Abstract Acute infections of bovine viral diarrhea virus (BVDV) lead to a range of clinical presentations. Laboratory tests for detection depend on collection of samples during a short viremia. Acutely infected animals remain largely undiagnosed. Transfer RNA halves (tsRNAs) are hypothesized to function like microRNAs to regulate gene expression during an immune response. The objective of this study was to identify tsRNAs in cattle that had been challenged with a non-cytopathic field strain of BVDV. Colostrum-deprived neonatal Holstein calves were either challenged with BVDV (n=5) or mock challenged (n=4). Sera was collected prior to challenge and days 4, 9, and 16 post challenge. RNA was extracted and read counts of small non-coding RNAs were assessed using next-generation sequencing. A total of 87,838,207 reads identified 41 different tsRNAs. Two 5’ tsRNAs, tsRNAProAGG and tsRNAValAAC, differed across time. Two 5’ tsRNAs, tsRNAGlyCCC and tsRNAGlyGCC, differed between treatment groups across time. Four days post challenge, 5’ tsRNAGlyCCC and tsRNAGlyGCC were significantly lower in the challenged group than the control group. Further studies are needed to identify the importance and function of 5’ tsRNAGlyCCC and tsRNAGlyGCC in serum samples of cattle challenged with BVDV.

O herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) é um importante patógeno de bovinos na América do Sul e tem suscitado esforços para o desenvolvimento de vacinas mais seguras e eficazes. Além de conferirem proteção, vacinas contra os herpesvírus animais devem permitir a diferenciação sorológica entre animais vacinados e infectados naturalmente. Foi recentemente relatada a construção e caracterização in vitro de um recombinante do BoHV-5 defectivo na enzima timidina quinase (tk) para atenuação e, na glicoproteína E (gE) como marcador antigênico, como potencial cepa vacinal (Brum et al. 2010a). O presente artigo relata uma investigação sobre da atenuação e imunogenicidade do recombinante BoHV-5gE/TKΔ em bezerros. Em um primeiro experimento, bezerros soronegativos, com 80 a 90 dias de idade (n=6), inoculados pela via intranasal (IN) com o vírus recombinante (título de 10(7,5)TCID50) excretaram baixos títulos de vírus nas secreções nasais por até seis dias, mas não desenvolveram sinais sistêmicos, respiratórios ou neurológicos. No dia 30 pós-infecção (pi), todos os animais possuíam anticorpos neutralizantes contra o BoHV-5, em títulos entre 4 e 8, mas permaneceram negativos para anticorpos contra a gE. Administração de dexametasona (Dx) a quatro desses bezerros no dia 42 pi (0.1mg/kg/dia durante 5 dias) não resultou em excreção viral ou em aumento dos títulos de anticorpos, indicando ausência de reativação viral. Em um segundo experimento, vacinação intramuscular (IM) de bezerros com 8 meses de idade (n=9) com o recombinante (10(7,5)TCID50/animal) não resultou em excreção viral ou em manifestações clínicas. Os animais vacinados desenvolveram anticorpos neutralizantes em títulos de 2 a 8 no dia 42 pós-vacinação (PV) e permaneceram negativos para anticorpos anti-gE. Finalmente, 21 bezerros (aproximadamente 10 meses de idade) mantidos a campo foram vacinados com o recombinante (10(7,3)TCID50) pela via IM. Todos os animais vacinados desenvolveram anticorpos neutralizantes em títulos de 2 a 16 no dia 30pv. Revacinação desses animais no dia 240 pv provocou uma resposta anamnéstica rápida e intensa, resultando em títulos neutralizantes entre 16 e 256 no dia 14 pós-revacinação. O soro de todos os animais permaneceu negativos para anticorpos contra a gE. Amostras de soro dos animais vacinados apresentaram atividade neutralizante cruzada frente a nove isolados de BoHV-5 e oito de BoHV-1. Esses resultados demonstram que o recombinante é atenuado e imunogênico para bezerros e induz uma resposta sorológica diferenciável da resposta à infecção natural. Portanto, o recombinante se constitui em um potencial candidato a cepa vacinal.

Bovine herpesvirus 5 (BoHV-5) is an important pathogen of cattle in South America and efforts have been made to produce safer and more effective vaccines. In addition to afford protection, herpesvirus vaccines should allow serological differentiation of vaccinated from naturally, latently infected animals. We previously reported the construction and characterization in vitro of a double mutant BoHV-5 (BoHV-5gE/TK Δ) lacking the genes encoding thymidine kinase (tk) for attenuation, and glycoprotein E (gE) as the antigenic marker, as a vaccine candidate strain (Brum et al. 2010a). The present article reports an investigation on the attenuation and immunogenicity of this recombinant in calves. In a first experiment, 80 to 90-day-old seronegative calves (n=6) inoculated intranasally with the recombinant (titer of 10(7.5)TCID50) shed virus in low to moderate titers in nasal secretions for up to 6 days, yet did not develop any respiratory, systemic or neurological signs of infection. At day 30 post-infection (pi) all calves had BoHV-5 specific neutralizing (VN) antibodies in titers of 4 to 8 and were negative for anti-gE antibodies in a commercial ELISA test. Administration of dexamethasone (0.1mg/kg/day during 5 days) to four of these calves at day 42 pi did not result in virus shedding or increase in VN titers, indicating lack of viral reactivation. Secondly, a group of 8-month-old calves (n=9) vaccinated intramuscularly (IM) with the recombinant virus (10(7.5)TCID50/animal) did not shed virus in nasal secretions, remained healthy and developed VN titers from 2 to 8 at day 42 post-vaccination (pv), remaining negative for gE antibodies. Lastly, 21 calves (around 10 months old) maintained under field conditions were vaccinated IM with the recombinant virus (titer of 10(7.3)TCID50). All vaccinated animals developed VN titers from 2 to 16 at day 30 pv. A boost vaccination performed at day 240 pv resulted in a rapid and strong anamnestic antibody response, with VN titers reaching from 16 to 256 at day 14 post-booster. Again, serum samples remained negative for gE antibodies. Selected serum samples from vaccinated animals showed a broad VN activity against nine BoHV-5 and eight BoHV-1 field isolates. These results show that the recombinant virus is attenuated, immunogenic for calves and induces an antibody response differentiable from that induced by natural infection. Thus, the recombinant BoHV-5gE/TKΔ is an adequate candidate strain for a modified live vaccine.

Vacas prenhes infectadas com isolados não-citopáticos (NCP) do vírus da diarréia viral bovina (BVDV) entre os dias 40 e 120 de gestação frequentemente produzem bezerros imunotolerantes, persistentemente infectados (PI). Este artigo relata a caracterização de bezerros PI produzidos experimentalmente, pela inoculação de vacas prenhes com um pool de isolados brasileiros de BVDV-1 (n=2) e BVDV-2 (n=2) entre os dias 60 e 90 de gestação. Dois bezerros nasceram positivos para vírus, negativos para anticorpos, mas morreram aos dias 7 e 15 pós-nascimento, respectivamente. Outros seis bezerros nasceram saudáveis, soronegativos para o BVDV, replicaram e excretaram o vírus em secreções por até 210 dias. Análise antigênica dos vírus presentes nos bezerros PI com anticorpos monoclonais, ao nascimento e 30 dias após, revelou dois padrões de infecção. Três bezerros apresentavam apenas um dos vírus utilizados no desafio (BVDV-1 ou BVDV-2), enquanto outros três bezerros apresentavam co-infecção com mais de um vírus. Além disso, testando-se o sangue dos animais PI com um PCR capaz de diferenciar entre BVDV-1 e BVDV-2 observou-se a presença concomitante de vírus dos dois genótipos (BVDV-1 e BVDV-2) nestes três animais. Esses resultados indicam que infecção persistente - uma consequência bem conhecida da infecção fetal pelo BVDV - pode ser estabelecida concomitantemente por mais de um vírus, após infecção experimental. Nesse sentido, infecções persistentes mistas com isolados antigenicamente distintos podem ser úteis para o estudo das bases imunológicas e moleculares da imunotolerância e infecção persistente pelo BVDV.

Pregnant cows infected with noncytopathic (NCP) isolates of bovine viral diarrhea virus (BVDV) between days 40 and 120 days of gestation frequently deliver immunotolerant, persistently infected (PI) calves. We herein report the characterization of PI calves produced experimentally through inoculation of pregnant cows with a pool of Brazilian BVDV-1 (n=2) and BVDV-2 isolates (n=2) between days 60 and 90 of gestation. Two calves were born virus positive, lacked BVDV antibodies, but died 7 and 15 days after birth, respectively. Six other calves were born healthy, seronegative to BVDV, harbored and shed virus in secretions for up to 210 days. Analysis of the antigenic profile of viruses infecting these calves at birth and 30 days later with a panel of monoclonal antibodies indicated two patterns of infection. Whereas three calves apparently harbored only one isolate (either a BVDV-1 or BVDV-2), co-infection by two antigenically distinct challenge viruses was demonstrated in three PI calves. Moreover, testing the viruses obtained from the blood of PI calves by an RT-PCR able to differentiate between BVDV-1 and BVDV-2 confirmed the presence/persistence of two co-infecting viruses of different genotypes (BVDV-1 and BVDV-2) in these animals. These findings indicate that persistent infection of fetuses/calves - a well characterized consequence of fetal infection by BVDV - may be established concomitantly by more than one isolate, upon experimental inoculation. In this sense, mixed persistent infections with antigenically distinct isolates may help in understanding the immunological and molecular basis of BVDV immunotolerance and persistence.

Bezerros persistentemente infectados (PI) nascidos de vacas infectadas com amostras não-citopáticas do vírus da diarréia viral bovina (BVDV) se constituem nos principais reservatórios do vírus na natureza. Este trabalho relata uma investigação do padrão de excreção e transmissão viral por cinco bezerros PI produzidos experimentalmente pela inoculação de vacas prenhes com isolados brasileiros do BVDV. Cinco bezerros que sobreviveram a infecção intrauterina nasceram saudáveis, soronegativos e com a presença de vírus no sangue. Após o desmame - e desaparecimento dos anticorpos colostrais - os bezerros PI foram monitorados semanalmente durante 150 dias para a presença de vírus e títulos virais no soro e em secreções (ocular, oral, nasal e genital). Os títulos virais no soro de cada animal apresentaram pequenas variações durante o período (com exceção de um animal que apresentou um aumento de título tardiamente), mas os títulos variaram amplamente entre os animais (entre 10² e 10(6)TCID50/ml). O vírus também foi excretado continuamente nas secreções de todos os animais, com pequenas variações de título entre as coletas. Os maiores títulos virais foram geralmente detectados nas secreções nasais e oculares (títulos de 10(4) a 10(6)TCID50/mL), enquanto as secreções orais e genitais usualmente continham títulos virais baixos (10² a 10³TCID50/mL). Com o objetivo de avaliar a dinâmica de transmissão viral, um bezerro PI foi introduzido em um grupo de 10 bezerros soronegativos, mantido com uma alta densidade animal e submetido a manejo diário para simular as condições de manejo semi-intensivo. Após 30 dias de convívio com o bezerro PI, todos os demais animais haviam soroconvertido ao BVDV. Para investigar a transmissão viral sob condições extensivas, outro bezerro PI foi incorporado a um rebanho de 48 animais mantido a campo, com baixa densidade animal e submetido a manejo extensivo. Dentre estes animais, 8/48 (16,6%) foram soropositivos para anticorpos no dia 10, 26/48 (54,1%) no dia 40 e 37/48 (77%) haviam soroconvertido no dia 100, quando encerrou-se o monitoramento. Estes resultados demonstram que a viremia e excreção viral contínua em altos títulos por animais PI assegura a transmissão rápida do BVDV a animais mantidos em contato, sendo a transmissão notadamente mais rápida em condições intensivas e de alta densidade animal.

Persistently infected (PI) calves born to cows infected with non-cytopathic bovine virus diarrhea virus (BVDV) represent the main reservoir of the virus in nature. We herein report an investigation on the patterns of virus shedding and transmission by five PI calves produced experimentally through inoculation of pregnant cows with Brazilian BVDV isolates. Five calves that survived intrauterine infection were born healthy, lacking neutralizing antibodies to BVDV and harboring virus in the blood. After weaning - and following the disappearance of colostral antibodies - PI calves were monitored for virus in serum and body secretions (ocular, oral, nasal and genital) at weekly intervals for up to 150 days. For each animal, the virus titers in serum showed minor variations throughout the collections (with one exception that presented an increase late in infection), yet the titers varied widely among animals (from 10² to 10(6)TCID50/mL). Virus shedding in secretions was detected steadily during all the observation period with minor titer variations for each particular animal. The highest titers were generally detected in nasal and ocular secretions (titers 10(4) to 10(6)TCID50mL) whereas genital and oral secretions usually contained low amount of virus (10² to 10³TCID50mL). To evaluate the kinetics of virus transmission by these animals, one PI was introduced on a group of 10 seronegative calves maintained with a high animal density simulating the conditions of an intensive management. All 10 contact calves seroconverted to BVDV by day 30. Another PI calf was introduced into a 48-head herd kept under a low animal density, extensive grass management. Among these animals, 8/48 (16.6%) seroconverted by day 10, 26/48 (54.1%) by day 40 and 37/48 (77%) were seropositive at day 100, when the monitoring was discontinued. These results show that continuous viremia and virus shedding in high titers in secretions by PI animals assure an efficient and rapid virus transmission to contact animals, being the kinetics of transmission much faster under intensive conditions.