Abstract The aim of this study was to identify pathogenic bacteria in fishes from 4 communities on the western Pacific coast of Nicaragua. A total of 62 fishes were collected for microbiological analysis using muscle samples, which were inoculated on thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar and trypticase soy agar. Bacterial identification was carried out by biochemical tests and tests of tolerance to different NaCl concentrations, and the Kirby-Bauer method was used to determine the bacterial resistance. The results revealed the presence of Vibrio metschnikovii in 30.64% (95% CI: 18.36-42.92) of the fish samples, while Salinivibrio costicola was detected in 22.58% (95% CI: 11.37-33.79) of the samples. Coagulase-negative staphylococci (CoNS) were detected in 82.30% (95% CI: 71.94-92.57) of the samples. Species of the genus Vibrio were detected at a concentration of 3.9 × 103 CFU·g-1 in fish samples from the Las Peñitas community and 2.52 × 103 CFU·g-1 in samples from Poneloya, and these values were significantly higher (P = 0.003) than those found for samples from El Tránsito (5.25 × 102 CFU·g-1). Furthermore, 100% of the V. metschnikovii and S. costicola strains were resistant to amoxicillin/clavulanic acid and sensitive to ciprofloxacin. The bacterial load for S. costicola is typical of marine environments and does not represent a health hazard. However, V. metschnikovii can be present in raw fish and it therefore represents a public health hazard, as do CoNS, which are indicators of anthropogenic contamination.

Resumen El objetivo de este estudio fue identificar bacterias patógenas en peces procedentes de 4 comunidades en la costa del Pacífico en el occidente de Nicaragua. Se recolectaron 62 peces para realizar el análisis microbiológico a partir de muestras de músculo, las cuales fueron inoculadas en agar tiosulfato citrato bilis sacarosa y agar tripticasa de soja. La identificación bacteriana se realizó mediante pruebas bioquímicas y de tolerancia a diferentes concentraciones de NaCl, y para determinar la resistencia bacteriana, se empleó el método Kirby-Bauer. Los resultados mostraron presencia de Vibrio metschnikovii en un 30.64% (IC 95%: 18.36-42.92) de las muestras de peces, mientras que Salinivibrio costicola fue detectada en un 22.58% (IC 95%: 11.37-33.79) de las muestras. Staphylococcus coagulasa negativa (SCN) fue detectada en un 82.30% (IC 95%: 71.94-92.57) de las muestras. Especies del género Vibrio fueron detectadas a una concentración de 3.9 × 103 UFC·g-1 en las muestras de peces de la comunidad Las Peñitas y de 2.52 × 103 UFC·g-1 en las de Poneloya, y estos valores fueron significativamente mayores (P = 0.003) que aquellos encontrados para las muestras de El Tránsito (5.25 × 102 UFC·g-1). Además, el 100% de las cepas de V. metschnikovii y S. costicola fueron resistentes a amoxicilina/ácido clavulánico y sensibles a ciprofloxacina. La carga bacteriana de S. costicola es propia de ambientes marinos y no representa riesgo sanitario. Sin embargo, V. metschnikovii puede estar presente en el pescado crudo y, por lo tanto, representa un peligro para la salud pública, así como también lo es SCN, que es un indicador de contaminación antropogénica.

Resumen Introducción. En Nicaragua es necesario estandarizar pruebas moleculares como la PCR en tiempo real (quantitative Polymerase Chain Reaction, qPCR) que mejoren el diagnóstico de leptospirosis en humanos y animales. Objetivo. Evaluar tres qPCR para la detección de leptospiras patógenas en animales domésticos de Nicaragua. Materiales y métodos. Se diseñaron cebadores para la amplificación del gen LipL32 en SYBR Green (SYBR Green-A) y TaqMan, y en otros descritos previamente (SYBR Green-B). Las secuencias de 12 cepas obtenidas de la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) se alinearon para la búsqueda de sondas y cebadores. La sensibilidad analítica se determinó calculando el equivalente genómico detectable, se utilizaron 18 cepas de referencia para la sensibilidad diagnóstica y 28 controles negativos para la especificidad. Los métodos se aplicaron en 129 muestras de orina de animales domésticos. Resultados. En SYBR Green-A se obtuvo un límite de detección de cuatro equivalentes genómicos; en TaqMan, la sensibilidad fue del 94,4 % (IC95% 81,1-100,0). Con SYBR Green-A, se obtuvo una sensibilidad del 77,8 % (IC95% 55,8-99,8), en tanto que con SYBR Green-B fue del 61,1 % (IC95% 35,8-86,4). En las tres pruebas se logró una especificidad del 100 % (IC95% 98,2-100,0). El 26,4 % de las muestras de animales domésticos fueron positivas con SYBR Green-A y el 6,2 % con SYBR Green-B. Conclusiones. El SYBR Green-A presentó un límite de detección bajo, en tanto que las tres técnicas evaluadas mostraron alta especificidad, en tanto que la TaqMan tuvo la mayor sensibilidad.

Abstract Introduction: Molecular biology diagnostic methods such as real-time PCR should be used in Nicaragua to improve the diagnosis of leptospirosis in humans and animals. Objective: To evaluate three qPCR methods for pathogenic Leptospira detection in domestic animals. Materials and methods: Real-time PCR primers were designed for the amplification of specific regions from the Lip 32 gene of Leptospira in SYBER Green (SYBER Green-A) and TaqMan, as well in SYBER Green-B as previously published. The sequences of 12 strains obtained from the database of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) were aligned to select probes and primers. The analytical sensitivity was determined by calculating the detectable genomic equivalent while 18 pathogenic references strains and 28 negative controls were used to evaluate the sensitivity and specificity of each one of the three sets in 129 urine samples of domestic animals. Results: The detection limit of four genomic equivalents per reaction was obtained from SYBR Green-A. The specificities were 94.4% (95% CI: 81.1-100.0) for TaqMan, 77.8% (95% CI: 55.8-99.8) for SYBR Green-A, while for SYBR Green-B it was 61.1% (95% CI: 35.886.4). In the three tests, we obtained a specificity of 100% (95% CI: 98.2-100.0). In the field samples, 26.4% were positive with SYBR Green-A and 6.1% with SYBR Green-B. Conclusion: SYBR Green-A presented the lowest detection limit while the three techniques under evaluation showed high specificity while TaqMan was the most sensitive.

ABSTRACT Objective The objective of this study was to determine the epidemiological characteristics of leptospirosis in pets and in humans in peridomestic settings in Nicaragua between 2014 and 2016. Methods The samples were taken in areas where cases were confirmed in humans using non-probabilistic sampling in 10 of the country's 17 departments. This included 112 urine samples from pets, 129 water samples, and 69 soil samples in order to isolate leptospires in Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris (EMJH) medium. Furthermore, the microscopic agglutination test (MAT) was applied to 263 samples of animal serum, and 88 isolates were analyzed using PCR. Results In 32.6% (101/310) of the samples, spirochetes were isolated: 23.2% (26/112) in the pet urine, 47.3% (61/129) in water samples, and 20.3% (14/69) in soil samples. Isolation analysis showed significant differences (p<0.05) between departments for the different types of samples, and isolation was more frequent in water than in soil (OR = 3.49; CI95%: 1.56-7.80). In total, 14.1% (37/263) of the animals were reactors in the microscopic agglutination test. The most frequent serogroup was Icterohaemorrhagiae (40%). PCR analysis to identify pathogenic species of leptospires resulted in 10.2% (9/88) positive isolations. Conclusions This research demonstrates that pets and environment conditions play an important role in the emergence of outbreaks of leptospirosis, and confirms the endemic behavior of the disease in Nicaragua.

RESUMEN Objetivo El objetivo de este estudio fue conocer las características epidemiológicas de la leptospirosis en animales domésticos y en los casos de leptospirosis humana en áreas peridomésticas en Nicaragua entre 2014 y 2016. Métodos Las muestras se extrajeron en áreas donde se confirmaron casos en humanos utilizando un muestreo no probabilístico en 10 de los 17 departamentos del país. Se incluyeron 112 muestras de orina de animales domésticos, 129 muestras de agua y 69 de tierra para aislar leptospiras en medio Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris (EMJH). Además, se aplicó la prueba de microaglutinación (MAT) en 263 muestras de suero de animales y 88 aislados se analizaron mediante PCR. Resultados En 32,6% (101/310) de las muestras se aislaron espiroquetas, 23,2% (26/112) se aislaron en la orina de animales domésticos, 47,3% (61/129), en las muestras de agua y 20,3 % (14/69), en las de tierra. El análisis de aislamiento mostró diferencias significativas (P < 0,05) entre los departamentos para los diferentes tipos de muestras, y el aislamiento fue más frecuente en agua que en tierra (OR = 3,49; IC95%: 1,56-7,80). El 14,1% (37/263) de los animales fueron reactores en la prueba de microaglutinación. El serogrupo más frecuente fue Icterohaemorrhagiae (40%). En el análisis con la PCR para identificar leptospiras de las especies patógenas 10,2% (9/88) de los aislamientos fueron positivos. Conclusiones Esta investigación demuestra que los animales domésticos y el ambiente desempeñan un papel importante en la aparición de brotes de la leptospirosis y confirma el comportamiento endémico de la enfermedad en Nicaragua.

RESUMO Objetivo Descrever as características epidemiológicas da leptospirose em animais domésticos e em casos de leptospirose humana em áreas peridomiciliares na Nicarágua entre 2014 e 2016. Métodos As amostras foram coletadas por amostragem não probabilística em áreas com casos confirmados de leptospirose humana em 10 das 17 províncias do país. Foram analisadas 112 amostras de urina de animais domésticos, 129 amostras de água e 69 amostras de solo com o uso do meio de cultura padrão para o isolamento de leptospiras (Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris, EMJH). Além disso, foi realizado o teste de aglutinação microscópica em 263 amostras séricas de animais e 88 isolados foram analisados com a técnica de PCR. Resultados Em 32,6% (101/310) das amostras foram isoladas espiroquetas, sendo 23,2% (26/112) isoladas na urina de animais domésticos, 47,3% (61/129) nas amostras de água e 20,3% (14/69) nas amostras de solo. Houve diferença significativa (P < 0,05) entre as províncias no isolamento nos diferentes tipos de amostras analisadas, sendo o isolamento mais frequente nas amostras de água que de solo (OR = 3,49; IC95%: 1,56–7,80). Reatividade no teste de aglutinação microscópica foi observada em 14,1% (37/263) das amostras de animais. O sorogrupo mais frequentemente isolado foi Icterohaemorrhagiae (40%). A técnica de PCR demonstrou que 10,2% (9/88) dos isolados eram positivos para espécies patogênicas de leptospiras. Conclusões Esta pesquisa demonstra que os animais domésticos e o entorno têm papel importante no surgimento de surtos de leptospirose e confirma o comportamento endêmico da doença na Nicarágua.

This paper present the phenotypic and molecular characterization of eight strains of Leptospira isolated from Nicaragua clinical cases. The phenotypic characterization results showed absence of cell growth on culture media incubated at 13 °C or 8-azaguanina (2.25 mg/mL) supplemented medium. Besides a conversion to spherical shapes at 60 min to exposure NaCl 1M supplemented medium was observed. The molecular characterization was carried out by polymerase chain reaction (PCR) of ompL1 and lipL32 genes stored with pathogen strains. The results demonstrated the presence of amplified bands for both genes on eight strains, which allow to affirm that the analyzed microorganisms are Leptospira pathogens strains.

En este trabajo se caracterizaron ocho cepas de Leptospira, aisladas de casos clínicos en Nicaragua mediante métodos fenotípicos y moleculares, las cuales no mostraron crecimiento a 13 °C ni en medio suplementado con 8-azaguanina (2,25 mg/mL). Se observó la conversión a formas esféricas a los 60 min de estar expuestas en un medio suplementado con NaCl 1M. Para la caracterización molecular de los aislamientos se realizó la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) de genes conservados con cepas patógenas, cuyos productos génicos confieren virulencia al microorganismo ( ompL1 y lipL32 ). Los resultados de este ensayo demostraron la presencia de bandas de amplificación de los genes ompL1 y lipL32 para los ocho aislamientos, lo que permite afirmar que los microorganismos analizados constituyen cepas de Leptospira patógenas, según los métodos fenotípicos y moleculares recomendados.