El virus chikungunya (CHIKV) es un Alfavirus causante de la fiebre chikungunya (CHIKF). En Venezuela, una región desprovista de inmunidad contra CHIKV y con presencia de Aedes aegypti y Aedes albopictus, el primer caso importado fue reportado por las autoridades sanitarias en junio de 2014. Por la relevancia del hecho, se analizaron 94 muestras de pacientes febriles que acudieron a los centros de salud públicos y privados del estado Aragua entre enero y diciembre de 2014, mediante la detección de los fragmentos de los genes nsP4 (Alfavirus) y E1 (CHIKV) utilizando técnicas moleculares, como Transcripción Reversa acoplada a Reacción en Cadena de la Polimerasa (RT-PCR) y/o secuenciación nucleotídica. Los resultados indicaron positividad en 19,2 % de las muestras analizadas. Se vieron afectados pacientes con edades entre 6 y 66 años, con predominio del sexo femenino (12/18). Clínicamente, todos los pacientes positivos a CHIKV manifestaron signos y síntomas asociados a CHIKF, tales como fiebre (18/18), artralgia (18/18) y erupción (16/18), entre otros. A pesar de que la positividad puede considerarse baja con relación a lo reportado en otras comunidades, este estudio representa el primer reporte local de detección molecular de CHIKV en Venezuela (estado Aragua) durante el año 2014.

Chikungunya virus is an Alphavirus that causes chikungunya Fever (CHIKF). In Venezuela, a region devoid of immunity against CHIKV and presence of Aedes aegypti and Aedes albopictus. The first imported case was reported by health authorities in June 2014. The relevance of the fact, 94 samples of febrile patients who came to the centers of public and private health Aragua state between january and december for detection of the nsP4 (Alphavirus) and E1 (CHIKV) fragments were analyzed by molecular techniques (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction and/or nucleotide sequencing). The results showed 19.2 % of positivity by CHIKV. Clinically all CHIKV positive patients showed signs and symptoms related with CHIKF, such as fever (18/18), arthralgia (18/18) and rash (16/18), among others. Were affected patients between the ages of 6 and 66 years with a predominance of the female sex (12/18). Although the positivity may be considered low compared to those reported in other communities, this represents the first local report of molecular detection of CHIKV in Venezuela (Aragua state) during 2014.

Las infecciones por virus Dengue (DENV) representan un grave problema de salud pública debido a las altas tasas de morbilidad y mortalidad que causan, además no cuentan con tratamiento clínico específico, ni vacuna. Con el fin de reforzar el diagnóstico de laboratorio para los sistemas de vigilancia epidemiológica en países tropicales con recursos económicos limitados, se optimizó una metodología utilizando papel de filtro para la recolección de muestras y el subsiguiente diagnóstico molecular de los serotipos de DENV. Se emplearon cepas controles correspondientes a todos los serotipos virales, así como 35 muestras de sangre total dispensadas en papel de filtro que fueron mantenidas a temperatura ambiente por 36 meses. Las muestras fueron analizadas mediante RT-PCR para la amplificación de la región del genoma correspondiente a 5´UTR-C de los DENV. Los resultados mostraron la amplificación de los mencionados fragmentos en 88,6% de las muestras analizadas, así como de las cepas controles. Estos resultados evidenciaron la utilidad del papel de filtro para conservación de muestras obtenidas de pacientes con sospecha clínica de dengue ubicados en zonas donde no es posible realizar análisis de laboratorio de forma inmediata, así como su uso para el diagnóstico molecular. De este modo se reforzaría la vigilancia en áreas, donde no hay laboratorios con capacidad para confirmar casos de DENV.

Dengue virus infections (DENV) are a severe public health problem due to the high rates of morbidity and mortality involved, and the fact that no clinical treatment or vaccines are available. In order to strengthen the laboratory diagnosis for surveillance systems in tropical countries with low resources, we report an optimized method using filter paper for blood spotting and subsequent molecular diagnosis of DENV serotypes. Control strains of all serotypes, as well as 35 whole blood patient samples dispensed on filter paper, were stored at room temperature for as long as 36 months. RT-PCR of 5’UTR-C fragment was amplified through adapted protocols to diagnose all dengue serotypes. Results showed amplification for all four viral serotypes, including control viral strains and 88.6 % of the samples. These results allowed determining the utility of filter paper for the preservation of samples regularly obtained from patients with clinical suspicion of dengue in settings where low resources do not permit an immediate analysis of the samples. Likewise, this study evidence the possibility of molecular diagnosis of DENV from multiple areas of the world where there are no laboratories with the capacity to confirm DENV cases.

Los flavivirus y alfavirus afectan la salud de los humanos. En Venezuela y de forma particular en Aragua, las comunidades se han visto afectadas por algunos de los miembros de estos géneros, como Dengue (DENV), y Chikungunya (CHIKV). DENV circula en Aragua desde 1989 causando brotes de importancia clínica, mientras que CHIKV hizo su aparición en 2014. En Aragua, el diagnóstico se había dirigido hacia la detección de DENV, sin embargo la situación con CHIKV generó la necesidad de ampliar el espectro diagnóstico hacia otros agentes virales. En el Laboratorio Regional de Diagnóstico e Investigación del Dengue y otras Enfermedades Virales se adaptaron dos protocolos de RT-PCR previamente descritos para detectar miembros de estos géneros haciendo uso de cepas controles para flavivirus (DENV y Zika) y alfavirus (CHIKV). Ambas técnicas sufrieron modificaciones en la concentración de algunos reactantes (MgCl2, dNTP´s, y cebadores) utilizados en la segunda reacción de PCR. El resto de las condiciones se mantuvieron iguales a las descritas originalmente. Las metodologías estandarizadas permitieron amplificar hasta 1 fg de ARN viral de los controles empleados (Zika y CHIKV) con posibilidad de amplificar cantidades menores a esta. En todos los casos se obtuvieron bandas nítidas e íntegras de acuerdo a los tamaños esperados haciendo uso de cepas previamente identificadas de DENV, CHIKV y Zika. La puesta en marcha de estas metodologías permitirá fortalecer el diagnóstico oportuno de miembros de estos géneros en el marco del sistema de vigilancia epidemiológica de enfermedades virales.

Flavivirus and alphavirus affect the health of humans. In Venezuela and particularly in Aragua, the communities have been affected by some members of these genus, such as dengue (DENV), and Chikungunya (CHIKV). DENV circulating in Aragua since 1989 generating outbreaks of clinical importance, while CHIKV made its appearance in 2014. In Aragua state, the diagnosis had been directed toward the detection of DENV, however the situation with CHIKV generates the need to expand the diagnosis spectrum to other viral agents. In the LARDIDEV we adapted two methodology of RT-PCR´s previously de scribed to detect members of these genus using flavivirus (DENV y Zika) and alphavirus (CHIKV) control strains. Both techniques were modified in the concentration of some reactants (MgCl2, dNTP´s, and primers) in the second reaction of PCR. The other conditions are kept equal to those originally described. Both techniques allowed amplified up to 1 fg of RNA of viral strains (Zika and CHIKV virus), but it could to amplify smaller amounts. In all cases, sharp bands according to the expected sizes using previously identified strains of DENV, CHIKV and Zika virus were obtained. The implementation of these methodologies will strengthen the timely diagnosis of members of this genus within the system of epidemiological surveillance of viral diseases.

ABSTRACT The purpose of the study was to obtain a positive control to validate molecular techniques (reverse transcription- polymerase chain reaction [RT-PCR]) used in the diagnosis and research of viral infections. From strains of Chikungunya virus (CHIKV), Zika virus, and Dengue virus (DENV-1, DENV-2, DENV- 3, and DENV-4) viral RNAs were extracted to obtain complementary DNA using RT-PCR from the nsP4 (CHIKV), NS5 (Zika virus), C/prM-M, and 5′UTR-C (DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4) sequences, which were cloned into pGEM®-T Easy. Cloning was confirmed through colony PCR, from which plasmid DNA was extracted for fragment cloning verification. Cloning of cDNA corresponding to nsP4, NS5, C/prM-M, and 5′UTR-C of the different viral agents was achieved. In conclusion, recombinant plasmids were obtained with each of the sequences specified for further assessment as positive controls in molecular techniques in an effort to avoid the use of cell cultures, which can be costly, time-consuming, and potentially dangerous.

RESUMEN El objetivo de la investigación fue obtener controles positivos para la validación de técnicas moleculares (RT-PCR) utilizadas en diagnóstico e investigación de infecciones virales. A partir de cepas de CHIKV, Zika, DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4, se extrajeron ARN virales para obtener por RT-PCR los ADN complementarios (ADNc) de las secuencias nsP4 (CHIKV), NS5 (virus Zika), C/prM-M y 5´UTR-C (DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4) que fueron clonados en pGEM®-T Easy. La clonación se confirmó mediante PCR de colonias, de las cuales se extrajo el ADN plasmídico para la verificación de la clonación de los fragmentos. Se logró la clonación de ADNc correspondientes a nsP4, NS5, C/prM-M y 5´UTR-C de los distintos agentes virales. En conclusión se obtuvieron los plásmidos recombinantes con cada una de las secuencias especificadas para su posterior valoración como controles positivos en técnicas moleculares, evitando el uso de cultivos celulares que pueden resultar costosos, laboriosos y potencialmente peligrosos.

The purpose of the study was to obtain a positive control to validate molecular techniques (reverse transcription- polymerase chain reaction [RT-PCR]) used in the diagnosis and research of viral infections. From strains of Chikungunya virus (CHIKV), Zika virus, and Dengue virus (DENV-1, DENV-2, DENV- 3, and DENV-4) viral RNAs were extracted to obtain complementary DNA using RT-PCR from the nsP4 (CHIKV), NS5 (Zika virus), C/prM-M, and 5′UTR-C (DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4) sequences, which were cloned into pGEM®-T Easy. Cloning was confirmed through colony PCR, from which plasmid DNA was extracted for fragment cloning verification. Cloning of cDNA corresponding to nsP4, NS5, C/prM-M, and 5′UTR-C of the different viral agents was achieved. In conclusion, recombinant plasmids were obtained with each of the sequences specified for further assessment as positive controls in molecular techniques in an effort to avoid the use of cell cultures, which can be costly, time-consuming, and potentially dangerous.

El objetivo de la investigación fue obtener controles positivos para la validación de técnicas moleculares (RT-PCR) utilizadas en diagnóstico e investigación de infecciones virales. A partir de cepas de CHIKV, Zika, DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4, se extrajeron ARN virales para obtener por RT-PCR los ADN complementarios (ADNc) de las secuencias nsP4 (CHIKV), NS5 (virus Zika), C/prM-M y 5´UTR-C (DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4) que fueron clonados en pGEM®-T Easy. La clonación se confirmó mediante PCR de colonias, de las cuales se extrajo el ADN plasmídico para la verificación de la clonación de los fragmentos. Se logró la clonación de ADNc correspondientes a nsP4, NS5, C/prM-M y 5´UTR-C de los distintos agentes virales. En conclusión se obtuvieron los plásmidos recombinantes con cada una de las secuencias especificadas para su posterior valoración como controles positivos en técnicas moleculares, evitando el uso de cultivos celulares que pueden resultar costosos, laboriosos y potencialmente peligrosos.

El diagnóstico precoz de la infección por el virus dengue (DENV) constituye un elemento clave para la prevención de las complicaciones clínicas propias de la enfermedad. El objetivo del estudio fue evaluar la detección de DENV mediante un ensayo cuantitativo de PCR-tiempo real (qPCR), desarrollado localmente, utilizando la región no-estructural-5 (NS5), versus dos regiones tradicionalmente empleadas para la detección del virus, la región cápside/pre-membrana (C-prM), y la región noncodificante-3’ (3’NC). Se recolectaron 167 muestras de suero de pacientes en fase aguda de la enfermedad. Las tres regiones génicas tuvieron perfiles de amplificación/coeficientes de correlación similares (0,987-0,999). Sin embargo, la región NS5 tuvo la eficiencia de amplificación más elevada para los cuatro serotipos (98-100%). Durante el proceso de validación, 41,1% (67/167) de las muestras de suero resultaron positivas para DENV al menos por dos de las regiones genómicas empleadas. Los valores de concordancia entre las regiones NS5/C-prM y NS5/3’NC fueron de 56,7% y 97%, respectivamente. La concordancia fue débil entre las regiones NS5/C-prM (k= 0,109; CI 95%), sin embargo, fue moderada entre las regiones NS5/3’NC (k= 0,489; CI 95%). El ensayo de tipificación uniplex en formato NS5/TaqMan® mostró alta sensibilidad (100%) que el protocolo C-prM/SYBRGreen®-I (76%). La validación externa del ensayo mostró una alta sensibilidad (100%), especificidad (78%) y acuerdo alto entre los ensayos utilizados. De acuerdo a los resultados obtenidos, la región NS5 ofrece la mayor opción para la detección y serotipificación del DENV en muestras clínicas.

Early diagnosis of dengue virus (DENV) infection represents a key factor in preventing clinical complications attributed to the disease. The aim of this study was to evaluate the amplification efficiencies of an in-house quantitative real time-PCR (qPCR) assay of DENV, using the non-structural conserved genomic region protein-5 (NS5) versus two genomic regions usually employed for virus detection, the capsid/pre-membrane region (C-prM) and the 3’-noncoding region (3’NC). One-hundred sixty seven acute phase serum samples from febrile patients were used for validation purposes. Results showed that the three genomic regions had similar amplification profiles and correlation coefficients (0.987-0.999). When isolated viruses were used, the NS5 region had the highest qPCR efficiencies for the four serotypes (98-100%). Amplification from acute serum samples showed that 41.1% (67/167) were positive for the universal assay by at least two of the selected genomic regions. The agreement rates between NS5/C-prM and NS5/3’NC regions were 56.7% and 97%, respectively. Amplification concordance values between C-prM/NS5 and NS5/3’NC regions showed a weak (k= 0.109; CI 95%) and a moderate (k= 0.489; CI 95%) efficiencies in amplification, respectively. Serotyping assay using a singleplex NS5-TaqMan® format was much more sensitive than the C-prM/SYBR Green® I protocol (76%). External evaluation showed a high sensitivity (100%), specificity (78%) and high agreement between the assays. According to the results, the NS5 genomic region provides the best genomic region for optimal detection and typification of DENV in clinical samples.

El dengue es la enfermedad viral más importante transmitida por mosquitos a humanos por su alta morbimortalidad y el potencial de diseminación de su vector Aedes aegypti. Además, la falta de una vacuna y medicamentos antivirales específicos, así como el incremento progresivo de las infecciones secundarias y la hiperendemicidad en diferentes países, hacen de esta enfermedad un problema de salud pública. Existen cuatro serotipos del virus del dengue (DENV), dentro de cada serotipo se han descrito varios genotipos, constituidos a su vez por diferentes linajes o clados. La epidemiología molecular combina los análisis filogenéticos de los DENV detectados en un área geográfica, en un tiempo definido, con la información clínica y epidemiológica disponible. El objetivo de estos estudios es tratar de establecer asociaciones entre genotipos o linajes virales con el origen (ancestros), procedencia geográfica, ruta de transmisión viral, severidad de la enfermedad, grupos poblacionales afectados, y la intensidad y extensión de los brotes epidémicos. La epidemiología molecular ha generado información relevante como la etiología del DENV genotipo Asiático en los casos graves de dengue de la epidemia ocurrida en Venezuela en 1989, y la identificación de cambios nucleotídicos puntuales en el genoma viral asociados a propiedades biológicas fundamentales. En la actualidad se hace necesario realizar análisis exhaustivos del genoma viral completo, conjuntamente con el análisis bioinformático, biológico, clínico y epidemiológico de los cuatro serotipos circulantes en los países endémicos, así como instaurar en los laboratorios adscritos a los sistemas de vigilancia epidemiológica del dengue, la vigilancia molecular para la identificación de genotipos (o linajes) circulantes, lo que contribuiría entre otros aspectos al control efectivo de la enfermedad por DENV.

Dengue is the most important viral disease transmitted by mosquitoes to humans in tropical and subtropical regions of the world. This is the result of its high morbidity and mortality, the spread potential of the vector Aedes aegypti, the lack of effective vaccines and specific antiviral drugs, the gradual increase in secondary infections and hyperendemicity differences in distinct countries. There are four serotypes of dengue virus which are phylogenetically grouped in genotypes and subdivided in lineages or clades. Molecular epidemiology combines phylogenetic analysis of DENV detected in particular geographic areas within a defined time with the available clinical and epidemiologic information. The objective of these studies is to look for relationships between genotypes or lineages, viral origin, geographical spreading and routes of viral transmission, disease severity, population groups affected, and the intensity, speed and extent of outbreaks. Also, molecular epidemiology has generated relevant information such as the Asian genotype DENV etiology in cases of the severe dengue epidemic in Venezuela in 1989, and the identification of specific nucleotide changes in the viral genome associated with its fundamental biological properties. However, analysis of the complete viral genome, together with bioinformatic, biological, clinical and epidemiological analysis corresponding to the four serotypes circulating in endemic countries should be performed. Molecular surveillance for the identification of genotypes (or strains) circulating should be implemented in the laboratories responsible for the epidemiological surveillance of dengue, which would improve the effective control of DENV.

Se realizó un estudio retrospectivo y longitudinal en el área metropolitana de Maracay para el período 1997-2005, a fin de determinar si las variables climáticas y entomológicas influyen sobre la casuística de dengue. Se obtuvieron los datos climatológicos diarios y mensuales de la Estación Climatológica de la Universidad Central de Venezuela y los datos epidemiológicos basados en casos confirmados y muy sugestivos reportados por el Laboratorio Regional de Diagnóstico e Investigación del Dengue y otras Enfermedades Virales (LARDIDEV). Los datos entomológicos se obtuvieron de colectas de adultos de Aedes aegypti (L.) realizadas durante el período Noviembre 2000-Diciembre 2001. La abundancia del vector varió de 3,6 Aedes/casa durante el mes de Abril (período de sequía) a 14,7 Aedes/casa durante el mes de Agosto (período de lluvia). El análisis de correlación de Pearson mostró correlación positiva entre el número de casos reportados con la precipitación (r= 0,7183, P = 0,0038) y la abundancia de Ae. aegypti (r= 0,677, P = 0,0078), pero no con la temperatura ni la humedad relativa para el período Noviembre 2000-Diciembre 2001. El análisis de regresión mostró que para dos meses de rezago existe una regresión lineal altamente significativa (P < 0,0001) con un ajuste de R2= 88,7%, indicando que en promedio, la mayor casuística de dengue ocurre dos meses después de ocurrido el pico de precipitación. Los resultados obtenidos podrían ser utilizados para diseñar e implementar programas para la vigilancia epidemiológica y entomológica del dengue, así como establecer un sistema de alerta temprana para la prevención de brotes y/o epidemias de la enfermedad.

In order to determine the influence of climatic and entomological variables on the number of dengue cases, a retrospective and longitudinal study was conducted in the metropolitan area of Maracay during the period 1997-2005. Daily and monthly climatological data was obtained from the Climatological Station at the Universidad Central de Venezuela and epidemiological data based on confirmed and highly suggestive cases reported by the Regional Laboratory for Diagnosis and Research on Dengue and other Viral Infections (LARDIDEV). Aedes aegypti (L.) adults were collected monthly between November 2000 and December 2001. Vector abundance varied from 3,6 Aedes/house during April (dry season) to 14,7 Aedes/house (rainy season). Pearson correlation analysis showed a positive correlation between the number of dengue cases and rainfall (r= 0,7182, P =0,0038) and abundance of Ae. aegypti (r= 0,667, P =0,0078), but no correlation was found with temperature or relative humidity. Regression analysis showed that there was a highly significant relation (R2 = 88,7%, P< 0,0001) between rainfall and dengue cases at a lag of 2 months. The present results might be used to design and implement programs for the epidemiological and entomological dengue surveillance as well as to establish an early warning system to prevent epidemics.

Con el objetivo de estimar las tasas de incidencia de infecciones sintomáticas y asintomáticas por virus dengue (DENV) durante un año (octubre 2006-septiembre 2007) en cuatro barrios de Maracay (Venezuela) se realizó un estudio prospectivo consistente de visitas domiciliarias, tres veces por semana, para detectar casos de dengue y de encuestas serológicas semestrales para determinar infecciones asintomáticas probables por DENV. Los sujetos de estudio pertenecían a una cohorte de 2663 personas ≥5 años de edad. El diagnóstico confirmatorio de DENV se realizó mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR). Las pruebas serológicas se realizaron mediante el ensayo inmunoenzimático de captura de IgM anti-dengue (MAC-ELISA). Los resultados determinaron tasas de incidencia de 5,7 y 18,6 por 100 000 personas/día (p/d) para las infecciones sintomáticas y asintomáticas, respectivamente. La tasa de incidencia de las infecciones sintomáticas observada en las personas <15 años de edad fue significativamente mayor que la encontrada en los sujetos ≥15 años (15,8 versus 2,9 por 100 000 p/d). Por otro lado, las tasas de incidencia de las infecciones asintomáticas en ambos grupos de edad fueron similares (17,3 y 18,9 por 100 000 p/d, respectivamente). Se detectaron los cuatro serotipos del DENV en tres de los barrios estudiados. Se observó que la edad y la hiperendemicidad fueron probablemente los factores que más contribuyeron a la incidencia del dengue en los cuatro barrios investigados. Seguramente, las infecciones asintomáticas contribuyeron a incrementar la transmisión viral en el área de estudio.

The incidence rates of symptomatic and asymptomatic dengue virus (DENV) infections in four "barrios" of Maracay, Venezuela, during one-year (October 2006-September 2007) were estimated. A prospective study consisting of house visits three-times a week to detect dengue cases, and semiannual serological surveys to determine probable asymptomatic dengue virus (DENV) infections was conducted. The study subjects belonged to a cohort of 2,663 people ≥5 year-old. Confirmatory diagnosis of DENV infections was carried out by reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). Serological surveys were performed by anti-dengue IgM-capture immunoassay (MAC-ELISA). The results showed that the incidence rates for symptomatic and asymptomatic infections were determined to be 5.7 and 18.6 per 100,000 persons/day (p/d), respectively. The incidence rate of symptomatic infections was significantly higher in persons <15 year-old than that found in subjects ≥15 years (15.8 versus 2.9 per 100,000 p/d). On the other hand, the incidence rates of asymptomatic infections in both age groups were similar (17.3 and 18.9 per 100,000 p/d, respectively). All four DENV serotypes were detected in three of the four "barrios" studied. Finally, age and hyperendemicity were probably the contributing factors to the incidence of dengue in the four "barrios" investigated. Surely, the asymptomatic infections contributed to increase the viral transmission in the study area.

INTRODUCTION: the dengue virus causes a growing public health problem, but it has not been possible yet to determine the role of some biological attributes in the virulence and /or pathogeneity of viral serotypes. OBJECTIVE: to evaluate the in vitro and in vivo biological properties of 4 Venezuelan DENV-2 strains (LAR1693, LAR19094, LAR2303, IHN35262) responsible for dengue fever and dengue hemorrhagic fever and the reference strain (16681) isolated from a patient suffering dengue hemorrhagic fever and dengue shock syndrome. METHODS: the evaluated strains were isolated from sera of viremic patients with dengue fever and dengue hemorrhagic fever. They were then subjected to the plaque titration assay in BHK-21 cell line in order to determine the plaque size and kinetics of viral replication. The length of time and intensity of cytopathic effect and specific immunofluorescence on the C6/36-HT cell line was evaluated by optical microscopy and fluorescence respectively. Additionally, the flow cytometry to quantify viral replication in C6/36-HT cells and the intracerebral inoculation in newborn mice to find out neurovirulence were both used. RESULTS: all strains, except for 16681, showed small plaques at 0.01 m.o.i. The viral replication in C6/36-HT was higher for 16681 strain. Through cytophatic effect observations the strains were classified with low (LAR19094 and LAR2303), mild (INH35262 y 16681) and high (LAR1693) cytophatogeneity. The specific immunofluoresce ranged 5 to 50 % in the first day post inoculation, except for 16681 strain. The neurovirulence in newborn mices inoculated with 10(4) pfu/mL yielded 77.5 (INH35262) to 100% (LAR1693 y 16681) mortality rate and variability during survival days. The viral replication at 24.36 and 48 hours after inoculation was assessed by flow cytometry, ranging from 3.33 to 90.3% CONCLUSIONS: the results led to the conclusion that viral strain behaviors were not sound evidence to correlate these in vitro e in vivo biological attributes with the severity of the clinical pictures.

INTRODUCCIÓN: el virus del dengue es responsable de un creciente problema de salud pública, sin que se haya dilucidado aún el papel de algunos atributos biológicos en la virulencia y(o) patogenicidad de los serotipos virales. OBJETIVO: evaluar propiedades biológicas in vitro e in vivo de 4 cepas venezolanas de DENV2 (LAR1693, LAR19094, LAR2303, INH35262) causantes de fiebre de dengue y fiebre hemorrágica del dengue y la cepa (16681) aislada de un paciente con fiebre hemorrágica del dengue /síndrome de choque del dengue. MÉTODOS: las cepas evaluadas fueron aisladas de sueros de pacientes virémicos con fiebre de dengue y fiebre hemorrágica del dengue. La titulación se realizó mediante el ensayo de titulación en placas en la línea celular BHK-21, esta metodología permitió determinar el tamaño de placa y la cinética de multiplicación viral. Se determinó el tiempo y la intensidad del efecto citopático e inmunofluorescencia específica en la línea celular C6/36-HT mediante las técnicas de microscopia óptica y de fluorescencia, respectivamente. De manera adicional, se emplearon las metodologías de citometría de flujo para cuantificar la replicación viral en las células C6/36-HT y la inoculación en ratones lactantes para la determinación de neurovirulencia. RESULTADOS: las cepas, excepto 16681, produjeron placas pequeñas (m.o.i.: 0,01). La replicación viral en C6/36-HT fue mayor para 16681. El efecto citopático permitió clasificar las cepas en baja (LAR19094 y LAR2303), moderada (INH35262 y 16681) y alta citopatogenicidad (LAR1693). El primer día posinoculación se detectó inmunofluorescencia entre 5 y 50 %, excepto para 16681. La neurovirulencia en ratones lactantes inoculados con 10(4) ufp/mL causó 77,5 % (INH35262) a 100 % (LAR1693 y 16681) de mortalidad, con variabilidad en los días de supervivencia. La replicación viral (24, 36 y 48 h posinoculación) mediante citometría de flujo fue desde 3,33 % hasta 90,3 %. CONCLUSIONES: los resultados permitieron concluir que el comportamiento de las cepas virales no fue evidencia suficiente para correlacionar estos atributos biológicos in vitro e in vivo con la severidad de los cuadros clínicos.

La eficacia de un sistema de vigilancia epidemiológica proactivo para predecir epidemias de dengue depende de la capacidad del laboratorio para detectar tempranamente la circulación viral. Este estudio muestra los resultados de la vigilancia virológica y serológica del dengue, realizada en el estado Aragua (Venezuela) desde Octubre 1997 hasta Diciembre 1998. Se evaluaron 547 sueros de pacientes sospechosos de dengue mediante las técnicas de Aislamiento Viral y Serotipificación por Inmunofluorescencia (AVSI), Reacción en Cadena de la Polimerasa con Transcriptasa Inversa (RT-PCR), Inmunoensayo Enzimático de Captura de IgM anti-dengue (MAC-ELISA) e Inhibición de la Hemaglutinación (IHA). De los sueros examinados, 97,4% resultaron positivos a por lo menos una técnica; de estos, 60,4% fueron clasificados como casos confirmados (virológicamente positivos) y 39,6% como casos probables (virológicamente negativos, serológicamente positivos). Aunque la gran mayoría de los casos positivos ocurrieron en los períodos epidémicos de 1997 y 1998, el incremento paulatino de las tasas de seropositivos entre ambos períodos sugería la llegada de la epidemia de 1998. Se detectaron pacientes infectados con virus Den-1 (51,2%), Den-2 (37,9%), Den-4 (10,6%), y una infección mixta por Den-2 y Den-4 (0,3%). Se confirma la hiperendemicidad del dengue (co-circulación de Den-1, Den-2 y Den-4) en el estado Aragua, conjuntamente con la detección de pocos casos (6,5%) de Fiebre Hemorrágica de Dengue/Síndrome de Choque por Dengue (FHD/SCD); 38,1% de estos casos ocurrieron en pacientes con infecciones secundarias. El alto porcentaje (85,7%) de casos de FHD/SCD infectados con el virus Den-2 apoya la reportada virulencia de este serotipo.

The efficacy of a proactive dengue surveillance system to predict epidemics depends on the laboratory diagnostic capacity for an early detection of virus circulation. This study shows the results of the dengue virologic and serologic surveillance accomplished in Aragua State (Venezuela) from October 1997 to December 1998. Five hundred and forty seven sera from suspected dengue patients were tested using the techniques of Virus Isolation and Immunofluorescence Serotyping (VIIS), Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), Anti-dengue IgM Capture Enzyme Immunoassay (MAC-ELISA) and Haemagglutination Inhibition test (HI). Of the tested sera, 97.4% resulted positive to at least one technique; of these, 60.4% were classified as confirmed cases (virologically positives) and 39.6% as probable cases (virologically negatives/serologically positives). Though the majority of positive cases occurred during the 1997 and 1998 epidemic periods, the gradual increase of the seropositive rates between both periods suggested the incoming 1998 outbreak. Den-1 (51.2%), Den-2 (37.9%) and Den-4 (10.6%) infected patients were detected as well as one dual infection of Den-2 and Den-4 (0.3%). Dengue hyperendemicity (co-circulation of Den-1, Den-2 and Den-4) in Aragua State was confirmed together with the detection of few cases (6.5%) of Dengue Hemorrhagic Fever/Dengue Shock Syndrome cases (HF/DSS); 38.1% of these cases occurred in patients with secondary infections. The high percentage (85,7%) of DHF/DSS cases infected by Den-2 virus supports the reported virulence of this serotype.

Strains A-15 (isolated in Cuba, 1981), Jamaica (isolated in Jamaica, 1981) and Nueva Guinea "C" (standard) from dengue-2 virus were compared according to the time of appearance of the cytopatic effect (CPE), to the time of appearance of specific fluorescence and to the kynetics of viral multiplication on being innoculated in the cell lines AP-61 (Aedes pseudoscutellaris) and C6/36 HT (Aedes albopictus). The results showed that the CPE of highest intensity and earliest appearance was for A-15, followed by Jamaica and Nueva Guinea "C" (NGC). AP-61 seems to favor the CPE of Jamaica with respect to that of the same strain in C6/36 HT. The fluorescence was earlier for Jamaica and A-15 and more intensive for the latter, whereas NGC manifested late. This behaviour was similar in the 2 cellular systems. The greatest titres during the kynetics of viral multiplication were obtained from A-15 in both lines, although in AP-61 they tend to be equal from the 4th day on. The strain A-15 showed a particular behaviour of these biological properties on comparing them with the other strains under study, which may be related to changes found in its neuclotide sequence.

Las cepas A-15 (aislada en Cuba, 1981), Jamaica (aislada en Jamaica en 1981) y Nueva Guinea "C" (estándar) del virus dengue-2 fueron comparadas atendiendo al tiempo de aparición del efecto citopático (ECP), tiempo de aparición de la fluorescencia específica y a la cinética de multiplicación viral, al ser inoculadas en las líneas celulares AP-61 (Aedes pseudoscutellaris) y C6//36 HT (Aedes albopictus). Los resultados mostraron que el ECP de mayor intensidad y más temprana aparición fue para A-15, seguido por Jamaica y Nueva Guinea "C" (NGC). AP-61 parece favorecer el ECP de Jamaica respecto al de la misma cepa en C6/36 HT. La fluorescencia fue más temprana para Jamaica y A-15, y resultó más intensa para la última, mientras que NGC se manifestó tardíamente. Este comportamiento fue similar en los 2 sistemas celulares. Los mayores títulos durante la cinética de multiplicación viral se obtuvieron de A-15 en ambas líneas, aunque en AP-61 tienden a igualarse a partir del 4to. día. La cepa A-15 mostró un comportamiento particular de estas propiedades biológicas al compararla con las otras cepas en estudio, lo que pudiera estar relacionado con cambios encontrados en su secuencia nucleotídica.

Some biological properties of Dengue-2 strains such as A-15 (isolated in Cuba in 1981); Jamaica (isolated in Jamaica in 1981) and New Guinea "C" (NG"C") standard strain differing in their nucleotide sequences were studied. The results showed that the cytophatic effect in C6/36 HT cell line occured earlier in A-15 strain and that fluorescence was first detected in Jamaica and A-15 strains. This seems to indicate that rapid detection of strains does not have any relation to neither their history of passage nor the original isolation system. A-15 and NG"C" strains exhibited an heterogeneous pattern formed by big and small plaques but average size of plaques in NG"C" was lower whereas Jamaica showed only small plaques. The most neurovirulent strain in mice was NG"G" followed by A-15 whereas Jamaica was not neurovirulent at all. These results indicate that A-15 has a different biological behaviour which is probably due to intrinsic differences. It should be taken into account that 7 amino acid changes were found in the evelope protein which may have affected the expression of some biological properties.

Se estudiaron algunas propiedades biológicas de las cepas de dengue 2: A-15 (aislada en Cuba en 1981), Jamaica (aislada en Jamaica en 1981) y la cepa estándar Nueva Guinea "C" (NG"C") que presentan diferencias en sus secuencias nucleotídicas. Los resultados mostraron que la aparición del efecto citopático en la línea celular C6/36 HT fue más temprano para la cepa A-15 y la fluorescencia se detectó primero en las cepas Jamaica y A-15, esto parece indicar que la rapidez de la detección de las cepas no guarda relación con su historia de pases ni con el sistema de aislamiento original. A-15 y NG"C" mostraron un patrón heterogéneo de placas grandes y pequeñas; la talla promedio fue menor en la segunda. Jamaica sólo presentó placas pequeñas. La capa más neurovirulenta en ratones fue la NG"C" seguida por A-15, mientras que Jamaica no fue neurovirulenta. Estos resultados sugieren que A-15 tiene un comportamiento biológico distinto, probablemente por causa de diferencias intrínsecas. Se debe considerar que se hallaron 7 cambios aminoacídicos en la proteína de envoltura que pudieran haber afectado la expresión de algunas propiedades biológicas.

A survey of human Trypanosoma cruzi infection in four rural communities of two Venezuelan states with different epidemiological Chagas' disease situations was carried out using the Dot-ELISA and conventional serology. In the two hamlets of Zulia state, no seropositives were found in the under-15 age group whereas seropositivity in the over-15 group was 15.6%. In Cojedes state, the two hamelts studied exhibited a seropositivity of 8.9% in the under-15 group and 51.6% in the over-15 group. Upon comparison with conventional methods, Dot-ELISA evidenced high co-positivity, co-negativity and efficiency indexes. In the samples taken from Zulia, the predictive value of the test was 66% and 60% for cytoplasmatic and integral antigens, respectively; with the Cojedes samples, 100% and 95%. The results suggest that Dot-ELISA could be a practical alternative for seroepidemiological Chagas' disease studies in underdeveloped regions.

Se realizó estudio seroepidemiológico sobre la infección por Trypanosoma cruzi en habitantes de cuatro comunidades rurales de Venezuela, que presentan diferentes situaciones epidemiológicas en relación a la Enfermedad de Chagas, con la finalidad de evaluar la técnica de Dot-ELISA y compararla con las pruebas serológicas convencionales. En los caseríos de Kamana y caño Hondo del estado Zulia, donde no existe transmisión, la seropositividad fue 15,7% en adultos solamente. En las comunidades de las Rosas y Solano del estado Cojedes, área de alta endemicidad, la seropositividad en los menores de 14 años fue 8,9% y en los mayores de 15,51,6%. En el estudio comparativo con las pruebas serolgicas convencionlaes, Dot-ELISA presentó altos índices de co-positividad, co-negatividad y eficiencia. El valor predictivo positivo de la prueba fue de 66% y 60% con al antígeno citoplasmático e integral respectivamente, en el estado Zulia y 100% y 95% en el estado Cojedes. Estos resultados sugieren que Dot-ELISA puede ser una alternativa práctica para estudios seroepidemiológicos sobre la infección por Trypanosoma cruzi en los paises en desarrollo.

Using the Dot-ELISA technique, two antigenic preparations of Trypanosoma cruzi epimastigote forms have been compared for the diagnosis of Chagas' disease: (1) The citoplasmic fraction (citoplasmic antigen) and (2) whole fixed epimastigotes (integral antigen). There was been used sera from 95 chagasic patients with chronic cadiomyopathy, positive conventional serology and either positive or negative xenodiagnosis; 74 subjects with negative conventional serology, and either clinically normal or presenting cardiomyopathy; 74 patients with different diseases including siphilis,toxoplasmosis, leisjmaniasis or autoantibodies such as rheumatoid factor and antinuclear antibodies. By defining the diagnostic titers (cut Off): 1:512 for citoplasmatic antigen and 1:128 for the integral antigen, a sensitivity of 100% has been obtained with both antigenic preparations, being the specificity of 96% for the former and 100% for the latter when leishmaniasis sera were not included. A comparative study with conventional serology was carried out using 147 sera from a Laboratory of Chagas' diagnosis; Dot-ELISA with citoplasmic antigen showed co-positivity index of 1.0, co-negativity 0.989 and efficiency of 0.993, and Dot-ELISA with integral antigen 1.0, 0.979 and 0.986 respectively. According to this evaluation, Dot-ELISA using whole formalin fixed epimastigotes might be a practical alternative for the serological diagnosis of Chagas' disease.

Se estudia el Ensayo Inmunoenzimático en Microgotas sobre Nitrocelulosa (Dot-ELISA)comparando dos preparados antigénicos de formas epimastigotas de cultivo de T. cruzi: 1) la fracción citoplasmática (antígeno citoplasmático y 2) el parásito total fijado previamente con formaldehido (antígeno integral). Se usaron sueros de: 95 pacientes chagásicos con serología convencional positiva, cardiopatía crónica y algunos con xenodiagnóstico positivo; 42 personas sanas y 32 con miocardipatía crónica con serología negativa y 74 pacientes con diferentes patologías incluyendo: sífilis, toxoplasmosis, lupus eritematoso diseminado, con factor reumatoide, leishmaniasis visceral, y leishmaniasis cutánea. Definidos los títulos diagnósticos (cut-off) de 1:512 con antígeno citoplasmático y de 1: 128 con antígeno integral, la especificidad fue 96% para el primero y de 100% para el segundo; mientras que la sensibilidad fue de 100% para ambas. En el estudio comparativo con las pruebas serológicas convencionales examinando 147 sueros tomados de personas referidas al laboratório, Dot-ELISA con antígeno citoplasmático presentó índices deco-positividad de 1,0, co-negatividad de 0,989 y eficiencia 0,993. Dot-ELIS con antígeno integral dió 1,0, 0,979 y 0,986 respectivamente. De acuerdo con esta evaluación, la técnica Dot-ELISA con antígeno integral se presenta como una alternativa práctica para el diagnóstico serológico de la enfermedad de Chagas.