ABSTRACT It is important to have a PCR technique capable of detecting avian adenovirus 4 with high sensitivity and precision in cell cultures and samples of avian origin. In the present work, a PCR technique was standardized. First, the Internal Reference Material (IRM) was prepared, using cell culture in EB66 cells, infected with FAdV-4; then the virus was purified, the DNA was extracted and the amplicon was quantified. Finally, the temperature gradient test, primer concentration test, sensitivity test and specificity test were carried out using the Q5® High-Fidelity 2X Master PCR kit. Of the five primers used, the HHS*-3 and HHS*-4 primers passed all the tests, with HHS*-3 being the most sensitive as it detected up to 1 pg/µl.

RESUMEN Es importante contar con una técnica de PCR capaz de detectar adenovirus aviar 4 con una alta sensibilidad y precisión en cultivos celulares y muestras de origen aviar. En el presente trabajo se estandarizó una técnica de PCR. Primero se procedió a la preparación del Material de Referencia Interna (M.R.I.), usando el cultivo celular en células EB66, infectado FAdV-4; luego se purificó el virus, se extrajo el ADN y se cuantificó el amplicón. Finalmente se procedió a realizar la prueba de la gradiente de temperatura, prueba de concentración de cebadores, prueba de sensibilidad y prueba de especificidad utilizando el kit de PCR Q5® High-Fidelity 2X Master. De los cinco cebadores utilizados, los cebadores HHS*-3 y HHS*-4 pasaron todas las pruebas, siendo HHS*-3 el más sensible ya que detectó hasta 1 pg/µl.

The objective of the study was to develop a molecular platform for the quantification of Newcastle disease virus (NDV) from a culture system in embryonated SPF eggs. First, four pairs of primers were evaluated that amplify different regions of the NDV viral genome that code for: nucleocapsid protein (NP), protein matrix (M), fusion protein (F) and RNA-dependent RNA polymerase (L) to select the most conserved one from which a molecular platform based on reverse transcription was developed -conventional polymerase chain reaction (RT-PCRc) in two steps for the detection of NDV. Subsequently, it was taken to reverse transcription -real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR) for the quantification of NDV produced from a system of embryonated eggs. Through these techniques, it was determined that the primers for the M gene were adequate according to the optimization criteria for the development of both methods. Sensitivity tests showed that the RT-qPCR (116 genomic copies/µl) was 10 times more sensitive than the RT-PCRc. The primers proved to be specific since there were no amplifications in the negative controls or in other avian pathogens (infectious laryngotracheitis virus, avian metapneumovirus, infectious bronchitis virus, Avibacterium paragallinarum, Gallibacterium anatis and Ornithobacterium rhinotracheale). Due to its sensitivity and specificity, this platform is proposed for the quantification of NDV vaccine when it is produced from an embryonated egg system, as an alternative to conventional titration methods such as hemagglutination, plaque assay, TCDI50 and DIEP50.

El estudio tuvo por objetivo desarrollar una plataforma molecular para la cuantificación del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) a partir de un sistema de cultivo en huevos embrionados SPF. Primero se evaluaron cuatro pares de cebadores que amplifican diferentes regiones del genoma viral de NDV que codifican para la proteína de nucleocápside (NP), proteína matriz (M), proteína fusión (F) y la ARN polimerasa ARN dependiente (L), con la finalidad de seleccionar el más conservado a partir del cual se desarrolló una plataforma molecular basada en la transcripción reversa -reacción en cadena de polimerasa convencional (RT-PCRc) en dos pasos para la detección del NDV. Posteriormente, esta fue llevada a transcripción reversa -reacción en cadena de polimerasa en tiempo real (RT-qPCR) para la cuantificación de NDV producido a partir de un sistema de huevos embrionados. Mediante estas técnicas se determinó que los cebadores para el gen M fueron adecuados según los criterios de optimización para el desarrollo de ambos métodos. Mediante ensayos de sensibilidad se demostró que la RT-qPCR (116 copias genómicas/µl) era 10 veces más sensible que el RT-PCRc. Los cebadores fueron específicos pues no hubo amplificados en los controles negativos ni en otros patógenos aviares (virus de la laringotraqueitis infecciosa, metapneumovirus aviar, virus de la bronquitis infecciosa, Avibacterium paragallinarum, Gallibacterium anatis y Ornithobacterium rhinotracheale). Debido su sensibilidad y especificidad, se propone esta plataforma para la cuantificación de NDV vacunal cuando es producido a partir de un sistema de huevos embrionados, como una alternativa frente a métodos convencionales de titulación como hemaglutinación, ensayo en placa, TCDI50 y DIEP50.