Abstract Background Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) isolated from avian cellulitis lesions produces a toxin, named Escherichia coli vacuolating factor (ECVF), that causes cell vacuolization and induces inflammatory response in broiler chicken. Methods We investigated the intracellular activities of ECVF in avian fibroblasts using fluorescence staining, electron microscopy, MTT and LDH measurements. As ECVF act specifically in avian cells, we performed blotting assay followed by mass spectrometry to better understand its initial intracellular protein recognition. Results ECVF induced actin contraction, mitochondrial damage and membrane permeability alterations. Ultrastructural analysis showed intracellular alterations, as nuclear lobulation and the presence of degraded structures inside the vacuoles. Moreover, ECVF induced cell death in fibroblasts. ECVF-biotin associates to at least two proteins only in avian cell lysates: alpha-actinin 4 and vinculin, both involved in cytoskeleton structure. Conclusion These findings demonstrated that ECVF plays an important role in avian cellulitis, markedly in initial steps of infection. Taken together, the results place this toxin as a target for drug and/or vaccine development, instead of the use of large amounts antibiotics.

ABSTRACT Plesiomonas shigelloides isolated from water in Brazil was previously described as a hemorrhagic heat-labile cytotoxic-enterotoxin producer. We purified this toxin from culture supernatants using ion metallic affinity chromatography (IMAC) followed by molecular exclusion chromatography. The pure toxin presented molecular mass of 50 kDa and isoelectric point (pI) around 6.9 by 2D electrophoresis. When injected intravenously, the purified cytotoxic-enterotoxin induced also severe spasms followed by sudden death of mice. Hence, we entitled it as lethal cytotoxic-enterotoxin (LCE). The presence of membrane vesicles (MVs) on cell surfaces of P. shigelloides was observed by scan electron microscopy (SEM). From these MVs the LCE toxin was extracted and confirmed by biological and serological assays. These data suggest that P. shigelloides also exports this cytotoxic-enterotoxin by membrane vesicles, a different mechanism of delivering extra cellular virulence factors, so far not described in this bacterium.

Abstract Escherichia coli is the major causative agent of human cystitis. In this study, a preliminary molecular analysis carried out by PCR (polymerase chain reaction) demonstrated that 100% of 31 E. coli strains isolated from patients with recurrent UTIs (urinary tract infections) showed the presence of the curli fimbria gene (csgA). Curli fimbria is known to be associated with bacterial biofilm formation but not with the adhesion of human cystitis-associated E. coli. Therefore, this work aimed to study how curli fimbria is associated with uropathogenic E. coli (UPEC) as an adhesion factor. For this purpose, the csgA gene was deleted from strain UPEC-4, which carries three adhesion factor genes (csgA, fimH and ompA). The wild-type UPEC-4 strain and its mutant (ΔcsgA) were analyzed for their adhesion ability over HTB-9 (human bladder carcinoma), Vero (kidney cells of African green monkey) and HUVEC (human umbilical vein) cells in the presence of α-D-mannose. All the wild-type UPEC strains tested (100%) were able to adhere to all three cell types, while the UPEC-4 ΔcsgA mutant lost its adherence to HTB-9 but continued to adhere to the HUVEC and Vero cells. The results suggest that curli fimbria has an important role in the adhesion processes associated with human UPEC-induced cystitis.

Abstract Culture supernatant of sepsis-associated Escherichia coli (SEPEC) isolated from patients with sepsis caused loss of intercellular junctions and elongation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). The cytotoxic factor was purified from culture supernatant of SEPEC 15 (serogroup O153) by liquid chromatography process. PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) showed that the purified SEPEC cytotoxic factor had a molecular mass of ∼150 kDa and consisted of at least two subunits. At the concentration of 1 CD50 (40 μg/mL) did facilitate transcytosis through the HUVEC cells monolayer of SEPEC 15 as much as E. coli K12 within 30 min without affecting cell viability. These results suggest that this cytotoxic factor, named as SPF (SEPEC's permeabilizing factor), may be an important SEPEC virulence factor that facilitates bacterial access to the bloodstream.

RESUMO Em 2004 ocorreu um surto de diarreia aguda no Estado de Pernambuco, Brasil. Setenta por cento (14 dos 20) dos sobrenadantes de cultura de Aeromonas caviae, isoladas neste episódio induziram acúmulo de líquido em testes de alça ligada de intestino de coelhos, assim como em teste em camundongos recém-nascidos. Os mesmos sobrenadantes mostraram também atividade citotóxica em células de Vero e Caco-2, mas não em células HeLa e HEp2. As atividades enterotóxicas e citotóxicas mantiveram-se mesmo após o aquecimento a 100 ºC dos sobrenadantes de cultura. Este trabalho revela a expressão de um provável fator diarreiogênico: uma enterotoxina-citotóxica termo-estável, produzida por A. caviae que pode ser associada ao surto de diarreia ocorrido no Brasil. Atualmente estamos purificando esta enterotoxina termo-estável, com o objetivo de elucidar seu papel como fator de virulência na diarreia causada por A. caviae.

SUMMARY In the present study enterotoxic and cytotoxic activities of twenty Aeromonas caviaestrains were examined. They originated from fecal specimens of patients with acute diarrhea during an outbreak in Brazil in 2004. Culture supernatants of fourteen strains (70%) caused fluid accumulation in rabbit ileal intestinal loops and in suckling mice assays, and also showed a cytotoxic activity in Vero and Caco-2 cells. The enterotoxic and cytotoxic factors were heat-stable after culture supernatants treatment at 100 ºC. The results revealed that A. caviaestrains produce a putative diarrheagenic virulence factor, a heat-stable cytotoxic enterotoxin that could be linked to the diarrhea outbreak that took place in Brazil.

Cinquenta e seis Escherichia coli isoladas de fezes diarreicas de carneiros (7 a 10 dias) no Estado de São Paulo, Brasil, foram avaliadas quando ao acúmulo de fluidos no intestino de camundongos recém-nascidos. Vinte e sete (48,2%) das amostras foram positivas para esse ensaio, porém nenhuma das 56 amostras foi capaz de induzir efeitos citopáticos em células Vero e CHO, indicando que não produzem toxinas LT ou VT. Análise por PCR mostrou que estas 27 E. coli foram positivas para estA, que codifica a proteína STa, mas não para os genes stx1, stx2 ou cnf. As amostras positivas para STa foram também analisadas quanto à presença dos genes que codificam as fímbrias F41, F17 e K99, fatores de colonização em ETEC. Somente F17 foi detectada em 2 amostras (7,4%). Doze das 27 E. coli STa positivas também contêm o gene hlyA e apresentaram atividade hemolítica em Agar sangue. Rotavírus não foi detectado nas fezes desses animais. Em conjunto, esses resultados sugerem que STa é um fator diarreiogênico importante para colibacilose de pequenos ruminantes no Estado de São Paulo.

Twenty seven (48.2%) culture supernatants of 56 Escherichia coli isolated from diarrheic lamb feces (7 to 10 days old) in São Paulo State, Brazil, presented positive results to suckling mice assay (fluid accumulation) but none caused cytopathic effects on Vero and CHO cells, indicating that these strains did not produced LT or VT toxins. PCR assays showed that these 27 E. coli strains harbored estA, that codifies for STa, but not for stx1, stx2 or cnf genes. The positive STa strains were checked for genes that codify for F41, F17 and K99 fimbriae, wich are considered colonization factors in ETEC. Only F17 was detect in two samples (7.4%). Twelve of 27 STa positive carried hlyA gene and presented hemolytic activity in blood Agar. Presence of rotavirus was not detected among the diarrheic feces. These data suggests that STa must be an important diarrheagenic factor to small ruminants in São Paulo State.

Endopleura uchi (Huber) Cuatrec. é uma espécie amazônica utilizada tradicionalmente para o tratamento de inflamações uterinas e outras afecções femininas. Das cascas de E. uchi foi isolada a substância bergenina, por meio de cromatografia em coluna usando como fases estacionárias sephadex LH-20 e posteriormente, sílica gel 60 flash. A identificação estrutural de bergenina foi realizada por meio de espectros de RMN. A avaliação da atividade antimicrobiana da bergenina, dos extratos e frações de E. uchi foi realizada contra microorganismos ATCC e clinicamente isolados (Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, C. guilliermondii, Aspergillus flavus, A. nidulans). Além desses, foram testados os microorganismos isolados clinicamente (C. tropicalis, A. nidulans, A. niger, Shigella sonnei, Serratia marcenses, Klebsiella pneumoniae e Enterococcus faecalis). A inibição de crescimento dos microorganismos pela bergenina e extratos e frações de E. uchi contra os microorganismos ATCC foram similares à inibição obtida contra microorganimos isolados clinicamente. Os resultados revelaram a bergenina como um inibidor seletivo de Candida albicans, C. tropicalis e C. guilliermondii. Porém, a bergenina apresentou uma atividade inferior contra os fungos Aspergillus flavus, A. nidulans, A. niger, e não inibiu o crescimento de bactérias Gram positivas e Gram negativas. As atividades da fração de acetato de etila e da bergenina pura estão em concordância com a concentração da bergenina nas cascas. A atividade seletiva de bergenina contra três espécies de Candida auxilia na compreensão do seu uso tradicional contra que infecções que afetam o aparelho reprodutor feminino.

Endopleura uchi (Huber) Cuatrec. is an Amazon species traditionally used as treatment for inflammations and female disorders. Bergenin was isolated from ethyl acetate fraction of bark of E. uchi by using column chromatography over sephadex LH-20 and then silica gel 60 flash. Its structure was identified on the basis of its NMR spectra. The antimicrobial activity of bergenin and fractions of methanol extract of E. uchi were evaluated against ATCC microorganisms (Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, C. guilliermondii, Aspergillus flavus, A. nidulans). Clinically isolated strains of all of these microorganisms, along with C. tropicalis, A. niger, Shigella sonnei, Serratia marcenses and Klebsiella pneumoniae were also evaluated. The growth inhibition caused by bergenin, extracts and fractions of E. uchi against ATCC microorganisms were similar to the inhibition to microorganisms clinically isolated. The ethyl acetate fraction and the isolate bergenin inhibit the growth of the yeasts C. albicans, C. tropicalis, and C. guilliermondii, but present lower activity against filamentous fungi Aspergillus flavus, A. nidulans, A. niger, and did not inhibit the Gram positive and Gram negative bacteria. The activity of the ethyl acetate fraction and bergenin are in agreement wit its high concentration found in bark extract of E. uchi. Moreover, the selective activity against three Candida species helps to understand its traditional use against infections that affect women.

Adesinas (Fímbria P, fímbria S, fímbria do tipo 1 e a adesina afimbrial), toxinas (α-hemolisina e o fator necrosante citotóxico do tipo 1), sistemas de captação de ferro (aerobactina), e mecanismos de defesa do hospedeiro (cápsula ou lipopolissacarídeo) são prevalentes em amostras de Escherichia coli associadas a infecções do trato urinário. O objetivo deste trabalho foi caracterizar genotipicamente 162 amostras de Escherichia coli uropatogênica (UPEC) de pacientes com cistite através do ensaio da reação em cadeia da polimerase. Foram realizados três ensaios de PCR multiplex para os seguintes fatores de virulência: papC, papE/F, alelos de papG, fimH, sfa/foc, afaE, hly, cnf-1, usp, cdtB, iucD, e kpsMTII. Os resultados da PCR identificaram, 158 amostras fimH (97,5%), 86 amostras kpsMTII (53,1%), 53 amostras papC/papEF/papG (32,7%), 45 amostras sfa (27,8%), 42 amostras iucD (25,9%), 41 amostras hly (25,3%), 36 amostras usp (22,2%), 30 amostras cnf-1 (18,5%) e 10 amostras afa (6,2%). Nenhuma amostra foi positiva para o gene cdtB. Neste trabalho, demonstramos que podemos encontrar múltiplas adesinas em uma única amostra e que diferentes genes de fatores de virulência podem ser encontrados em associação.

Adhesins (P-fimbriae, S-fimbriae, type 1 fimbriae and afimbrial adhesin), toxins (α-hemolysin and cytotoxic necrotizing factor type 1), iron acquisition systems (aerobactin) and host defense avoidance mechanisms (capsule or lipopolysaccharide) have been shown to be prevalent in Escherichia coli strains associated with urinary tract infections. In this work, 162 Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) strains from patients with cystitis were genotypically characterized by polymerase chain reaction (PCR) assay. We developed three multiplex PCR assays for virulence-related genes papC, papE/F, papG alleles, fimH, sfa/foc, afaE, hly, cnf-1, usp, cdtB, iucD, and kpsMTII, all of them previously identified in UPEC strains. The PCR assay results identified 158 fimH (97.5%), 86 kpsMTII (53.1%), 53 papC/papEF/papG (32.7%), 45 sfa (27.8%), 42 iucD (25.9%), 41 hly (25.3%), 36 usp (22.2%), 30 cnf-1(18.5%) and 10 afa (6.2%) strains. No strain was positive for cdtB. In this work, we also demonstrated that adhesins may be multiple within a single strain and that several virulence genes can occur combined in association.

Casearia sylvestris (Flacourtiaceae) is a plant popularly known as "guaçatonga" and it is used by indigenous population from South America (Brazil, Peru and Bolivia) in the treatment of several diseases, including cancer. Cytotoxic studies showed that it presents an interesting antitumoral potential due to the presence of casearins and the essential oil showed a high percentage of potent cytotoxic sesquiterpenes (β-caryophyllene and α-humulene). In this work, we verified that the essential oil of C. sylvestris presents a good selective cytotoxicity against HeLa, A-549 and HT-29 tumor cells (CD50 63.3, 60.7 and 90.6 µg.ml-1, respectively) when compared to non-tumoral cells Vero (CD50 210.1 µg.ml-1) and mice macrophages (CD50 234.0 µg.ml-1). The oil causes hemolysis in seven different kinds of erythrocytes, indicating that C. sylvestris must be used carefully. Besides, standard of β-caryophyllene and α-humulene were also tested and they showed similar cytotoxicity to the cytotoxicity presented in the oil, indicating that they might be responsible for the toxic effects that were observed in this study.

A Casearia sylvestris (Flacourtiaceae) é uma planta popularmente conhecida como "guaçatonga" e é usada por povos indígenas da América do sul (Brasil, Peru e Bolivia) no tratamento de muitas doenças, incluindo câncer. Estudos citotóxicos mostraram que esta planta apresenta um possível e interessante potencial antitumoral devido à presença de moléculas chamadas casearinas. Além disso, a composição do óleo essencial mostrou uma alta concentração de sesquiterpenos de alto potencial citotóxico. Neste trabalho, nós verificamos que o óleo essencial da C. sylvestris apresentou uma boa citotoxicidade seletiva contra as linhagens de células tumorais HeLa, A-549 and HT-29 (CD50 63,3, 60,7 e 90,6 µg.ml-1, respectivamente) quando comparada às células não-tumorais Vero (CD50 210,1 µg.ml-1) e macrófagos de camundongos (CD50 234,0 µg.ml-1). Além disso, o óleo causou hemólise em sete diferentes tipos de eritrócitos, indicando que a C. sylvestris precisa ser usada com cuidado. Também foram testados padrões de β-cariofileno e α-humuleno que mostraram citotoxicidade similar àquelas apresentadas pelo óleo, indicando que estes compostos podem ser os responsáveis pelos efeitos tóxicos que foram observados neste estudo.

O Zanthoxylum rhoifolium Lam. é uma planta popularmente utilizada como antimicrobianos, no tratamento da malária e de inflamações. O óleo volátil do Z. rhoifolium foi extraído e posteriormente foi avaliada a sua citotoxicidade contra células HeLa (carcinoma cervical humano), A-549 (carcinoma de pulmão humano), HT-29 (adenocarcinoma de cólon humano), Vero (rim de macaco) e macrófagos de camundongos. Alguns terpenos constituintes do óleo volátil (beta-cariofileno, alfa -humuleno, alfa -pineno, mirceno e linalool) também foram testados para verificar as possíveis influências sobre a citotoxicidade do óleo. Os resultados obtidos permitiram verificar que o óleo volátil é citotóxico contra células as tumorais (CD50 = 82.3, 90.7 e 113.6 µg/ml para A-549, HeLa e HT-29 cell lines, respectivamente), mas não apresenta citotoxicidade contra as células não tumorais (Vero e macrófagos de camundongos). Desta forma o óleo volátil das folhas do Z. rhoifolium demonstra possuir uma possível ação terapêutica em função de sua citotoxicidade contra células tumorais.

Zanthoxylum rhoifolium Lam is a plant popularly used as antimicrobial, for malaria and inflammatory treatment. The essential oil of Z. rhoifolium was extracted and its cytotoxic effects against HeLa (human cervical carcinoma), A-549 (human lung carcinoma), HT-29 (human colon adenocarcinoma), Vero (monkey kidney) cell lines and mice macrophages were evaluated. Some of the terpenes of its essential oil (ß-caryophyllene, alpha-humulene, alpha -pinene, myrcene and linalool) were also tested to verify their possible influence in the oil cytotoxic activity. The results obtained permitted to confirm that the essential oil is cytotoxic against tumoral cells (CD50 = 82.3, 90.7 and 113.6 µg/ml for A-549, HeLa e HT-29 cell lines, respectively), while it did not show cytotoxicity against non-tumoral cells (Vero and mice macrophages). Thus, the essential oil from Z. rhoifolium leaves seems to present a possible therapeuthic role due to its selective cytotoxic activity against tumoral cell lines.

Foram estudados os fatores de virulência de trinta e duas amostras de Enterococcus faecalis, isolados de casos clínicos. Vinte e quatro amostras (75%) produziram hemolisina em ágar sangue preparado com hemácias de carneiro. No sobrenadante da cultura em BHI nenhuma amostra produziu hemolisina, no entanto quando cultivadas em meio BHI suplementado com 1% de glucose e 0,03% de L-arginina (BHI-GA), 100% das amostras lisaram hemácias de carneiro. Vinte e quatro (75%) amostras produziram caseinase e 23 (71,9%) lipase, mas nenhuma amostra produziu gelatinase. Dezesseis (46,9%) causaram arredondamento e alteração na membrana das células, com formação de vesículas e, em seguida, a morte das células HeLa e HEp-2. Treze amostras (40,6) aglutinaram eritrócitos de coelhos, mas não aglutinaram outros eritrócitos na presença ou na ausência de 1% de D-manose. Dezesseis (50%) aderiram em células HeLa e 13 (40,6%) em células HEp-2, mas todas as amostras de E. faecalis aderiram na microplaca de polipropileno, indicando que E. faecalis isolados de casos clínicos possuem capacidade de formar biofilme "in vitro". Todos os isolados mostraram-se resistentes à ação bactericida do soro normal e não produziram aerobactina. Esses resultados sugerem que, inicialmente, a colonização ou infecção por E. faecalis ocorre pela aderência e formação de biofilme nas células epiteliais e a produção de hemolisina, lípase e caseinase pode atuar como fatores de virulência na infecção por E. faecalis.

Thirty-two clinical isolates of Enterococcus faecalis were screened for virulence factors. Twenty-four (75%) isolates produced hemolysin on Mueller-Hinton blood agar plates with sheep erythrocytes. However, the cell free heat-stable hemolysin was detected in all isolates (100%) of E. faecalis when grown in BHI-GA (BHI medium supplemented with 1% glucose and 0.03% L-arginine), but not in BHI broth alone. Twenty-four isolates (75%) produced caseinase and 23 (71.9%) lipase, but none of the isolates produced gelatinase. Fifteen (46.9%) culture filtrates caused rounding and membrane alterations with blebbing formation followed by death in HeLa and HEp-2 cells, but not in Vero cells. Thirteen isolates (40.6%) agglutinated rabbit erythrocytes, but did not produce hemagglutination in other bloods, containing or not 1% D-manose. Sixteen (50%) E. faecalis isolates adhered to HeLa cells and thirteen (40.6%) to HEp-2 cells, but all isolates adhered to polypropylene microtiter plates, indicating that clinical E. faecalis possess the ability to form biofilm in vitro. All the isolates were resistant to the bactericidal action of normal serum and did not produce aerobactin. These findings suggest that adherence and consequently biofilm formation on ephitelial host cells are the first steps in the E. faecalis virulence and that hemolysin, lipase, caseinase and other virulence factors act as causative of human epithelial cell damages.

Foram estudadas 25 amostras de Salmonella enterica sorotipo Enteritidis isoladas de diferentes fontes, em testes de hemaglutinação. Amostras bacterianas cultivadas em diferentes meios de cultura causavam hemaglutinação na presença de hemácias humanas, entretanto, não foi observada reação com hemácias de outras espécies. A expressão da atividade hemaglutinante foi melhor em ágar CFA a 37ºC. A hemaglutinação foi inibida por D-manose, D-manitol, melibiose, D-rafinose, L-ramnose e sacarose. A análise ultraestrutural não revelou a presença de estruturas filamentosas na superfície bacteriana, sugerindo que a hemaglutinina de Salmonella Enteritidis seja de natureza não fimbrial. Os dados sugerem que Salmonella Enteritidis produz uma hemaglutinina não fimbrial manose-sensível, específica para hemácias humanas, que pode ser extraída na forma solúvel.

Twenty-five strains of Salmonella enterica serovar Enteritidis isolated from different sources were examined for hemagglutinating activity. Bacteria cultured in different media induced hemagglutination of human erythrocytes, but no reaction was observed with erythrocytes from other animal species. The hemagglutinating expression activity was better for cultures on CFA agar at 37ºC than other conditions examined. The hemagglutination was inhibited by D-mannose, D-mannitol, melibiose, D-raffinose, L-rhamnose and sucrose. The absence of cell-surface appendages in electron microscope examinations suggested a nonfimbrial hemagglutinin. The data suggest that Salmonella Enteritidis produces nonfimbrial mannose-sensitive hemagglutinin, specific for human erythrocytes, which could be extracted in soluble form.

Duzentas e cinco amostras de Escherichia coli isoladas de bezerros com diarréia da região centro oeste do Brazil foram examinados quanto a presença de fatores de virulência associados à colibacilose bovina. Cento e duas amostras (49,8%) de E. coli produziram toxinas: toxina de Shiga do tipo 1 (9,7%) e 2 (6,3%), a-hemolisina (9,7%), enterohemolisina (6,8%), Fatores Citotóxicos Necrotisantes tipo 1 (0,5%) e 2 (4,4%), enterotoxinas LT-II (8,3%), e STa (3,9%). Nenhuma amostra produziu enterotoxina LT-I. Adesinas fimbriais F5 e F17 foram produzidas por 7,3% e 4,8% das cepas, respectivamente, e nenhuma expressou F41. Sete das amostras (3,4%) apresentaram o gene eae e pertenceram aos sorotipos O26:H-; O111:H- e O118:H16. Estes resultados sugerem que bezerros no Brasil podem ser uma importante fonte de E. coli patogênica para animais e humanos.

Two hundred and five Escherichia coli strains isolated from calves with diarrhea from mid-western Brazil were screened for the presence of virulence factors associated with bovine colibacillosis. One hundred and two (49.8%) of the E. coli strains produced toxins: Shiga toxins 1 (9.7%) and 2 (6.3%), a-hemolysin (9.7%), enterohemolysin(6.8%), Cytotoxic Necrotizing Factors type 1 (0.5%), and type 2 (4.4%), enterotoxins LT-II (8.3%) and STa (3.9%). No strain produced enterotoxin LT-I. Fimbrial adhesins F5 and F17 were produced by 7.3% and 4.8% of the strains, respectivly, and none expressed F41. Seven strains (3.4%) possessed the gene eae and belonged to serotypes O26:H-; O111:H- and O118:H16. These results suggest that calves in Brazil may be an important source of pathogenic E. coli for animals and humans.