg.s−1) relaxations, whereas the more selective TRPC3 blocker Pyr10 (1 to 3μM) had no effect. The recently described TRPC4/5 selective blocker, ML204 (1 to 3μM), reverted completely acetylcholine relaxations, but minimally thapsigargin induced ones. Noteworthy, relaxations elicited by GSK1016790A (TRPV4 agonist) were unaffected by pyrazole compounds or ML204. After Pyr2 and Pyr6 pre-incubation, acetylcholine and thapsigargin evoked transient relaxations similar in magnitude and kinetics to those observed in the absence of extracellular calcium. Sodium nitroprusside relaxations as well as phenylephrine-induced contractions (denuded aorta) were not affected by any of pyrazole compounds (1 to 3μM). Conclusion: These observations revealed a previously unrecognized complexity in rat aorta endothelial calcium influx pathways, which result in production and release of nitric oxide. Pharmacologically distinguishable pathways mediate acetylcholine (ORAI/TRPC other than TRPC3/TRPC4 calcium-permeable channels) and thapsigargin (TRPC4 not required) induced calcium influx.

Objetivo Descrever e caracterizar os relaxamentos induzidos por um extrato das cascas de Combretum leprosum em anéis de artérias de diferentes espécies de animais.Métodos Anéis (3 a 4mm) de artérias de coelho, rato e porco foram montados em cubas para órgão isolado (Krebs, 37°C, 95%O2/5%CO2) para registro das contrações isométricas. Após um período de estabilização (2 a 3 horas), as contrações foram induzidas com fenilefrina (0,1 a 0,3µM) ou U46619 (10 a 100nM); no platô dessas contrações, adicionamos o extrato Combretum leprosum. Diferentes protocolos foram realizados para determinar potência, duração, reversibilidade e mecanismo dos relaxamentos induzidos pelo extrato.Resultados Em todas as preparações testadas, o extrato de Combretum leprosum (1,5µg/mL) provocou relaxamentos dependentes de endotélio. Em aorta torácica de coelho ou rato, os relaxamentos foram revertidos pela vitamina B12a ou L-NG-nitro-arginina. Em anéis de aorta abdominal de coelho e de artérias coronárias de porco, o extrato causou relaxamentos sensíveis e resistentes à L-NG-nitro-arginina. Em aorta torácica de coelho, o extrato foi relativamente muito potente (EC50=0,20μg/mL) e quando causou relaxamentos; intrigantemente o endotélio continuou a produzir fatores relaxantes por um longo período após remoção do extrato. A magnitude dos relaxamentos induzidos pelo extrato foi significativamente reduzida em ausência Ca2+ extracelular; ademais, o vermelho de rutênio (10μM), um bloqueador de canais TRPs, foi capaz de reverter os relaxamentos induzidos pelo extrato. Análises preliminares indicaram que o extrato continha compostos com reatividade química semelhante à polifenóis.Conclusão O extrato de Combretum leprosum contem compostos bioativos capazes de promover estimulação dependente de Ca2+ das células endoteliais a qual resulta numa produção prolongada de fatores relaxantes.

Objective To describe and to characterize the relaxing effect of an extract of the bark of Combretum leprosum on isolated arterial rings from different animals.Methods Rings (3 to 4mm) from rabbit, rat, or porcine arteries rings were suspended in an organ bath (Krebs, 37°C, 95%O2/5%CO2) to record isometric contractions. After the stabilization period (2 to 3 hours) contractions were induced by the addition of phenylephrine (0.1 to 0.3µM) or U46619 (10 to 100nM), and Combretum leprosum extract was added on the plateau of the contractions. Experiments were performed to determine the potency, duration, reversibility, and to get insights on the potential mechanism involved in extract-induced relaxations.Results In all rings tested, Combretumleprosum extract (1.5μg/mL) was able to cause relaxations, which were strictly endothelium-dependent. In rabbit or rat thoracic aorta rings, the relaxations were reversed by vitamin B12a or L-NG-nitroarginine. In porcine right coronary arteries and rabbit abdominal aorta, extract caused both L-NG-nitroarginine-sensitive and L-NG-nitroarginine-resistant relaxations. In rabbit thoracic aorta, the extract was relatively potent (EC50=0.20µg/mL) and caused relaxations; intriguingly the endothelium continued to produce relaxing factors for a long period after removing the extract. The magnitude of extract-induced relaxations was significantly reduced in the absence of extracellular Ca2+; in addition, the TRPs channels blocker ruthenium red (10µM) was able to revert extract-induced relaxations. Phytochemical analyses indicated that the extract was rich in polyphenol-like reacting substances.ConclusionsCombretum leprosum extract contains bioactive compounds capable of promoting Ca2+-dependent stimulation of endothelial cells which results in a prolonged production of relaxing factors.

OBJETIVO: Determinar a concentração de nitrato/nitrito no líquido cefalorraquidiano e no interstício do corno dorsal entre L6-S1 da medula espinhal em ratas com ou sem cistite induzida por ciclofosfamida. MÉTODOS: Todos os experimentos foram conduzidos usando ratas Wistar. Um probe de microdiálise foi implantado no espaço subaracnoide ou no tecido da medula espinhal nos segmentos L6-S1 (confirmado histologicamente). Dois dias depois, o probe de microdiálise foi perfundido com líquido cefalorraquidiano artificial, contendo ou não NG-monometil-L-arginina. As amostras foram coletadas a cada 15 minutos e mantidas a -20ºC. As concentrações de nitrito/ nitrato foram determinadas por quimiluminescência. RESULTADOS: Nos animais normais, os valores médios das concentrações de nitrito/nitrato, na primeira amostra de microdialisado de líquido cefalorraquidiano e do interstício da medula espinhal, foram semelhantes (482,5±90,2pmol/75µL, n=20, e 505,7±11,5pmol/75µL, n=6, respectivamente), enquanto nas amostras de ratas com cistite, esses valores foram significativamente maiores (955,5±66,3pmol/75µL, n=8, e 926,5±131,7pmol/75µL, n=11, respectivamente). Em ambos os grupos, a NG-monometil-L- arginina causou uma significativa redução na concentração de nitrito/nitrato. Curiosamente, a redução máxima de concentração de nitrito/nitrato causada pela NG-monometil-L- arginina não foi maior que 30% dos valores iniciais. CONCLUSÕES: Esses resultados constituem a primeira demonstração de que as concentrações de nitrito/nitrato no líquido cefalorraquidiano e no interstício da medula espinhal estão elevadas entre 20 e 22 horas após a cistite induzida por ciclofosfamida, e indicando que a cistite está associada a alterações na produção de óxido nítrico, nos segmentos da medula espinhal, nos quais termina a maioria dos aferentes primários da bexiga.

OBJECTIVE: To determine the concentration of nitrate/nitrite in the cerebrospinal fluid and in the dorsal horn interstice of the L6-S1 spinal cord boundary in rats with or without cystitis induced by cyclophosphamide. METHODS: All experiments were conducted using Wistar female rats. A microdialysis probe was implanted in the subarachnoid space or in the spinal cord tissue at the L6-S1 segments (confirmed histologically). Two days later, the microdialysis probe was perfused with artificial cerebrospinal fluid, containing or not NG-monomethyl-L-arginine. Samples were collected every 15 minutes and kept at -20ºC. Nitrite/nitrate concentrations were determined by chemiluminescence. RESULTS: In normal animals, the mean values of nitrite/nitrate concentrations in the first microdialysate sample of the cerebrospinal fluid and of the spinal cord interstice were similar (482.5±90.2pmol/75µL, n=20, and 505.7±11.5pmol/75µL, n=6, respectively), whereas, in the samples from rats with cystitis, these values were significantly greater (955.5±66.3pmol/75µL, n=8, and 926.5±131.7pmol/75µL, n=11, respectively). In both groups, NG-monomethyl-L- arginine caused a significant reduction in the nitrite/nitrate concentration. Interestingly, the maximal reduction of nitrite/nitrate concentration caused by NG-monomethyl-L- arginine was no greater than 30% of the initial values. CONCLUSIONS: These results constitute the first demonstration that nitrite/nitrate concentrations in the cerebrospinal fluid and spinal cord interstice are elevated between 20- and 22 hours after cyclophosphamide-induced cystitis, and indicate that cystitis is associated with changes in the production of nitric oxide in the spinal cord segments, where most primary bladder afferents end.