RESUMO: Leishmania infantum é agente etiológico da leishmaniose canina. Por meio de análises parasitológicas e moleculares, a presença do parasita foi investigada em órgãos reprodutivos de cães machos e fêmeas. Amostras de tecidos dos órgãos reprodutivos de 8 cães machos e 16 fêmeas diagnosticados com leishmaniose foram avaliadas por histoquímica, imunohistoquímica e PCR. Apesar de não terem sido observadas lesões macroscópicas ou microscópicas nos órgãos reprodutivos desses cães, formas amastigotas de L. infantum foram observadas em amostras teciduais do testículo e útero. A PCR e o sequenciamento do DNA extraído desses tecidos revelaram sequências 100% idênticas a L. infantum depositadas no GenBank. Nossos resultados sugerem que os testículos e o útero podem abrigar o parasita, sem associação com lesões macroscópicas ou microscópicas, o que pode ter uma grande importância na transmissão venérea e vertical da leishmaniose entre cães.

ABSTRACT: Leishmania infantum causes canine leishmaniasis. Using parasitological and molecular analyses, we identified L. infantum in the reproductive organs of male and female dogs. Using histochemistry, immunohistochemistry, and PCR, we examined tissue samples from the reproductive organs of 8 male dogs and 16 female dogs diagnosed with leishmaniasis. Despite the absence of macroscopic or microscopic lesions in these organs, we observed L. infantum amastigotes in tissue samples from the testis and the uterus. PCR and sequencing of these tissues revealed sequences that matched 100% with L. infantum DNA available at GenBank. The presence of L. infantum amastigotes and DNA in testicular and uterine tissue samples suggested that these organs can harbor the parasite without associated macroscopic or microscopic lesions, and this can be especially important in the vertical and venereal transmission of leishmaniasis in dogs.

Abstract INTRODUCTION: We sought to determine risk factors (RFs) associated with the presence of antibodies against Leishmania in dogs from a rural area of Ilha Solteira, SP, Brazil. METHODS: Serum samples were collected from 250 dogs and tested using indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and indirect immunofluorescence antibody tests (IFATs). Data concerning dogs, their environment, and their owners’ knowledge of leishmaniasis were collected using a questionnaire. To determine RFs for contact with the parasite, univariate statistical analysis based on chi-squared and Fisher’s exact tests, followed by logistic regression, was used. RESULTS: It was found that 79/250 (31.6%) of the dogs were positive by IFAT, and 72/250 (28.8%) by ELISA. A total of 82/250 dogs (32.8%) were positive in at least one test. The RFs associated with occurrences of Leishmania exposure were large body size (OR = 2.25; 95% CI = 1.26-4.04; p = 0.003), presence of chickens (OR = 1.94; 95% CI = 1.05-3.65; p = 0.023), and lack of knowledge about Leishmania among dog owners (OR = 1.74; 95% CI = 0.96-3.21; p = 0.049). After multivariate analysis, the RFs for occurrence of Leishmania exposure in dogs that remained significantly associated were the dog’s size (large dogs) (OR = 1.2; 95% CI = 1.06-1.35; p = 0.003) and presence of chickens on the properties (small farms) (OR = 1.15; 95% CI = 1.02-1.30; p = 0.023). CONCLUSIONS: These results may be useful for improving preventive practices to reduce the incidence of Leishmania exposure among dogs in rural areas.

Resumo O objetivo deste estudo foi comparar testes moleculares usados para diagnosticar Leishmania spp., em cães apresentando diferentes estágios de infecção. Amostras de sangue e suabe conjuntival (SC) de cães classificados em quatro estágios clínicos foram submetidas a diferentes PCRs (primers 13A/13B, MC1/MC2, LITSR/L5.8S e LEISH-1/LEISH-2). Para o estudo, 22,3% (48/215) dos cães foram classificados como sem sinais clínicos, 67,5% (145/215) estágio I (doença leve), 7,0% (15/215) estágio II (doença moderada) e 3,2% (7/215) estágio III (doença grave). Os resultados mostraram que, em amostras de sangue, 13A/13B detectou número significativamente maior de cães positivos no estágio I (25/145) e no total (42/215) (p≤0,05). No entanto, quando as amostras de SC foram testadas, nenhuma diferença foi observada (p>0,05). Por outro lado, no sangue, MC1/MC2 detectou significativamente menos cães positivos sem sinais clínicos (0/48), em estágio I (0/145) e no total (1/215) (p≤0,05). Da mesma forma, em amostras de SC, MC1/MC2 também apresentou menor detecção (1/215) (p≤0,05). Assim, a PCR em amostras de sangue com 13A/13B tem maior capacidade de detectar cães positivos, principalmente no início da doença do que outros primers, e o par de primers MC1/MC2 não é uma boa escolha para detectar infecção por Leishmania infantum em cães.

Abstract The aim of this study was to compare molecular tests used to diagnose Leishmania spp. in dogs with different stages of infection. Blood and conjunctival swab (CS) samples from dogs classified in four clinical stages were subjected to different PCR protocols (13A/13B, MC1/MC2, LITSR/L5.8S and LEISH-1/LEISH-2 primers). To the study, 22.3% (48/215) of dogs were classified as without clinical signs, 67.5% (145/215) stage I (mild disease), 7.0% (15/215) stage II (moderate disease) and 3.2% (7/215) stage III (severe disease). The results showed that in blood samples, 13A/13B detected a significant higher number of positive dogs in stage I (25/145) and in total (42/215) (p≤0.05). However, when CS samples were tested, no difference was observed (p>0.05). On the other hand, in blood samples, MC1/MC2 detected significantly fewer positive dogs classified as without clinical signs (0/48), in stage I (0/145) and in total (1/215) (p≤0.05). Likewise, in CS samples, this primers showed also lower detection (1/215) (p≤0.05). So than, we can conclude that PCR on blood samples with 13A/13B primers has greater capacity to detect positive dogs, mainly at the initial of clinical disease than do other primers and MC1/MC2 are not a good choice to detect Leishmania infantum infection in dogs.

Resumo O objetivo foi realizar um estudo de correlação e descrição histopatológica das lesões associadas à presença de amastigotas de Leishmania infantum na parede intestinal de cães infectados com leishmaniose visceral canina (LVC). Os cães foram subdivididos em três grupos: G1 (n = 8) cães naturalmente infectados com LVC e com amastigotas de L. infantum no intestino; G2 (n = 9) com LVC, mas sem o parasitismo intestinal; e G3 (n = 3) cães não infectados. Métodos histoquímicos e imunoistoquímicos foram utilizados para a histopatologia e a identificação das amastigotas, respectivamente. 47,1% (8/17) dos cães infectados (grupo G1) apresentavam formas amastigotas na mucosa, submucosa e camada muscular do intestino delgado e grosso, destacando-se uma reação inflamatória caracterizada por infiltrado crônico de células mononucleares; macrófagos, linfócitos e plasmócitos. Observou-se uma diferença significativa somente com relação às alterações estruturais microscópicas intestinais nos cães do G1 quando comparadas com G2 e G3. A intensidade parasitária intestinal teve correlação significativa com as alterações microscópicas e os sinais clínicos dos cães do G1. Concluiu-se que as amastigotas de L. infantum por causarem reações inflamatórias na parede intestinal dos cães podem ter contribuído para as alterações dos processos digestórios, agravando ainda mais o quadro clínico dos animais.

Abstract The aim of this work was a correlation study and histopathological description of alterations associated with the presence of Leishmania infantumamastigote in the intestinal wall of dogs infected with canine visceral leishmaniasis (CVL). Three groups were used: G1 (n = 8), comprising naturally infected dogs with CVL with amastigotes of L. infantum in the small and large intestines; G2 (n = 9), infected dogs with CVL, without intestinal amastigotes; and G3 (n = 3), uninfected dogs. Histochemistry and immunohistochemistry methods were used for histopathology and amastigotes identification. 47.1% (8/17) of dogs from G1 group had amastigotes in the mucosa, submucosa and muscle layers of the small and large intestines and it was observed a prominent inflammatory reaction characterized by chronic infiltration of mononuclear cells: macrophages, lymphocytes and plasma cells. Comparison between the groups showed only a significant difference in relation to mucosal microscopic structural alterations in dogs from G1 in relation to G2 and G3. Parasite burden showed significant correlations with the microscopic alterations and clinical status of dogs in G1. By the conclusion, the inflammatory reactions caused by the parasites in the intestines might have contributed towards alterations in digestive processes, worsening the dogs’ clinical status of CVL.

O objetivo desse trabalho foi o estudo da prevalência de Lutzomyia longipalpis e da leishmaniose visceral canina (LVC) em uma área rural do município de Ilha Solteira do estado de São Paulo. Amostras de sangue foram coletadas de 32 cães provenientes de pequenas propriedades rurais e analisadas por meio dos métodos sorológicos ELISA (imunoensaio enzimático indireto) e RIFI (reação de imunofluorescência indireta) para o diagnóstico da LVC. Pelos exames sorológicos, dos 32 cães avaliados, 31,25% foram diagnosticados positivos para LVC, os quais estavam diostribuídos em 66,67% (8/12) das propriedades positivas para Lutzomyia longipalpis. Armadilhas luminosas do tipo CDC (Center for Disease Control and Prevention) foram instaladas em 12 propriedades, sendo uma por propriedade, e as coletas dos insetos foram realizadas três dias consecutivos a cada mês, durante um ano. O inseto L. longipalpis foi encontrado em 100% das propriedades visitadas, pelo menos uma vez no ano, totalizando 65 machos e 25 fêmeas. A maior quantidade de insetos foi observada principalmente após a ocorrência dos maiores picos de precipitação pluvial, mas a associação entre a prevalência dos vetores peridomiciliares e os dados climáticos (precipitação, umidade relativa do ar e temperatura) assim como a ocorrência da CVL em cães em cada propriedade não foi estatisticamente significante (p<0.05). No entanto, alerta-se que pela presença dos casos de LVC nos cães amostrados e também de L. longipalpis, maior atenção deve ser dada durante as investigações epidemiológicas para o controle dessa doença nessa área rural estudada.

This study aimed to investigate the occurrence of Lutzomyia longipalpis and also the canine visceral leishmaniasis (CVL) in a rural area of Ilha Solteira, state of São Paulo. Blood samples were collected from 32 dogs from different rural properties (small farms) and were analyzed by ELISA and the indirect immunofluorescence antibody test (IFAT) in order to diagnose CVL. From these serological tests, 31.25% of the dogs were positive for CVL and these were distributed in 66.7% (8/12) of the rural properties, which were positive for L. longipalpis. CDC (Center for Disease Control and Prevention) light traps were installed in 12 properties (one per property) and insects were caught on three consecutive days per month for one year. L. longipalpis was present on 100% of the rural properties visited, at least once during the twelve-month interval, totaling 64 males and 25 females. The insects were more numerous after the peak of the rain, but the association between prevalence of peridomestic vectors and the climatic data (precipitation, relative air humidity and temperature) and the occurrences of CVL among dogs on each rural property were not statistical significant (p <0.05). However, the occurrence of CVL cases in dogs and the presence of L. longipalpis indicate that more attention is necessairy for the control of this disease in the rural area studied.