Abstract Chrysodeixis includens has become the major Lepidopteran pest of soybean crops, especially in the Brazilian Cerrado (savanna) region. A native isolate of Chrysodeixis includens nucleopolyhedrovirus (ChinNPV) from this region, Buritis, MG, was assessed for its biological and molecular features. In addition, in vitro co-infection with Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV), another virus of an important soybean pest, was tested. The ChinNPV-Buritis isolate presented an average LC50 of 7,750 occlusion bodies (OBs)/ml of diet in C. includens larvae. Analysis of restriction endonuclease profiles of viral DNA revealed similarities with previously described ChinNPV isolates IE, IF, and IG from Brazil, although the presence of submolar bands indicates genetic heterogeneity. Optical microscopy analysis in conjunction with quantitative PCR (qPCR) demonstrated in vitro infection of this isolate in IPLB-SF-21AE, Sf9, and BTI-Tn-5B1-4 cell lines, but the amount of ChinNPV tends to decrease through serial passages. The qPCR method developed in this study successfully detected both AgMNPV and ChinNPV from cell culture and from infected larvae. The cell line Tn-5B1-4 is indicated for future development of in vitro production and co-infection studies.

RESUMO: Plantas de macieira originárias da França introduzidas no Brasil para fins de pesquisa foram submetidas à análise no Laboratório de Quarentena Vegetal da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (Cenargen). Após realizar a enxertia em porta-enxertos sadios, algumas plantas apresentaram sintomas típicos de infecção por fitoplasmas. Os testes por meio da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) obtiveram fragmentos de DNA do tamanho esperado para fitoplasmas. O sequenciamento de DNA revelou uma identidade de 98-99% da região 16 rDNA dos fitoplasmas encontrados com o fitoplasma ‘Candidatus Phytoplasma solani’. Essa espécie de fitoplasma é responsável por perdas em pomares de maçã europeus e não foi relatada no Brasil. De acordo com a Legislação Federal de Proteção de Plantas, as plantas de macieira foram incineradas para evitar a entrada dessa praga exótica no Brasil.

ABSTRACT: Apple plants from France introduced in Brazil for research purposes were subjected to a phytosanitary analysis at the Plant Quarantine Laboratory of Embrapa Genetic Resources and Biotechnology (Cenargen). After grafting onto healthy apple rootstock, some plants showed phytoplasma-infection symptoms. Polymerase Chain Reaction (PCR) tests yielded DNA fragments of the expected size for phytoplasmas. DNA sequencing revealed an identity of the 16S rDNA nucleotide sequence of 98-99% with ‘Candidatus Phytoplasma solani’. This phytoplasma species is responsible for losses in European apple orchards and has not been reported in Brazil. According to the Federal Legislation on Plant Protection, the plants were incinerated to avoid the introduction of this exotic pest in Brazil.

Resumo: O objetivo deste trabalho foi avaliar o aspecto fitossanitário de dois acessos de sementes de milho dos Estados Unidos introduzidas no Brasil, quanto à presença do Wheat mosaic virus (WMoV). Duas a três semanas após a semeadura, folhas sintomáticas foram testadas por Elisa, tendo-se utilizado antissoro específico para WMoV. A reação foi positiva, e as amostras foliares foram analisadas por PCR em tempo real e os produtos de PCR amplificados foram sequenciados. Os isolados de WMoV apresentaram 99 a 100% de identidade nucleotídica com isolados da Austrália e dos Estados Unidos. Até o momento, não há relato da presença desse vírus no Brasil. De acordo com a legislação federal de defesa vegetal, as plantas foram incineradas para evitar a introdução dessa praga exótica no País. Os resultados obtidos mostram a interceptação de WMoV no Brasil.

Abstract: The objective of this work was to evaluate the phytosanitary aspect of two accessions of maize (Zea mays) seeds from the United States introduced to Brazil, regarding the presence of Wheat mosaic virus (WMoV). Two to three weeks after sowing, symptomatic leaves were tested by Elisa using specific antiserum to WMoV. The reaction was positive, and leaf samples were analyzed by real-time PCR and amplified PCR products were sequenced. The WMoV isolates had 99 to 100% nucleotide identity with isolates from Australia and the United States. Until now, there is no report of the presence of this virus in Brazil. According to the federal law on plant protection, the plants were burned to avoid the introduction of this exotic pest in the country. The obtained results show WMoV interception in Brazil.

Entre os problemas fitossanitários da cultura da alface estão as doenças causadas por vírus. Três vírus causam sintomas de mosaico praticamente indistinguíveis: o Lettuce mosaic virus (LMV, Potyvirus), o Lettuce mottle virus (LeMoV, Sequivirus) e o Bidens mosaic virus (BiMV, Potyvirus). Através de RT-PCR utilizando-se oligonucleotídeos específicos para cada um destes vírus, amostras de alface e plantas invasoras, preferencialmente com sintoma de mosaico, foram coletadas em campos de produção de alface das regiões de Mogi das Cruzes, Campinas e Bauru no Estado de São Paulo e analisadas para a presença dos vírus. Verificou-se que o LeMoV foi o vírus encontrado com maior freqüência, seguido do LMV. A ocorrência de BiMV em alface foi extremamente baixa e restrita às regiões de Campinas e Bauru, onde também foi verificado em plantas invasoras como Bidens pilosa e Galinsoga parviflora. Esta ultima é hospedeira dos três vírus.

Among the phytosanitary problems affecting lettuce culture are the diseases caused by viruses. Three viruses cause almost indistinguishable mosaic symptoms: Lettuce mosaic virus (LMV, Potyvirus), Lettuce mottle virus (LeMoV, Sequivirus) and Bidens mosaic virus (BiMV, Potyvirus). By RT-PCR using specific primers for each virus, lettuce and weed samples, preferably with mosaic symptoms, and collected from lettuce fields in the regions of Mogi das Cruzes, Campinas and Bauru, São Paulo State, Brazil, were analyzed for the presence of these viruses. LeMoV was the most frequently found virus, followed by LMV. The occurrence of BiMV in lettuce was extremely low and restricted to the regions of Campinas and Bauru, where it was also found in weeds such as Bidens pilosa and Galinsoga parviflora. The latter plant is the host of these three viruses.

O Bidens mosaic virus (BiMV) é uma espécie tentativa do gênero Potyvirus, que infecta alface (Lactuca sativa). Na ausência de métodos eficientes para diagnose deste vírus, o objetivo do trabalho foi a síntese de oligonucleotídeos específicos e sua otimização em testes de RT-PCR em uma só etapa, partindo-se de extrações de RNA total. Os oligonucleotídeos 8851sens (5'AGG CAG TTC GCA CGG CAT AC 3´) e 9211ant (5´ CTT CAT CTG GAT GTG TGC TTC 3´) permitem a eficiente detecção do vírus e possibilitaram a descoberta de uma nova hospedeira do vírus, a planta Galinsoga parviflora, comumente encontrada em canteiros de produção comercial de alface.

Bidens mosaic virus (BiMV) is a tentative species of the genus Potyvirus and infects lettuce (Lactuca sativa). In the absence of efficient methods for the diagnosis of the virus, the objective of this work was to develop specifics primers for a one-step RT-PCR test using total RNA. The primer pairs 8851sens (5'AGG CAG TTC GCA CGG CAT AC 3´) and 9211ant (5´ CTT CAT CTG GAT GTG TGC TTC 3´) were considered very efficient for the detection of BiMV and the virus was found naturally infecting Galinsoga parviflora, a new host of BiMV, commonly found in commercial lettuce crops.

Em 2004, plantas de alface com sintomas de mosaico coletadas em São Manuel - SP foram analisadas por microscopia eletrônica, constatando-se presença de partículas típicas de potyvirus com 730 nm de comprimento. Após purificação biológica por monolesionais em Chenopodium quinoa, o extrato vegetal foi inoculado em uma série de plantas diferenciadoras, verificando-se que o isolado testado foi capaz de infectar C. quinoa e C. amaranticolor induzindo lesões locais seguidas de mosaico sistêmico. Ervilha (Pisum sativum) mostrou-se assintomática, e em diferentes cultivares de alface como Trocadero, White Boston, Regina, Verônica, Lucy Brown, Rafaela, Tainá, Vera e Laurel foi observado o mosaico. A cultivar Gizele foi tolerante ao vírus. O sequenciamento da região codificadora da proteína capsidial revelou maior identidade de aminoácidos (97%) deste isolado com o Bidens mosaic virus - BiMV (nº de acesso AY960151). Diferentemente dos isolados de BiMV já descritos, este proveniente de alface não foi capaz de infectar Bidens pilosa, Helianthus annuus, Nicotiana tabacum TNN e N. glutinosa. A ocorrência natural do BiMV em alface, causando sintomas semelhantes aos do LMV e a suscetibilidade de várias das cultivares hoje plantadas, servem como um alerta para a correta diagnose do vírus a campo.

In 2004 lettuce plants showing mosaic symptoms collected in São Manuel, SP were analyzed by electron microscopy, and particles with 730 nm typically from potyvirus were observed. After biological purification by monolesionals on Chenopodium quinoa, this isolate was sap inoculated on a host range assay. The virus infected C. quinoa and C. amaranticolor, causing local lesions and systemic mosaic. The virus did not induce symptoms on pea (Pisum sativum), but induced mosaic on the leaves of some lettuce cultivars such as Trocadero, White Boston, Regina, Verônica, Lucy Brown, Rafaela, Tainá, Vera and Laurel. The lettuce cultivar Gizele was tolerant to the virus. The coat protein gene was sequenced, and 97% aminoacids identity was observed with Bidens mosaic virus - BiMV (GenBank accession number AY960151). Differently of others previously BiMV isolates described, this isolate from lettuce was not able to infect Bidens pilosa, Helianthus annuus, Nicotiana tabacum TNN and N. glutinosa. The natural occurrence of BiMV infecting lettuce and causing mosaic symptoms similar to LMV, also the susceptibility of many lettuce cultivars to BiMV, could be an alert to the correct diagnosis of the viruses infecting this plant .

Lettuce big vein associated virus (LBVaV) e Mirafiori lettuce big vein virus (MLBVV) têm sido encontrados em infecções mistas no Brasil, causando a doença conhecida como engrossamento das nervuras da alface. Análise de parte do gene da proteína capsidial (CP) de isolados brasileiros de LBVaV coletados em alface, indicou que estes possuem identidade superior a 93% com isolados coletados em diferentes regiões geográficas. A diversidade genética entre a CP de isolados de MLBVV de alface foi maior comparada às sequências da CP de LBVaV, com a identidade de aminoácidos variando entre 91 a 100%. Os isolados brasileiros de MLBVV pertencem ao subgrupo A, com um único sítio de restrição RsaI no gene da proteína capsidial. Não há indicação para uma provável origem geográfica dos isolados brasileiros de MLBVV e LBVaV.

Lettuce big vein associated virus (LBVaV) and Mirafiori lettuce big vein virus (MLBVV) have been found in mixed infection in Brazil causing the lettuce big vein disease. Analysis of part of the coat protein (CP) gene of Brazilian isolates of LBVaV collected from lettuce, showed at least 93% amino acid sequence identity with other LBVaV isolates. Genetic diversity among MLBVV CP sequences was higher when compared to LBVaV CP sequences, with amino acid sequence identity ranging between 91% to 100%. Brazilian isolates of MLBVV belong to subgroup A, with one RsaI restriction site on the coat protein gene. There is no indication for a possible geografical origin for the Brazilian isolates of LBVaV and MLBVV.

A presença de sintomas de 'big vein' ou engrossamento das nervuras em alface e a associação do Lettuce big-vein associated virus (LBVaV) e Mirafiori lettuce big-vein virus (MLBVV) foram verificadas por RT-PCR utilizando-se oligonucleotídeos específicos para ambos os vírus. Foram coletadas 366 plantas sintomáticas nas regiões de Bauru, Campinas e Mogi das Cruzes no estado de São Paulo nos meses de junho e setembro de 2004 e abril e julho de 2005, e 18 plantas assintomáticas na região de Mogi das Cruzes no mês de dezembro de 2004. Infecção mista do LBVaV e MLBVV foi detectada em 76,2% das plantas sintomáticas, em 11,5% somente o MLBVV foi detectado e em 6,6% somente o LBVaV. Nas plantas assintomáticas coletadas em dezembro na região de Mogi das Cruzes, em áreas de alta incidência da doença durante o inverno, foi detectada a presença de MLBVV em 9 amostras e LBVaV em 7 amostras. Quatro dessas amostras apresentaram infecção mista, indicando que o desenvolvimento de sintomas depende de fatores abióticos, como temperatura. A inoculação via extrato vegetal a partir de plantas de alface com infecção mista pelo MLBVV e LBVaV foi realizada a 16°C/ 10°C (dia/noite) e fotoperíodo de 11 horas, verificando-se que o MLBVV foi transmitido para Nicotiana tabacum TNN, N. rustica, N. occidentalis, Chenopodium quinoa e para as cultivares de alface Trocadero e White Boston, enquanto o LBVaV foi transmitido apenas para a alface White Boston. Entretanto, nenhuma destas plantas apresentou sintomas da doença, com exceção de C. quinoa que apresentou sintomas de lesões locais. Plantio em solo proveniente de áreas com histórico da doença de Mogi das Cruzes permitiu a transmissão do LBVaV para alface cv. White Boston e do MLBVV para alface cv. Trocadero e White Boston, embora apenas a cv. White Boston tenha apresentado sintomas da doença. Em conjunto, estes resultados demonstram a dificuldade de transmissão de ambos os vírus, mesmo em condições de laboratório.

The occurrence of big vein disease symptoms and the association of Lettuce big-vein associated virus (LBVaV) and Mirafiori lettuce big-vein virus (MLBVV) was evaluated by RT-PCR using specific primers for both viruses. A total of 366 symptomatic plants were collected during June and September 2004 and during April and July 2005 at Bauru, Campinas and Mogi das Cruzes in São Paulo state, and 18 symptomless plants were collected in Mogi das Cruzes on December 2004. Mixed infection was detected in 76,2% of the symptomatic plants, 11,5% had only MLBVV and 6,6% had only LBVaV. In the symptomless plants collected in areas with high incidence of the disease throughout the winter, MLBVV was found in 9 plants and LBVaV in 7 plants. Four plants had both viruses, indicating that symptom development depends on abiotic factors, such as temperature. Plants with MLBVV and LBVaV (mixed infection) were used as source of virus in a host range assay at 16C/ 10°C (day/ night) and 11h light period. MLBVV was transmitted to Nicotiana tabacum TNN, N. rustica, N. occidentalis, Chenopodium quinoa and lettuce cv. Trocadero and White Boston, while LBVaV was transmitted only to lettuce cv. White Boston. No symptons could be verified for these plants with the exception of C. quinoa that showed local lesions. Transmission through soil in areas with high incidence of the disease was observed for LBVaV to lettuce cv. White Boston and MLBVV for lettuce cv. Trocadero and White Boston, but only cv. White Boston showed symptoms. Together, these results demonstrate the difficulties in transmitting both viruses, even under controlled laboratory conditions.