RESUMO O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito direto de concentrações de cafeína sobre a viabilidade, atividade de síntese e expressão gênica em culturas de condrócitos de ratos. As cartilagens dos fêmures e tíbias de 15 ratos Wistar com três dias foram extraídas para isolamento de condrócitos. Os condrócitos foram cultivados em meio condrogênico (controle) ou em meio acrescido de diferentes concentrações de cafeína (0,5, 1,0, 2,0mM). Foram avaliadas a viabilidade celular, a atividade da fosfatase alcalina e a síntese de colágeno por ensaios colorimétricos aos sete, 14 e 21 dias. Condrócitos cultivados sob lamínulas foram corados pela hematoxilina e eosina, para se determinar a porcentagem de células/campo, e pelo PAS, safranina O, alcian Blue, para se determinar a porcentagem de matriz condrogênica/campo aos 21 dias. Foi avaliada a expressão de transcriptos gênicos para Sox-9, Runx-2, agrecano, colágeno-II e fosfatase alcalina por qRT-PCR, aos 21 dias. As médias foram comparadas pelo Student-Newman-Keuls. A cafeína reduziu significativamente o MTT em cristais de formazan, a porcentagem de células/campo, a síntese de colágeno, a atividade da fosfatase alcalina e a síntese de matriz condrogênica PAS+, safranina O+, alcian blue+ e expressão de Sox-9 e colágeno-II. Conclui-se que a cafeína, nas concentrações de 0,5, 1,0, 2,0mM, apresenta efeito inibidor direto sobre a condrogênese em culturas de condrócitos de ratos.

ABSTRACT The aim of this study was to evaluate the effect of concentrations of caffeine on the viability, synthesis activity and gene expression in cultures of chondrocytes. Extracted articular cartilage from the femurs and tibias of 15 Wistar rats at three days old to isolate chondrocytes. Chondrocytes were cultured in chondrogenic medium (control) or supplemented with caffeine (0.5, 1.0, 2.0mM). Cell viability, alkaline phosphatase activity and collagen synthesis were assessed using colorimetric assays at 7, 14, 21 days. The chondrocyte cultures of all groups grown under coverslips were stained with hematoxylin-eosin to determine the percentage of cells/field and with PAS, safranin O, alcian blue to determine the percentage of matrix chondrogenic/field at 21 days. The expressions of gene transcripts for aggrecan, collagen-II, Sox-9, Runx-2 and alkaline phosphatase were also evaluated by RT-PCR at 21 days. The means were compared using Student-Newman-Keuls. Caffeine significantly reduced the conversion of MTT to formazan, percentage of cells/field, collagen synthesis, alkaline phosphatase activity, synthesis of PAS+, safranin O+ and alcian blue+ chondrogenic matrix, and the expression of aggrecan, Sox-9 and II collagen. It is concluded that caffeine at concentrations of 0.5, 1.0, 2.0mM has a direct inhibitory effect on chondrogenesis in cultures of chondrocytes from rats.

RESUMO O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito in vitro da prolactina sobre o potencial osteogênico de células-tronco mesenquimais do tecido adiposo (CTM-TA) em ratas. CTM-TA foram cultivadas em meio osteogênico com e sem adição de prolactina e distribuídas em três grupos: 1) CTM-TA (controle), 2) CM-TA com adição de 100ng/mL de prolactina e 3) CTM-TA com adição de 300ng/mL de prolactina. Aos 21 dias de diferenciação, foram realizados os testes de conversão do MTT em cristais de formazan, porcentagem de nódulos mineralizados e células por campo e quantificação dos transcritos gênicos para fosfatase alcalina, osteopontina, osteocalcina, sialoproteína óssea, BMP-2 e colágeno I. A adição de prolactina reduziu a conversão do MTT no grupo 3 e aumentou a porcentagem de células por campo nos grupos 2 e 3, sem alterar significativamente a porcentagem de nódulos mineralizados e a expressão de fosfatase alcalina, osteopontina, osteocalcina, sialoproteína óssea, BMP-2 e colágeno I. Conclui-se que a adição de prolactina nas concentrações de 100ng/mL e 300ng/mL não altera a diferenciação osteogênica das CTM-TA de ratas, apesar do aumento de celularidade da cultura.

ABSTRACT The objective was to evaluate the in vitro effect of prolactin in osteogenic potential of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) in female rats. ADSCs were cultured in osteogenic medium with and without the addition of prolactin and distributed into three groups: 1) ADSCs (control), 2) ADSCs with addition of 100ng/mL of prolactin and 3) ADSCs with addition of 300ng/mL of prolactin. At 21 days of differentiation, the tests of MTT conversion into formazan crystals, percentage of mineralized nodules and cells per field and quantification of genic transcript for alkaline phosphatase, osteopontin, osteocalcin, bone sialoprotein, BMP-2 and collagen I by real-time RT-PCR were made. The addition of prolactin reduced the conversion of MTT in group 3 and increased the percentage of cells per field in the groups 2 and 3, however without significantly increasing the percentage of mineralized nodules and the expression of alkaline phosphatase, osteopontin, osteocalcin, bone sialoprotein, BMP-2 and collagen I. In conclusion, the addition of prolactin in concentrations of 100ng/mL and 300ng/mL does not change the osteogenic differentiation to the ADSCs of female rats despite increase in the cellularity of the culture.

RESUMO A presença do ácido nucleico (RNA) do vírus da cinomose canina (CDV) foi avaliada por meio da amplificação parcial do gene N pela técnica RT-PCR realizada em urina de cães provenientes de Uberlândia, Minas Gerais, que apresentavam sinais clínicos sugestivos de cinomose. Das 33 amostras de urina avaliadas, o CDV foi identificado em 45,5%. Em cinco cães que morreram espontaneamente, além da excreção do CDV na urina, foram observadas alterações histopatológicas associadas à infecção por esse vírus. Análises estatísticas demonstraram que a idade, gênero, raça e o sistema orgânico comprometido dos cães avaliados não exerceram influência no diagnóstico da cinomose canina. Mioclonia e incoordenação motora foram as manifestações neurológicas que apresentaram frequência de ocorrência significativa (P<0,05). Uma associação direta foi observada entre a presença de ceratoconjuntivite e a identificação de virúria pelo CDV. Esses achados sugerem que a excreção do CDV pela urina em cães com sinais clínicos compatíveis com cinomose pode não ser relacionada com a idade do animal, e que animais sintomáticos podem apresentar manifestações clínicas atribuídas ao CDV, porém sem a caracterização de virúria por RT-PCR. Adicionalmente, análises filogenéticas sugerem que várias cepas de CDV podem estar circulando em populações caninas de áreas urbanas no Brasil.

This study investigated the occurrence of canine distemper virus (CDV) by evaluating the presence of viral RNA within urine samples of dogs from Uberlândia, MG, with clinical manifestations suggestive of infection by CDV by targeting the CDV N gene. Of the clinical samples collected ( n =33), CDV viruria was detected in 45.5%. Five dogs died spontaneously; all had characteristic CDV-associated histopathological alterations and demonstrated CDV viruria. Statistical analyses revealed that the age, gender, breed, or the organ system of the dog affected had no influence on the occurrence of canine distemper. Myoclonus and motor incoordination were the most significant neurological manifestations observed. A direct association was observed between keratoconjunctivitis and dogs with CDV viruria. These findings suggest that CDV viruria in symptomatic dogs might not be age related, and that symptomatic dogs can demonstrate clinical manifestations attributed to CDV without viruria identified by RT-PCR. Additionally, the results of the sequence identities analysed have suggested that all Brazilian wild-type strains of CDV currently identified are closely related and probably originated from the same lineage of CDV. Nevertheless, phylogenetic analyses suggest that there are different clusters of wild-type strains of CDV circulating within urban canine populations in Brazil.

O Lobo-marinho-sul-americano (Arctocephalus australis) é um mamífero marinho anfíbio distribuído ao longo da Costa do Atlântico e do Pacífico da América do Sul. Esta espécie está bem adaptada a diferentes habitats devido à morfologia dos membros em forma de nadadeira e de seu sistema tegumentar. Estudos imuno-histoquímicos são importantes para avaliar os mecanismos de adaptação da pele devido a diferencial expressão dos antígenos presentes no tecido dependendo da região da superfície corporal. Entretanto, sua epiderme altamente pigmentada (melanina) impede a visualização dos marcadores cromógenos utilizados na imuno-histoquímica. Neste trabalho foi desenvolvido um método de clarear a melanina para permitir a visualização dos cromógenos sem alterar a afinidade antígeno-anticorpo para a imuno-histoquímica. A análise do índice do PCNA (proliferating cell nuclear antigen) na epiderme de A. australis, com diaminobenzidina (DAB) como cromógeno foi usada para testar o método. O clareamento da melanina permitiu obter o índice de proliferação celular na epiderme e evitar resultados falso-positivos sem afetar os resultados imuno-histoquímicos.

The South American fur seal (Arctocephalus australis) is an amphibious marine mammal distributed along the Atlantic and Pacific coasts of South America. The species is well adjusted to different habitats due to the morphology of its fin-like members and due to some adaptations in their integumentary system. Immunohistochemical studies are very important to evaluate the mechanisms of skin adaptation due the differential expression of the antigens present in the tissue depending of the region of the body surface. However, its strongly pigmented (melanin) epidermis prevents the visualization of the immuno-histochemical chromogens markers. In this study a melanin bleaching method was developed aimed to allow the visualization of the chromogens without interfering in the antigen-antibody affinity for immunohistochemistry. The analysis of PCNA (proliferating cell nuclear antigen) index in the epidermis of A. australis by immunohistochemistry with diaminobenzidine (DAB) as chromogen was used to test the method. The bleaching of the melanin allowed to obtain the cell proliferation index in epidermis and to avoid false positive results without affecting the immunohistochemical results.

The objective of the present study was to describe motor behavioral changes in association with histopathological and hematological findings in Wistar rats inoculated intravenously with human T-cell lymphotropic virus type 1 (HTLV-1)-infected MT2 cells. Twenty-five 4-month-old male rats were inoculated with HTLV-1-infected MT2 cells and 13 control rats were inoculated with normal human lymphocytes. The behavior of the rats was observed before and 5, 10, 15, and 20 months after inoculation during a 30-min/rat testing time for 5 consecutive days. During each of 4 periods, a subset of rats was randomly chosen to be sacrificed in order to harvest the spinal cord for histopathological analysis and to obtain blood for serological and molecular studies. Behavioral analyses of the HTLV-1-inoculated rats showed a significant decrease of climbing, walking and freezing, and an increase of scratching, sniffing, biting, licking, and resting/sleeping. Two of the 25 HTLV-1-inoculated rats (8%) developed spastic paraparesis as a major behavioral change. The histopathological changes were few and mild, but in some cases there was diffuse lymphocyte infiltration. The minor and major behavioral changes occurred after 10-20 months of evolution. The long-term observation of Wistar rats inoculated with HTLV-1-infected MT2 cells showed major (spastic paraparesis) and minor motor abnormalities in association with the degree of HTLV-1-induced myelopathy.

Empregou-se a estimulação elétrica neuromuscular (EENM) de baixa freqüência no músculo quadríceps femoral de cães com atrofia induzida e avaliou-se a ocorrência de ganho de massa nessa musculatura. Foram utilizados oito cães com pesos entre 15 e 30kg, distribuídos aleatoriamente em dois grupos denominados de I ou controle e II ou tratado. A articulação femorotibiopatelar esquerda foi imobilizada por 30 dias pelo método de transfixação percutânea tipo II, com retirada de aparelho de imobilização após esse período. Decorridas 48 horas da remoção, foi realizada a EENM nos cães do grupo II, cinco vezes por semana, com intervalo de 24 horas cada sessão, pelo período de 60 dias. Foram avaliadas a circunferência da coxa, a goniometria do joelho, a análise clínica da marcha, as enzimas creatina-quinase (CK) e aspartato-amino-transferase (AST) e a morfometria das fibras musculares em cortes transversais do músculo vasto lateral colhido mediante biópsia muscular. A EENM foi empregada no músculo quadríceps femoral na freqüência de 50Hz, duração de pulso de 300 milisegundos e relação de tempo on/off de 1:2. Quanto à morfometria das fibras do músculo vasto lateral, no grupo tratado houve aumento significativo (P<0,05) da área transversal aos 90 dias em relação ao dia zero. A EENM de baixa freqüência ocasiona hipertrofia do músculo vasto lateral em cães após a imobilização rígida temporária da articulação do joelho.

Low frequency neuromuscular electrical stimulation (NMES) was used on the femoral quadriceps of dogs with induced muscular atrophy and the occurrence of gain in mass in these muscles was evaluated. Eight dogs from 15 to 30kg were randomly distributed in two groups named I, or control; and II, or treated. For the induction of muscular atrophy, the left femoral-tibial-patellar joint was immobilized for 30 days by percutaneous transfixation type II. After 30 days, the immobilization device was removed. The NMES treatment began 48 hours after the removal of the immobilization device of the dogs of group II, and it was carried out five times per week with an interval of 24 hours between each session, for 60 days. The following parameters were measured: thigh circumference, goniometry of the knee, clinical gait analysis, creatine kinase (CK) and aspartate aminotransferase (AST) enzymes, and morphometry of the muscular fibers in transversal cuts of the vastus lateralis muscle collected through muscular biopsy. The NMES was applied on the femoral quadriceps at a frequency of 50 Hz, with pulse duration of 300 milliseconds, and the on/off time was at a proportion of 1:2. Regarding the morphometry of the vastus lateralis fibers, a significant increase (P<0.05) in the transversal area of the treated group at 90 days was observed when compared with that identified at the time of immobilization. Thus, it can be concluded that low frequency NMES brings about hypertrophy of the vastus lateralis muscle in dogs after temporary rigid immobilization of the knee joint.

A fim de avaliar as conseqüências da infecção por HIV no curso da infecção por HBV, ou na imunidade anteriormente adquirida, estudamos um grupo de 66 doentes Caucasóides HIV1+ sintomáticos e outro de 38 indivíduos seropositivos para HIV2 e provenientes da África, quanto a marcadores serológicos de infecção por HBV e quanto à presença de DNA viral circulante, tomada como sinal de replicação ativa do vírus da hepatite. Os grupos HIV+ foram comparados com controles seronegativos adequados tendo-se verificado que 7.6% dos doentes HIV1+ eram também HBV-DNA+ (versus 3.2% nos seronegativos) bem como 2.6% dos HIV2+ (versus 2.9% nos controles seronegativos), não sendo as diferenças estatisticamente significativas em qualquer um dos casos e não tendo sido encontrada correlação entre infecção por HIV e replicação ativa de HBV. A imunodeficiência que se instala progressivamente após infecção por HIV, poderá ser compatível com um grau de vigilância T suficiente para impedir reinfecção ou reativação de HBV, mesmo em indivíduos já sintomáticos. Os nossos resultados são relevantes para a escolha de estratégias preventivas da hepatite B em gupos com risco de infecção por HIV.

To evaluate the effect of concurrent infection by HIV on HBV infection or immunity, we have studied a group of 66 HIV1+ symptomatic Caucasian patients and another of 38 African HIV2+ asymptomatic individuals, concerning their HBV status: serological markers of infection and presence of HBV-DNA in serum, the last taken as sign of hepatitis B virus active replication, were monitored. HIV+ groups were compared with seronegative controls, adequately matched for age, sex and ethnological background. HBV DNA was found in 7.6% of HIV1+ Caucasian patients and 3.2% of seronegative controls; in African HIV2+ individuals 2.6% were also HBV DNA+, a percentage close to that found in HIV2 seronegative controls (2.9%). No correlation was found between HIV infection and HBV active replication. Immunodepression that follows HIV infection over time may be compatible with a degree of T cell function capable of avoiding reinfection with or reactivation of HBV, even in symptomatic stages of acquired immunodeficiency syndrome. Our findings are relevant to the choice of preventive strategies in populations at risk for HIV and HBV infection.