RESUMO Objetivou-se avaliar a separação de espermatozoides caprinos em gradientes de densidade contínuos de Percoll® e a congelabilidade espermática, com ou sem antioxidantes fenólicos. Para tal, pools seminais foram selecionados, congelados e avaliados. O grupo não selecionado (gNS) apresentou menor motilidade progressiva (MP), linearidade (LIN), retilinearidade (STR) e oscilação (WOB) do que os selecionados, bem como menor velocidade linear progressiva (VSL) do que os com catequina ou resveratrol. A amplitude de deslocamento lateral de cabeça (ALH) foi maior no gNS e a quercetina reduziu o potencial de membrana mitocondrial (PMM). Após a descongelação, o gNS manifestou menor MP do que os selecionados, menor VSL e VAP (velocidade média da trajetória) do que os com ou sem catequina, menor LIN e WOB do que os com ou sem catequina ou resveratrol, e menor STR do que os com catequina, além de maior ALH e BCF do que os com ou sem catequina. A integridade da membrana plasmática e as células intactas e vivas foram maiores nas amostras selecionadas e o PMM foi inferior no gNS e no selecionado com quercetina. Portanto, a centrifugação em gradientes contínuos de densidade de Percoll® é uma metodologia viável para selecionar espermatozoides caprinos compatíveis com a congelação, especialmente na presença de catequina ou resveratrol.

ABSTRACT The objectives of this study were to evaluate goat sperm sorting in continuous Percoll® density gradients and gamete freezability, in the presence or absence of phenolic antioxidants. For this, semen pools were sorted, frozen, and evaluated. The non-selected group (NSg) presented lower progressive motility (PM), linearity (LIN), straightness (STR), and wobble (WOB) than the selected groups, and straight line velocity (VSL) compared to those with catechin or resveratrol. The amplitude of lateral head displacement (ALH) was higher in NSg, and quercetin reduced the mitochondrial membrane potential (MMP). After thawing, the NSg presented lower PM than the selected groups, VSL and VAP (average path velocity) than the selected group with or without catechin, LIN and WOB than the selected with or without catechin or resveratrol, and STR than the selected with catechin. Moreover, NSg presented higher ALH and BCF than the samples selected with or without catechin. Plasma membrane integrity and intact and living cells were higher in the selected groups, and MMP was lower in the NSg and the selected group with quercetin. Thus, centrifugation in Percoll® continuous density gradients is a viable methodology to select goat sperm compatible with the freezing, especially in the presence of catechin or resveratrol.

RESUMO Objetivou-se avaliar o efeito de diferentes concentrações de (+)-catequina ou (-)-epigalocatequina galato (EGCG) sobre a congelabilidade do sêmen caprino. Poolsseminais foram processados (experimento 1: 0, 15, 25, 50, 75 ou 100µM de (+)-catequina; experimento 2: 0, 15, 25, 50, 75 ou 100µM de EGCG) e congelados. Após a descongelação, foram avaliadas a cinética, a integridade de membrana plasmática (iMP) e acrossomal, a morfologia e o estresse oxidativo, a zero e a uma hora. No experimento 1, a zero hora, VSL e VAP foram maiores (P<0,05) com 15µM do que com 50 e100; WOB foi menor (P<0,05) com 100µM do que com 0, 15 e 25; e BCF foi maior (P<0,05) com 75 e 100µM do que com 0. No experimento 2, a motilidade progressiva foi maior (P<0,05) com 0 e 15µM do que com 50 e 75; LIN foi menor (P<0,05) com 75 e 100µM do que com 0 e 15; WOB foi maior (P<0,05) com 0 e 15µM; e iMP foi maior (P<0,05) com 100µM do que com 0. Assim, (+)-catequina ou EGCG em altas concentrações inibem, transitoriamente, a cinética de espermatozoides congelados caprinos, e 100µM de EGCG preserva a iMP.

ABSTRACT The aim of this study was to evaluate the effects of different concentrations of (+)-catechin or (-)-epigallocatechin gallate (EGCG) on goat semen freezability. Poolsof semen were processed (Experiment 1: 0, 15, 25, 50, 75, or 100µM (+)-catechin; Experiment 2: 0, 15, 25, 50, 75, or 100µM EGCG) and frozen. After thawing, the samples were evaluated for kinematics, plasma membrane (PMi) and acrosome integrity, morphology, and oxidative stress, at 0 and 1h. In Experiment 1, at 0h, VSL and VAP were greater (P<0.05) with 15µM than with 50 and 100; WOB was lower (P<0.05) with 100µM than with 0, 15, and 25; and BCF was higher (P<0.05) with 75 and 100µM than with 0. In turn, in Experiment 2, progressive motility was higher (P<0.05) with0 and 15µM than with50 and 75; LIN was lower (P<0.05) with75 and100µM than with0 and 15; WOB was higher (P<0.05) with0 and 15µM; and PMi was greater (P<0.05) with100µM than 0. Thus, (+)-catechin or EGCG at higher concentrations inhibits the kinematics of frozen goat sperm, in a transitory way, and 100µM of EGCG preserves the PMi.

RESUMO O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de diferentes concentrações de transresveratrol ou quercetina sobre a capacidade dos espermatozoides caprinos de resistirem à congelação. Seis pools de sêmen, obtidos de seis reprodutores caprinos, foram processados com diferentes concentrações de resveratrol ou quercetina (Experimento 1: 0, 15, 25, 50, 75 ou 100μM de resveratrol; Experimento 2: 0, 15, 25, 50, 75 ou 100μM de quercetina) e congelados. Após o descongelamento, o sêmen foi avaliado quanto à cinética espermática, à integridade das membranas plasmática e acrossomal, à morfologia e ao estresse oxidativo nos tempos zero e uma hora de incubação. Imediatamente após a descongelação (zero hora), o wobble (índice de oscilação) nos grupos tratados com 100μM de quercetina ou de resveratrol foi menor (P<0,05) do que nos tratados com 0 e 25μM de resveratrol e com 0μM de quercetina, respectivamente. Após uma hora de incubação, a motilidade total dos tratamentos com 15, 50 e 75µM de quercetina, assim como a integridade de membrana plasmática em todas as concentrações de quercetina, foi menor (P<0,05) do que à zero hora. Em oposição, a linearidade das amostras de sêmen tratadas com 100µM de quercetina e a retilinearidade daquelas tratadas com 75µM e 100µM de quercetina foram menores (P<0,05) à zero hora do que à uma hora após descongelação. Assim, pode-se concluir que o resveratrol e a quercetina, em concentrações elevadas (100μM), reduzem, transitoriamente, o índice de oscilação de espermatozoides caprinos submetidos à congelação e que a quercetina (75 e 100µM) aumenta a linearidade e a retilinearidade ao longo do tempo, o que pode ser favorável à fertilidade.

ABSTRACT The aim of this study was to evaluate the effect of different concentrations of trans-resveratrol or quercetin on the ability of goat sperm to withstand being frozen. Six pools of semen obtained from six male goats were processed with different concentrations of resveratrol or quercetin (Experiment 1: 0, 15, 25, 50, 75 or 100µM resveratrol; Experiment 2: 0, 15, 25, 50, 75 or 100µM quercetin) and frozen. After thawing, the semen was evaluated for sperm kinematics, plasma membrane and acrosome integrity, morphology and oxidative stress following 0 and 1h of incubation. Immediately after thawing (0h), wobble (oscillation index) in the groups treated with 100µM of quercetin or resveratrol was lower (P<0.05) than in those treated with 0 and 25µM resveratrol and 0µM quercetin, respectively. After 1h of incubation, the total motility in treatments with 15, 50 and 75µM quercetin, as well as the plasma membrane integrity in all quercetin concentrations were lower (P<0.05) than at 0h. In opposition, the linearity of semen samples treated with 100µM quercetin and the straightness of those treated with 75 and 100µM quercetin were lower (P<0.05) at 0h than at 1h after thawing. Thus, it can be concluded that resveratrol and quercetin at high concentrations (100µM) transiently reduce the wobble of goat sperm submitted to frozen storage, and that quercetin (75 and 100µM) increases the linearity and straightness over time, which can be favorable for fertility.

Foram utilizados ejaculados (n=25) de garanhões para avaliar o efeito de glutationa peroxidase (GPx) e cisteína na viabilidade de espermatozoides congelados. O sêmen foi diluído em Botu Crio, com antioxidantes, e foram formados os grupos: G1, Controle; G2, 1U GPx ; G3, 5U GPx; G4, 0,5mM cisteína; G5, 1mM cisteína. Depois foi envasado em palhetas (0,5mL) e congelado. Após descongelação, 37°C por 30 segundos, alíquotas foram analisadas quanto à integridade de membrana plasmática (IMP) e acrossoma (IAc), potencial de membrana mitocondrial (PMM) e cinética, nos tempos zero (T0) e 60 minutos (T60). GPx 5U e cisteína 0,5mM determinaram maior (P<0,05) IAc em T0 do que em T60. Cisteína 1mM resultou em maior (P<0,05) IAc em T60 do que GPx 1 e 5U e cisteína 0,5mM. O PMM de um garanhão no T60 foi mais alto (P<0,05) do que o de dois garanhões. VCL e VAP foram maiores (P<0,05) no T0 do que no T60 do grupo controle, e um garanhão apresentou, em geral, valores cinéticos mais altos (P<0,05) do que os demais. Conclui-se que a adição de glutationa peroxidase, nas concentrações de 1U e 5U, e de cisteína, nas concentrações de 0,5mM e 1mM, não interferem na integridade de espermatozoides criopreservados de equinos, mas preservam os parâmetros cinéticos de VCL e VAP após 60 minutos de incubação. Ressalta-se, ainda, que o garanhão tem uma forte influência nas características espermáticas pós-congelação.

Ejaculates (n=25) of horses were used to assess the effect of glutathione peroxidase (GPx) and cysteine on the viability of frozen sperm cells. Semen was extended at Botu Crio with antioxidants, and divided in groups: G1, control; G2, 1 U GPx; G3, 5U GPx; G4, 0.5mM cysteine and G5, 1mM cysteine, packed in 0.5mL straws, and frozen. After thawing (37° C for 30 seconds) samples were analyzed for plasma membrane (IMP) and acrosome integrity (IAc), mitochondrial membrane potential (MMP) and kinematic, at zero (T0) and 60 minutes after (T60). GPx 5U and cysteine 0.5mM increased (P<0.05) IAc at T0, when compared to T60. Cysteine 1mM resulted in a higher (P<0.05) IAc on T60, than GPx 1 and 5U, and cysteine 0.5mM. The PMM from a stallion on T60 was higher (P<0.05) than those of two stallions. In sperm kinematic, VCL and VAP were higher (P<0.05) at T0 compared to T60 for the control group, and one stallion showed larger (P<0.05) kinematic values than other animals. It is concluded that the addition of glutathione peroxidase at concentrations 1U and 5U, and cysteine, at concentrations of 0.5mM and 1mM, does not interfere with the integrity of cryopreserved equine sperm, but preserves the kinetic parameters VCL and VAP after 60 minutes of incubation. It should be noted also that the stallion has a strong influence on sperm characteristics post-freezing.

Três garanhões foram utilizados para estudar o efeito da adição de trolox e pentoxifilina na motilidade, integridade do acrossoma e DNA de espermatozoides pós-descongelação. Para congelação, utilizou-se Tris-gema com glicerol (5%) em máquina de congelação de sêmen. As amostras foram descongeladas a 37ºC durante 30 segundos e tratadas com: T1= 150µL de sêmen + 150µL de Tris; T2= 150µL de sêmen + 150µL de Tris + 120µM/mL de trolox; T3= 150µL de sêmen + 150µL de Tris + 3,5mM de pentoxifilina e T4= 150µL de sêmen + 150µL de Tris + 3,5mM de pentoxifilina + 120µM/mL de trolox. Após 0, 60 e 120 minutos de incubação (37ºC), as amostras foram analisadas quanto à motilidade, vigor, integridade de acrossoma e DNA. Não houve diferença (P>0,05) entre tratamentos após 0 e 60 minutos de incubação em todos os parâmetros estudados. Após 120 minutos de incubação, verificou-se maior porcentual (P<0,05) de células com motilidade total e progressiva nas amostras do T2. Conclui-se que a adição de trolox após descongelação do sêmen equino preserva a motilidade total e progressiva dos espermatozoides submetidos à incubação a 37ºC durante 120 minutos.

Three stallions were used to study the effect of trolox and pentoxifylline addition on the motility and integrity of acrossome and DNA equine spermatozoa after thawing. Tris-egg-yolg diluent with glycerol (5%) were used to freeze the semen samples in a freezing machine. The samples were thawed at 37ºC during 30 seconds and treated with: T1=150µL of semen + 150µL of Tris; T2= 150µL of semen + 150µL of Tris +150mM/mL of trolox; T3= 150µL of semen + 150µL Tris +3.5mM of pentoxifylline; and T4= 150µL of semen + 150µL of Tris + 3.5mM of pentoxifylline + 150mM of trolox. After 0, 60, and 120 minutes of incubation (37ºC), the samples were analyzed to motility, vigor, and integrity of acrossome and DNA. There was no difference (P>0.05) among treatments considering 0 and 60 minutes of incubation in all studied parameters. After 120 minutes of incubation, it was observed higher percentage (P<0.05) of cells with total and progressive motility in the samples of T2. It can be concluded that the trolox addition after thawing of equine semen preserved total and progressive motility of the sperm incubated at 37ºC during 120 minutes.