RESUMO A radiação ionizante induz a rupturas dos filamentos duplos (DSBs) do DNA que ativam a fosforilação da proteína histona H2AX (γH2AX). A coloração por imunofluorescência visualiza a formação de focos de γH2AX, permitindo a sua quantificação. Esse método, em oposição ao ensaio de Western blot e citometria de fluxo, fornece uma análise mais precisa demonstrando a posição exata e a intensidade de sinal fluorescente em cada célula individualizada. Na prática, existem problemas na quantificação de γH2AX. Esta pesquisa se baseia em duas questões: a determinação de qual técnica deve ser aplicada, relativa à dose de radiação, e como analisar imagens de microscopia fluorescente obtidas por diferentes microscópios. Células de melanoma HTB140 foram expostas a raios-y, com doses na faixa de 1 a 16 Gy. Efeitos das radiações a nível de DNA foram avaliadas em diferentes intervalos de tempo e após a irradiação analisada por Western blot e pela microscopia de imunofluorescência. Células coradas imunoquimicamente foram visualizadas por dois tipos de microscópios: microscópio AxioVision (Zeiss, Alemanha), que compreendem com software ApoTome, e o microscópio AxioImagerA1 (Zeiss, Alemanha). Os resultados obtidos mostram que o nível de γH2AX é tempo e dose dependente. Microscopia de imunofluorescência forneceu uma melhor detecção de DSBs para doses de radiações mais baixas, enquanto a análise Western blot foi mais confiável para doses de radiações mais elevadas. Microscópio AxioVision contendo o software ApoTome foi mais adequado para a detecção de focos γH2AX.

ABSTRACT Ionizing radiation induces DNA double strand breaks (DSBs) that trigger phosphorylation of the histone protein H2AX (γH2AX). Immunofluorescent staining visualizes formation of γH2AX foci, allowing their quantification. This method, as opposed to Western blot assay and Flow cytometry, provides more accurate analysis, by showing exact position and intensity of fluorescent signal in each single cell. In practice there are problems in quantification of γH2AX. This paper is based on two issues: the determination of which technique should be applied concerning the radiation dose, and how to analyze fluorescent microscopy images obtained by different microscopes. HTB140 melanoma cells were exposed to γ-rays, in the dose range from 1 to 16 Gy. Radiation effects on the DNA level were analyzed at different time intervals after irradiation by Western blot analysis and immunofluorescence microscopy. Immunochemically stained cells were visualized with two types of microscopes: AxioVision (Zeiss, Germany) microscope, comprising an ApoTome software, and AxioImagerA1 microscope (Zeiss, Germany). Obtained results show that the level of γH2AX is time and dose dependent. Immunofluorescence microscopy provided better detection of DSBs for lower irradiation doses, while Western blot analysis was more reliable for higher irradiation doses. AxioVision microscope containing ApoTome software was more suitable for the detection of γH2AX foci.