RESUMO: Objetivou-se padronizar uma reação do tipo multiplex PCR (mPCR) para detectar Microsporum canis, Microsporum gypseum e o complexo Trichophyton mentagrophytes em amostras de pelos e/ou crostas de cães e gatos. 250 amostras de pelos e/ou crostas de cães e gatos foram analisadas por meio de exame direto e cultura, o DNA das mesmas foi extraído para mPCR. Primers foram desenhados e como controle positivo da reação utilizou-se o DNA extraído de colônias de M. canis (URM 6273), M. gypseum (URM 6921) e T. mentagrophytes (URM 6211), provenientes da Coleção de Culturas (Micoteca URM), Departamento de Micologia, Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco (CCB/UFPE). Como controles negativos de reação, utilizou-se água destilada esterilizada e DNA extraído de Alternaria sp. para verificar a especificidade dos primers. Do total de amostras analisadas, 15 (6%) foram identificadas, em cultura, como dermatófitos, e destas, 10 foram M. canis, três M. gypseum e dois T. mentagrophytes (complexo). Destas 15 amostras positivas, 11 (73,3%) foram detectadas por meio da mPCR. Além destas, seis outras, negativas em cultura, foram identificadas como M. gypseum. Verificou-se uma boa concordância entre os resultados da cultura e mPCR (Kappa: 0,66). O protocolo padronizado neste estudo pode ser utilizado como um método de triagem, por apresentar uma sensibilidade maior que a da cultura, usado paralelamente aos exames de rotina, permitindo um diagnóstico em menor tempo.

ABSTRACT: The aim of this study was to standardize a multiplex PCR (mPCR) reaction to detect Microsporum canis, Microsporum gypseum and the Trichophyton mentagrophytes complex in dog and cat fur and/or crusts. 250 fur and/or crusts samples from dogs and cats were analyzed by direct examination and culture, DNA from them was extracted for mPCR. Primers were designed and the DNA extracted from colonies of M. canis (URM 6273), M. gypseum (URM 6921) and T. mentagrophytes (URM 6211) from the Collection of Cultures - URM Micoteca - Department of Mycology, Biological Sciences Center of the Federal University of Pernambuco (CCB / UFPE). As negative controls, sterile distilled water and DNA extracted from Alternaria sp., were used to verify the specificity of the primers. Of the total samples analyzed, 15 (6%) were identified in culture as dermatophytes, and of these, 10 were M. canis, three M. gypseum and two T. mentagrophytes (complex). Of these 15 positive samples, 11 (73.3%) were detected by mPCR. Besides these, six others, negative in culture, were identified as M. gypseum. There was good agreement between culture results and mPCR (Kappa: 0.66). The protocol standardized in this study can be used as a screening method, because it has a sensitivity greater than that of the culture, used in parallel to the routine exams, allowing a diagnosis in a shorter time.

Resumo: O presente estudo relata a ocorrência de membros da Classe Mollicutesno sistema reprodutivo de bovinos leiteiros no Brasil. Foram visitadas em janeiros de 2012 cinco fazendas de bovinos leiteiros. Um total de 100 vacas de diferentes idades, raças e estágios de lactação foram examinadas. Os animais foram mantidos em sistema de manejo intensivo e/ou semi-intensivo, sendo submetidos aos sistemas de ordenha manual ou mecânica. As amostras de muco foram colhidas após a lavagem da região vulvar com água e sabão, com posterior desinfecção com álcool (70°GL). O muco vaginal foi colhido com suabe alginado estéril que foi friccionado nas paredes internas da vagina. Em seguida, as amostras foram cultivadas em meio Hayflick´s modificado, para micoplasmas, e em meio UB, para ureaplasmas, ambos caldo e placa. Os ensaios da PCR para Mollicutese Ureaplasmaspp. foram realizados de acordo com protocolo padrão descrito na literatura. No isolamento, a frequência de Mycoplasmaspp. foi de 13% (13/100) e para Ureaplasmaspp. foi de 6% (6/100). Nas reações da PCR a frequência para Mollicutesfoi de 26% (26/100) e para Ureaplasmas spp. foi de 13% (13/100) nos rebanhos bovinos leiteiros estudados. Este é o primeiro relato destes agentes no trato reprodutivo de bovinos no Estado de Pernambuco. Estudos adicionais são necessários para determinar as espécies e o potencial patogênico destes isolados de campo.

Abstract: The aim of the present study was to report the occurrence of members of the Mollicutesclass in the reproductive system of dairy cattle in Brazil. Five farms containing dairy cattle were visited in January of 2012. In total, 100 cows of different ages, breeds and stages of lactation were examined in the present study. The cows were part of intensive or semi-intensive management systems and were submitted to mechanical milking or hand milking. The samples were collected after washing the vulvar region with water and soap, and then drying it with paper towels and disinfecting the area with alcohol (70°GL). Vaginal mucous was collected using a sterile alginate cotton swab, which was rubbed on the vagina, as well as the lateral and internal walls. Vulvovaginal mucous samples were cultured in both liquid and solid modified Hayflick´s medium, for mycoplasmas, and UB medium, for ureaplasmas. The PCR assays for Mollicutesand Ureaplasmaspp. were performed according to the standard protocols described in the current literature. During isolation, the frequency of Mycoplasmaspp. was of 13.0% (13/100) and for Ureaplasmaspp. was of 6.0% (6/100). In the PCR assays the frequency of Mollicuteswas of 26.0% (26/100) and for Ureaplasmaspp. was of 13.0% (13/100) in the dairy cattle studied. This is the first report of these agents in reproductive system of bovine of the Pernambuco state. Further studies are necessary to determine the pathogenic potential and species of these field isolates.

Objetivou-se estudar a ocorrência de anticorpos contra Toxoplasma gondii e detectar o DNA genômico do parasito em órgãos reprodutivos, fetos e anexos fetais de ovelhas em matadouros no estado de Pernambuco, Brasil. Foram coletadas amostras de soro sanguíneo, útero, trompas e ovários, além de fetos e placentas. Para a triagem utilizou-se a técnica de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e para a detecção do DNA de T. gondii empregou-se a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) nos animais positivos na sorologia e em todos os fetos e anexos fetais. Na sorologia, 13/50 amostras foram positivas e o DNA genômico de T. gondii foi detectado em uma amostra de útero, trompa, ovário, placenta e feto (coração, cérebro e cordão umbilical) de uma ovelha positiva na sorologia. A identidade molecular dos produtos amplificados foi confirmada por sequenciamento. Neste estudo comprova-se a ocorrência do DNA de T. gondii em órgãos do sistema reprodutivo, placenta e feto de ovelha naturalmente infectada.

The aim of the present study was to assess the occurrence of antibodies to Toxoplasma gondii and to detect genomic DNA of the parasite in the reproductive organs, fetuses and fetal membranes of sheep in slaughterhouses in the state of Pernambuco, Brazil. The Indirect Immunofluorescence technique (IFA) was used for screening. The Polymerase Chain Reaction (PCR) was used to detect DNA of T. gondii in the animals that were positive in the serology. In the serology, 13/50 samples were positive and genomic DNA of T. gondii was detected in one uterus, tube, ovary, placenta and fetus (heart, brain and umbilical cord) sample from a sheep that was positive in the serology. The present study provides evidence of the occurrence of T. gondii DNA in the organs of the reproductive system, placenta and fetus of a naturally infected sheep.

O potencial dos isolados DFs185 (Pseudomonas synxatha), DFs223 (Pseudomonas fluorescens), DFs306 (não identificado), DFs416, DFs418 e DFs419 (Bacillus sp.), DFs422 (Bacillus subtilis) e DFs471 (Stenotrophomonas maltophilia) foi avaliado para o controle da mancha-parda (Bipolaris oryzae) e da escaldadura (Gerlachia oryzae) do arroz. Para tanto, sementes da cultivar El Passo L144 foram imersas em suspensão (10(7) a 10(8) UFC/mL) de cada um dos isolados, agitadas por 30 min a 10ºC e semeadas em vasos, sendo utilizado o delineamento inteiramente casualizado com quatro repetições. Foram utilizadas duas testemunhas: uma tratada com solução salina e outra com solução salina mais fungicida (Carboxin+Thiran). Realizaram-se dois ensaios para cada um dos patógenos, inoculados nas plantas por aspersão, e avaliados quanto à severidade aos 7, 14 e 21 dias após a inoculação calculando a área abaixo da curva de progresso da doença. Para mancha-parda, no primeiro ensaio, o melhor desempenho foi proporcionado pelos isolados DFs185, DFs223 e DFs306 que apresentaram 80, 86 e 70% de redução da severidade. No segundo ensaio, o isolado DFs306 foi o mais eficiente deles, com redução na severidade da doença chegando a 74% em relação à testemunha, sendo que os isolados DFs223, DFs185 e DFs306 proporcionaram incremento na massa de grãos em 74, 70 e 59%, respectivamente. Para o controle da escaldadura, no primeiro ensaio, os isolados que apresentaram melhores resultados foram DFs416 e DFs418 com 65 e 59% de controle, respectivamente. No segundo ensaio, se destacaram os isolados DFs416 e DFs185 reduzindo a severidade da doença em 64 e 60%, respectivamente sem incrementar a produção.

The potential of isolates DFs185 (Pseudomonas synxatha), DFs223 (Pseudomonas fluorescens), DFs306 (unidentified), DFs416, DFs418 and DFs419 (Bacillus sp.), DFs422 (Bacillus subtilis) and DFs471 (Stenotrophomonas maltophilia) was evaluated for the control of rice brown spot (Bipolaris oryzae) and leaf scald (Gerlachia oryzae). Rice seeds cv. El Passo L144 were immersed in a suspension (10(7) a 10(8) CFU/mL) of each of the isolates, agitated for 30 min at 10ºC and sowed in pots, in complete randomized design with four replications. Two controls were used: one with seeds treated with saline solution, and the other with saline solution plus fungicide (Carboxin+Thiran). Two assays for each of the pathogens were carried out. Plants were inoculated by spraying and their disease severity was evaluated at 7, 14 and 21 days after inoculation for the calculation of the area under disease progress curve. The best result for brown spot biocontrol in the first assay was provided by isolates DFs185, DFs223 and DFs306, which presented 80, 86 and 70% of control. In the second assay, isolate DFs306 was the most efficient, with reduction in disease severity reaching 74% in relation to control. The isolates DFs223, DFs185 and DFs306 provided a rise in grain yield of 74, 70 and 59%, respectively. For the control of leaf scald, in the first assay, the isolates that presented the best results were DFs416 and DFs418, which showed 65 and 59% of control, respectively. In the second experiment, isolates DFs416 and DFs185 reduced the disease severity, respectively, by 64 and 60%, without increasing the yield.

Tem-se dado muita ênfase ao controle biológico mediante seleção de microorganismos. Porém, para se avaliar o potencial de biocontroladores de forma massal e em pequeno intervalo de tempo é necessário desenvolver um bioensaio eficiente. Bactérias de diferentes sítios, num total de 760 isolados, foram selecionadas para compatibilidade com Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli estirpes SEMIA 4077 e SEMIA 4080, onde 596 isolados foram inefetivos contra ambos rizóbios. Sementes de feijão foram imersas em suspensão de cada um destes isolados sendo agitadas por 5 horas a 10ºC, plantadas em solo não esterelizado, sendo as plantas mantidas em casa de vegetação. Após o desenvolvimento das folhas cotiledonares e folhas primárias, estas foram retiradas e avaliadas por bioensaio para o controle de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (XAP). Nas folhas cotiledonares, observou-se que o isolado DFs093, proporcionou 100% de controle, DFs041 e DFs1297 propiciaram, 90% e DFs490, DFs769, DFs831, DFs842 e DFs843 proporcionaram 80% de controle. Nas folhas primárias, o isolado, DFs482 propiciou 100% e os isolados DFs080, DFs348, DFs513, DFs622, DFs769, DFs842 e DFs912 proporcionaram 80% de controle para XAP.

Emphasis has been given on selection of micro-organism for biological control. However, in order to evaluate the biological control potential of a great number of micro-organisms in a small period of time it is necessary to develop an efficient bioassay. Seven hundred and sixty bacterial isolates from different habitats, were selected for compatibility with Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli (SEMIA 4077 e SEMIA 4080). Among them 596 isolates were ineffective against both rhizobia. Bean seeds immersed in suspension of each one of these isolates were agitated for 5 hours at 10ºC and sowed in non-sterilized soil. The plants were kept in greenhouse. After the development of cotyledonary and primary leaves, these were removed and bioassayed for Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (XAP) control. In the cotyledonary leaves, it was observed that the isolate DFs093 offered 100% control, DFs041 and DFs1297 offered 90% and DFs490, DFs769, DFs831, DFs842 and DFs843 offered 80% control. In the primary leaves, the DFs482 isolated offered 100% and the DFs080, DFs348, DFs513, DFs622, DFs769, DFs842 and DFs912 offered 80% of XAP control.

A doença de Machado-Joseph (MJD) é uma forma de ataxia espinocerebelar (AEC) de herança autossômica domi nante, que foi descrita inicialmente em pacientes norte-americanos provenientes das ilhas portuguesas dos Açores. Clinicamente essa doença é caracterizada por uma ataxia cerebelar progressiva, de início tardio e com algumas características associadas tais como: oftalmoplegia, sinais piramidais e extrapiramidais e amiotrofias. A mutação responsável é uma expansão de trinucleotídeos CAG localizada na região codificadora do gene MJD1. Como parte de um estudo colaborativo sobre AEC no Brasil, nós identificamos 25 famílias, não aparentadas, segregando a mutação MJD. Nesse artigo nós relatamos as características moleculares do trinucleotídeo CAG presente no gene MJD1 em 62 indivíduos dessas famílias com MJD e em 63 indivíduos que não apresentam a mutação MJD (126 cromossomos normais) e que foram considerados como controles. Nós observamos uma grande diferença entre o tamanho dos alelos CAG normais e expandidos. Os alelos normais variaram entre 12 e 33 CAGs (média de 23 CAGs), enquanto que os alelos expandidos tiveram de 66 a 78 CAGs (média de 71.5 CAGs). Não encontramos nenhuma diferença entre o tamanho dos alelos expandidos em pacientes masculinos e femininos ou entre alelos transmitidos via paterna ou materna. Uma correlação negativa significante foi observada entre a idade de início da doença e o tamanho do segmento de CAG expandido (r = -0,6, P = 0,00006); no entanto o tamanho do segmento de CAG expandido foi responsável por somente 40% da variabilidade na idade de início da doença (r2 = 0.4). Nós observamos também instabilidade do segmento expandido de CAG durante a transmissão de pais para filhos. Expansões e contrações foram observadas; contudo, houve uma tendência geral para expansão, com um aumento médio de +2,4 CAGs. Essa tendência para expansão pareceu ser maior nas transmissões paternas (aumento médio de +3,5 CAGs) que nas maternas (aumento médio de +1,3 CAGs). Antecipação foi observada em todas as transmissões nas quais as idades de início para pais e filhos eram conhecidas, porém, nem todas as antecipações foram acompanhadas de aumento no tamanho do segmento de CAG expandido. Em conclusão, os nossos resultados mostram que o diagnóstico molecular da mutação responsável pela MJD pode ser estabelecido em todos os indivíduos que apresentam a doença, bem como excluído naqueles portadores de outras formas de AEC, já que não encontramos alelos de tamanho intermediário que poderiam dificultar a interpretação do teste molecular. Porém, o tamanho do segmento de CAG expandido não deve ser usado para predizer a idade de início da doença, já que apenas 40% da variabilidade na idade de início pode ser explicada pelo tamanho do segmento de CAG expandido.

Machado-Joseph disease (MJD) is a form of autosomal dominant spinocerebellar ataxia first described in North-American patients originating from the Portuguese islands of the Azores. Clinically this disorder is characterized by late onset progressive ataxia with associated features, such as: ophthalmoplegia, pyramidal and extrapyramidal signs and distal muscular atrophies. The causative mutation is an expansion of a CAG repeat in the coding region of the MJD1 gene. We have identified 25 unrelated families segregating the MJD mutation during a large collaborative study of spinocerebellar ataxias in Brazil. In the present study a total of 62 family members were genotyped for the CAG repeat in the MJD1 gene, as well as 63 non-MJD individuals (126 normal chromosomes), used as normal controls. We observed a wide gap between the size range of the normal and expanded CAG repeats: the normal allele had from 12 to 33 CAGs (mean = 23 CAGs), whereas the expanded alleles ranged from 66 to 78 CAGs (mean = 71.5 CAGs). There were no differences in CAG tract length according to gender of affected individuals or transmitting parent. We observed a significant negative correlation between age at onset of the disease and length of the CAG tract in the expended allele (r = -0.6, P = 0.00006); however, the size of the expanded CAG repeat could explain only about 40% of the variability in age at onset (r2 = 0.4). There was instability of the expanded CAG tract during transmission from parent to offspring, both expansions and contractions were observed; however, there was an overall tendency for expansion, with a mean increase of +2.4 CAGs. The tendency for expansion appeared to the greater in paternal (mean increase of +3.5 CAGs) than in maternal transmissions (mean increase of +1.3 CAGs). Anticipation was observed in all transmissions in which ages at onset for parent and offspring were known; however, anticipation was not always associated with an increase in the expanded CAG repeat length. Our results indicate that the molecular diagnosis of MJD can be confirmed or excluded in all suspected individuals, since alleles of intermediary size were not observed.

Ataxia espinocerebelar tipo 1 (SCA1), ataxia espinocerebelar tipo 2 (SCA2) e doença de Machado-Joseph ou ataxia espinocerebelar tipo 3 (MJD/SCA3) são três formas de ataxia espinocerebelar (SCA) que apresentam herança genética autossômica dominante. Nessas três doenças foi encontrada uma expansão instável de trinucleotídeo CAG localizada na região codificadora dos genes responsáveis pelas três doenças. Portanto, para SCA 1, SCA2 e MJD/SCA3 o diagnóstico molecular é agora possível. A atrofia dentatorubropalidoluisiana (DRPLA) é também causada pela expansão de trinucleotídeos CAG e pode por vezes se apresentar como uma SCA. Nós investigamos a freqüência das mutações responsáveis por SCA1, SCA2, MJD/SCA3 e DRPLA em um grupo de 328 pacientes brasileiros com SCA pertencentes a 90 famílias não aparentadas. Esses pacientes apresentavam padrões diferentes de herança genética e eram provenientes de várias regiões do Brasil. Nós identificamos mutações em 35 famílias, 32 das quais com herança claramente autossômica dominante. A freqüência da mutação SGA1 foi de 3% no grupo total de pacientes, e 6% nos pacientes com herança autossômica dominante. Nós encontramos a mutação SCA2 em 6% de todas as famílias e em 9% das famílias com herança autossômica dominante. A mutação MJD/SCA3 foi encontrada em 30% de todos os pacientes, e em 44% quando consideramos somente os pacientes com herança autossômica dominante. Nenhuma mutação DRPLA foi encontrada. Nós observamos também variabilidade na freqüência das diferentes mutações em pacientes provenientes de diferentes regiões geográficas, o que provavelmente se correlaciona com os padrões distintos de colonização do Brasil. Nossos resultados sugerem que os casos de SCA no Brasil podem ser causados ocasionalmente pela mutação SCA1 e SCA2, mas que a causa mais freqüente de SCA de herança autossômica dominante no Brasil é a mutação MJD/SCA3.

Spinocerebellar ataxia type 1 (SCA1), spinocerebellar ataxia type 2 (SCA2) and Machado-Joseph disease or spinocerebellar ataxia type 3 (MJD/SCA3) are three distinctive forms of autosomal dominant spinocerebellar ataxia (SCA) caused by expansions of an unstable CAG repeat localized in the coding region of the causative genes. Another related disease, dentatorubropallidoluysian atrophy (DRPLA) is also caused by an unstable triplet repeat and can present as SCA in late onset patients. We investigated the frequency of the SCA1, SCA2, MJD/SCA3 and DRPLA mutations in 328 Brazilian patients with SCA, belonging to 90 unrelated families with various patterns of inheritance and originating in different geographic regions of Brazil. We found mutations in 35 families (39%), 32 of them with a clear autosomal dominant inheritance. The frequency of the SCA1 mutation was 3% of all patients; and 6 % in the dominantly inherited SCAs. We identified the SCA2 mutation in 6% of all families and in 9% of the families with autosomal dominant inheritance. The MJD/SCA3 mutation was detected in 30 % of all patients; and in the 44% of the dominantly inherited cases. We found no DRPLA mutation. In addition, we observed variability in the frequency of the different mutations according to geographic origin of the patients, which is probably related to the distinct colonization of different parts of Brazil. These results suggest that SCA may be occasionally caused by the SCA1 and SCA2 mutations in the Brazilian population, and that the MJD/SCA3 mutation is the most common cause of dominantly inherited SCA in Brazil.