O objetivo do trabalho foi estudar a organogênese in vitro de C. lanatus, pela indução de gemas adventícias, em segmentos de cotilédones, cultivados em meio de cultura suplementado com citocinina. Os explantes consistiram de segmentos das regiões distal e proximal de cotilédones, coletados de plantas germinadas in vitro com um, três e cinco dias de idade. Os dados obtidos mostram que a organogênese de melancia, in vitro, ocorre com maior eficiência em segmentos da região proximal dos cotilédones, coletados de plântulas com três dias de idade e cultivados em meio de cultura MS, suplementado com a combinação BAP (1 mg L-1) e água de coco (10%). Pelo estudo histológico, verificou-se que a organogênese ocorre diretamente, sem a formação de calo, na epiderme e subepiderme do explante. As gemas adventícias foram caracterizadas pela presença de meristema apical e primórdios foliares. Observou-se, também, o desenvolvimento de protuberâncias que não se desenvolvem em gemas adventícias.

The objective of this work was to study the in vitro organogenesis of Citrullus lanatus, by the induction of adventitious buds in cotyledon segments cultured in medium supplemented with cytokinin. Explants were collected from one, three and five-day-old in vitro germinated seedlings, considering the distal and proximal cotyledon regions. The data obtained showed that in vitro organogenesis of watermelon occurred with higher efficiency, when cotyledon segments from the proximal region collected from three-day-old seedlings were cultivated in medium MS, supplemented with BAP (1 mg L-1) and coconut water (10%). The histological study showed that the organogenesis occurs directly, without callus formation, on epidermal and subepidermal layers of the explants. Adventitious shoots were characterized by the development of shoot apical meristem and leaf primordia. The formation of protuberances, that do not develop into adventitious buds, was also observed.

As decisões envolvidas na iniciação do processo de florescimento dependem da expressão equilibrada de uma rede complexa de genes, que é regulada por fatores endógenos e ambientais. A regulação correta da transição para o florescimento é crucial para o sucesso reprodutivo das plantas; dessa forma elas desenvolveram mecanismos moleculares conservados para integrar tanto indícios ambientais como endógenos para regular precisamente o tempo do florescimento. Avanços recentes na biologia molecular vegetal, incluindo o seqüenciamento completo de genomas, tornaram possível a comparação detalhada de genomas vegetais. Assim, estudos comparativos de genômica funcional estão emergindo como ferramentas poderosas para a identificação de genes envolvidos no regulamento das vias metabólicas relacionadas ao florescimento. Neste artigo são apresentados resultados da busca no banco de dados do Projeto FORESTS (Eucalyptus Genome Sequencing Project Consortium) para a obtenção de etiquetas de seqüências expressas (ESTs) mostrando homologia com elementos-chave das vias reguladoras do florescimento. Os 33.080 ¨clusters¨ de ESTs de Eucalyptus spp. disponíveis no banco de dados do FORESTS foram analisados, e identificaram-se elementos conservados, possivelmente envolvidos nas vias controladoras do florescimento, quer sejam as autônomas, quer as controladas por vernalização, por ácido giberélico ou por fotoperíodo. Adicionalmente, foram caracterizados in silico dez possíveis membros da família CONSTANS de fatores de transcrição de Arabidopsis, em Eucalyptus.

Flowering initiation depends on the balanced expression of a complex network of genes that is regulated by both endogenous and environmental factors. The timing of the initiation of flowering is crucial for the reproductive success of plants; therefore, they have developed conserved molecular mechanisms to integrate both environmental and endogenous cues to regulate flowering time precisely. Extensive advances in plant biology are possible now that the complete genome sequences of flowering plants is available and plant genomes can be comprehensively compared. Thus, association studies are emerging as powerful tools for the functional identification of genes involved on the regulation of flowering pathways. In this paper we report the results of our search in the Eucalyptus Genome Sequencing Project Consortium (FORESTS) database for expressed sequence tags (ESTs) showing sequence homology with known elements of flowering-time pathways. We have searched the 33,080 sequence clusters in the FORESTS database and identified Eucalyptus sequences that codify putative conserved elements of the autonomous, vernalization-, photoperiod response- and gibberellic acid-controlled flowering-time pathways. Additionally, we have characterized in silico ten putative members of the Eucalyptus homologs to the Arabidopsis CONSTANS family of transcription factors.

In angiosperms, flower formation is controlled by meristem identity genes, one of which, FLORICAULA (FLO)/LEAFY (LFY), plays a central role. It is not known if the formation of reproductive organs of pre-angiosperm species is similarly regulated. Here, we report the cloning of a conifer (Pinus caribaea var. caribaea) FLO/LFY homolog, named PcLFY. This gene has a large C-terminal region of high similarity to angiosperm FLO/LFY orthologs and shorter regions of local similarity. In contrast to angiosperms, conifers have two divergent genes resembling LFY. Gymnosperm FLO/LFY proteins constitute a separate clade, that can be divided into two divergent groups. Phylogenetic analysis of deduced protein sequences has shown that PcLFY belongs to the LFY-like clade. Northern hybridization analysis has revealed that PcLFY is preferentially expressed in developing female cones but not in developing male cones. This expression pattern was confirmed by in situ hybridization and is consistent with the hypothesis of PcLFY being involved in the determination of the female cone identity. Additionally, mutant complementation experiments have shown that the expression of the PcLFY coding region, driven by the Arabidopsis LFY promoter, can confer the wild-type phenotype to lfy-26 transgenic mutants, suggesting that both gymnosperm and angiosperm LFY homologs share the same biological role.

O gene EgLFY, clonado de Eucalyptus grandis, possui homologia de seqüência com o gene de identidade meristemática LEAFY (LFY) de Arabidopsis e FLORICAULA (FLO) de Antirrhinum. EgLFY é, preferencialmente, expresso nos órgãos florais em desenvolvimento de eucalipto, obedecendo a um padrão similar ao descrito para o gene LFY de Arabidopsis. Experimentos de hibridização in situ mostraram que o gene EgLFY é fortemente expresso em meristemas florais no início de seu desenvolvimento e, então, sucessivamente, durante a formação dos primórdios de sépalas, pétalas, estames e carpelos. Há expressão também nos primórdios foliares de árvores adultas. A expressão da região codificadora de EgLFY sob o controle do promotor do LFY de Arabidopsis pôde complementar mutantes lfy nulos em plantas de Arabidopsis transgênicas. Essas observações sugerem que o gene EgLFY possui um papel similar ao de LFY no desenvolvimento floral e que os mecanismos básicos envolvidos na iniciação e no desenvolvimento floral em Eucalyptus podem ser semelhantes aos de Arabidopsis.

The EgLFY gene cloned from Eucalyptus grandis has sequence homology to the floral meristem identity gene LEAFY (LFY) from Arabidopsis and FLORICAULA (FLO) from Antirrhinum. EgLFY is preferentially expressed in the developing eucalypt floral organs in a pattern similar to that described previously for the Arabidopsis LFY. In situ hybridization experiments have shown that EgLFY is strongly expressed in the early floral meristem and then successively in the primordia of sepals, petals, stamens and carpels. It is also expressed in the leaf primordia of adult trees. The expression of the EgLFY coding region under control of the Arabidopsis LFY promoter could complement strong lfy mutations in transgenic Arabidopsis plants. These data suggest that EgLFY plays a similar role to LFY in flower development and that the basic mechanisms involved in flower initiation and development in Eucalyptus may be similar to those occurring in Arabidopsis.

O objetivo deste trabalho foi avaliar as características morfológicas de três híbridos somáticos de citros, comparando-as com as de seus respectivos parentais. Folhas jovens dos híbridos somáticos e seus respectivos parentais foram coletadas e preparadas para observações em microscópio eletrônico de varredura. Híbridos poliplóides de citros apresentam menor número de estômatos por área, com maior tamanho individual quando comparados com aqueles das plantas diplóides parentais. Não foram observadas diferenças no arranjo interno das células estomáticas entre as plantas parentais e os híbridos somáticos. Investigações adicionais poderão determinar se essas diferenças poderão influenciar o comportamento fisiológico dessas plantas no campo.

The objective of this work was to evaluate leaf epidermis morphological characteristics of three citrus somatic hybrids, compared to their parents. Parental and somatic hybrid young leaves were collected and processed for scanning electron microscope observations. Citrus polyploid hybrids have fewer stomata per area and these are larger compared to their diploid parental parents. No differences in internal arrangement of the stomatal cells were detected between parental plants and somatic hybrids. Additional studies may determine if these differences will influence physiological behavior of the plants in the field.

A transformação genética permite produzir cultivares com características específicas e pode, dessa forma ser associada a programas de melhoramento de citros. O objetivo deste trabalho foi estabelecer protocolos de transformação genética para as laranjas doce 'Valência' e 'Natal' (Citrus sinensis L. Osbeck), bem como para o limão 'Cravo'(Citrus limonia L. Osbeck). Segmentos de epicótilo de plântulas germinadas in vitro (três semanas no escuro e duas semanas sob fotoperíodo de 16h) foram utilizados como explantes. Estes foram co-cultivados com Agrobacterium tumefaciens (EHA-105), realizando-se vários experimentos para avaliar a eficiência do processo de transformação genética: explantes co-cultivados por um, três e cinco dias; tempo de inoculação com a bactéria de 5, 10, 20 e 40 minutos; co-cultivo em meio de cultura contendo 0, 100 e 200 mimol L-1 de acetoseringona; Incisão longitudinal (2-3 mm) nas extremidades do explante; temperatura de co-cultivo 19, 23 e 27°C. Todos os experimentos consistiram de cinco repetições por tratamento, sendo cada repetição representada por uma placa de Petri contendo 30 explantes, perfazendo um total de 150 explantes por tratamento. Plântulas transgênicas dos três cultivares foram obtidas utilizando-se tempo de inoculação de 20 minutos, co-cultivo com Agrobacterium tumefaciens (EHA-105) por três dias, na ausência de acetoseringona no meio de cultura de co-cultivo e temperatura de co-cultivo de 23-27°C. A incisão longitudinal na extremidade do explante favoreceu à organogênese in vitro, mas quando co-cultivado com Agrobacterium não houve regeneração de brotações.

Genetic transformation allows the release of improved cultivars with desirable characteristics in a shorter period of time and therefore may be useful in citrus breeding programs. The objective of this research was to establish a protocol for genetic transformation of Valencia and Natal sweet oranges (Citrus sinensis L. Osbeck) and Rangpur lime (Citrus limonia L. Osbeck). Epicotyl segments of germinated in vitro plantlets (three weeks in darkness and two weeks in a 16-h photoperiod) were used as explants. These were co-cultivated with Agrobacterium tumefaciens strain EHA-105 and different experiments were done to evaluate the transformation efficiency: explants were co-cultivated with Agrobacterium for one, three or five days; explants were incubated with Agrobacterium suspension for 5, 10, 20 or 40 minutes; co-cultivation medium was supplemented with acetosyringone at 0, 100 or 200 µmol L-1; Explants ends had a longitudinal terminal incision (2-3 mm); co-cultivation temperatures of 19, 23 or 27°C were imposed. The experimental design was completely randomized in all experiments with five replications, each consisted of a Petri dish (100 x 15 mm) with 30 explants and resulted in a total of 150 explants per treatment. Longitudinal terminal incision in the explant ends did not improve shoot regeneration. However, transgenic plants of all three cultivars were confirmed from explants that had been subjected to inoculation time of 20 minutes, co-culture of three days at 23-27°C, in the absence of acetosyringone.

Com o desenvolvimento de novas técnicas biotecnológicas, é possível a introdução no genoma vegetal de genes de outras plantas ou outros organismos pela transformação genética. Entretanto, um dos principais requisitos para o sucesso desta técnica é a existência de uma metodologia eficiente de regeneração de plantas in vitro. O objetivo deste trabalho foi definir protocolos de regeneração de plantas, via organogênese, para laranjas 'Natal', 'Valência' e 'Hamlin' (Citrus sinensis L. Osbeck), e limão 'Cravo' (Citrus limonia L. Osbeck), para obtenção de plantas transgênicas nestas variedades. Sementes sem tegumentos foram germinadas in vitro durante três semanas no escuro e uma semana sob fotoperíodo de 16 h (40 µmol m-2 s-1), a 27 ± 2°C. Para indução das brotações, segmentos de epicótilo foram cultivados no meio de cultura MT (25 g L-1 de sacarose) suplementado com diferentes concentrações de benzilaminopurina (BAP). Para enraizamento, utilizou-se meio MT, com ou sem a adição de NAA ou IBA (1,0 mg L-1). A combinação 1,0 mg L-1 BAP, utilizada na fase de indução de brotações e 1,0 mg L-1 IBA, utilizada na fase de enraizamento, permitiu regeneração de plantas com bom índice de enraizamento nas três variedades de laranjas. A utilização de 0,5-2,5 mg L-1 BAP na fase de indução de brotações, com 1,0 mg L-1 IBA na fase de enraizamento, assegurou regeneração de plantas com alto índice de enraizamento para o limão 'Cravo'. Os protocolos de organogênese desenvolvidos neste trabalho podem ser utilizados em experimentos de transformação genética envolvendo essas variedades.

Exogenous genes can be introduced in plants by genetic transformation techniques. However, an efficient tissue culture system with high rates of plant recovery is necessary for gene introduction. This work aimed to define organogenesis and plant regeneration protocols for sweet orange varieties Natal, Valencia and Hamlin (Citrus sinensis L. Osbeck) and Rangpur lime (Citrus limonia L. Osbeck) which can be used in plant transformation experiments. Seeds of which teguments were removed, were germinated in vitro and maintained in the dark for three weeks, followed by one week at 16-h photoperiod (40 µmol m-2 s-1) and 27 ± 2°C. Organogenesis induction was done by introducing epicotyl segments in MT medium with 25 g L-1 sucrose and different BAP concentrations. After adventitious bud growth, the shoots were transferred to MT medium with either NAA or IBA (1 mg L-1), or absence of auxin, for rooting. The best results were obtained with 1 mg L-1 BAP for bud induction and 1 mg L-1 IBA for rooting for all three sweet orange cultivars. The use of 0.5-2.5 mg L-1 BAP, followed by 1 mg L-1 IBA were the best growth regulator combinations for bud induction and rooting, respectively, for 'Rangpur' lime. The protocols presented in this work are suitable for associations with genetic transformation experiments for these cultivars.

O presente trabalho analisa o comportamento de explantes de bananeira `Nanicão' (Musa spp. Grupo AAA) a tratamentos de indução com diferentes auxinas, visando à obtenção de embriogênese somática. Segmentos longitudinais de ápices meristemáticos caulinares de plântulas de bananeira micropropagadas e enraizadas in vitro foram introduzidos em meio de cultura contendo dicamba, picloram, 2,4-D ou NAA. Amostras dos explantes aos 0, 7 e 10 dias foram coletadas e preparadas para microscopia óptica. Cortes histológicos foram realizados nesses explantes, comparando-se as alterações observadas após os tratamentos com diferentes auxinas. Respostas embriogênicas foram observadas somente nos tratamentos com picloram e dicamba, sendo possível a observação visual de regiões embriogênicas aos 14 e 21 dias de cultivo, respectivamente. Cortes histológicos de regiões embriogênicas dos explantes, aos 26 dias, revelaram a formação de regiões meristemáticas compostas aparentemente por múltiplos meristemas radiculares e embriões nas fases iniciais do estágio globular. Cortes histológicos de estruturas morfologicamente semelhantes a embriões zigóticos de Musa balbisiana revelaram ausência dos meristemas apicais e não diferenciação procambial. Os resultados indicam a indução de embriões somáticos não-funcionais e, consequentemente, a necessidade de maiores estudos visando otimizar o processo de desenvolvimento e maturação dos embriões somáticos.

The present work analyzes the behavior of banana explants, cv. Nanicão (Musa spp. Group AAA) regarding somatic embryogenesis induction treatments with several auxins. Longitudinal segments of shoot meristematic apices of micropropagated banana plantlets cultivated and rooted in vitro were introduced in culture medium containing dicamba, picloram, 2,4-D or NAA in different concentrations. Explant samples were collected at 0, 7 and 10 days and prepared for light microscopy. Histological sections were used for comparison of the histological changes occurring after induction treatment with different auxins. Embryogenic response was observed only in treatments with picloram or dicamba, with distinct embryogenic regions observed at 14 and 21 days in culture, respectively. Histological sections of embryogenic regions of the explant at 26 days in culture revealed the formation of meristematic regions, structures with multiple root meristems, and somatic embryos at early globular stages. Embryo-like structures morphologically similar to Musa balbisiana zygotic embryos were sectioned and showed a lack of apical meristems and absence of procambial differentiation. These results indicate the induction of non-functional somatic embryos and the need for more studies on developmental aspects and maturation treatments for optimization of the process.

A embriogênese somática pode ser uma alternativa para o melhoramento de espécies vegetais, quando associada à transformação genética. A regeneração de plântulas a partir de embriões somáticos é dependente de vários fatores, entre eles, a qualidade do embrião somático. Neste trabalho embriões somáticos com diferentes características morfológicas são descritos. Embriogênese somática de bananeira, cv. Grand Nain e Nanicão Jangada foi induzida a partir de inflorescências funcionalmente masculinas, em meio de indução (MI) seguido de subcultivo em meio de germinação (MG), em ausência de luz. A presença de luz na indução, não favoreceu a resposta embriogênica. Em ausência de luz, os explantes da cv. Nanicão Jangada, durante os seis meses de cultivo, sofreram diversas alterações, como a formação de calos embriogênicos e não embriogênicos, formação de embriões somáticos, continuidade no desenvolvimento do botão floral ou oxidação do explante. A freqüência de resposta embriogênica foi baixa, com apenas 6% dos explantes formando embriões somáticos e 23% com formação de calos embriogênicos. O acompanhamento histológico e morfológico das alterações ocorridas nos explantes permitiu a identificação de embriões somáticos com características morfológicas distintas: com maior freqüência observou-se um tipo de embrião com morfologia semelhante ao embrião zigótico de Musa acuminata; em menor freqüência desenvolveram-se embriões somáticos semelhantes a embriões zigóticos de outras monocotiledôneas, indicando que em um único protocolo de embriogênese somática, é possível ocorrer a formação de diferentes padrões morfológicos de embriões somáticos.

Somatic embryogenesis is an alternative for genetic breeding of plant species when associated to genetic transformation techniques. Regeneration of plantlets from somatic embryos relies on somatic embryo quality, among other factors. In this work, banana somatic embryos with different morphological characteristics are described. Banana somatic embryogenesis was obtained from functional male inflorescences in induction medium (MI) followed by subculture to germination medium MG, in the absence of light. Induction under a 16-h photoperiod did not favor the embryogenic formation. In absence of light, inflorescence explants of the cultivar Nanicão Jangada responded by several morphogenic responses. Induction of embryogenic and non-embryogenic callus, development of somatic embryos, continuity of the flower bud development or oxidation of the explants were observed in the cultures. The frequency of embryogenic response was low, with only 6% of the explants forming somatic embryos, while 23% showed the formation of embryogenic callus. Histological and morphological studies presented the formation of two types of somatic embryos: one resembling the zygotic embryo of Musa acuminata, and the other type showing more similarity to the zygotic embryo of other monocotyledonous species, indicating that in one somatic embryogenic protocol different morphological patterns can be observed. In addition to the formation of somatic embryos, continuity in the development of floral buds was frequently observed.

A regeneração in vitro de plantas de Passiflora suberosa foi obtida a partir de discos foliares. Folhas foram retiradas de plantas germinadas em casa de vegetação, imersas em solução comercial de hipoclorito de sódio (3:1), durante 20 minutos. Discos foliares de 0,5 cm de diâmetro, com a face adaxial em contato com o meio de cultura, foram introduzidos em placa de petri. Organogênese foi obtida utilizando-se meio MS acrescido de 0,5 ou 1,0 mg L-1 de BAP (6-benzilaminopurina). Após 4 a 8 semanas, observou-se formação de calos nas bordas dos discos foliares. Os calos formados foram transferidos para meio MSM, acrescido de 1,0 mg L-1 de GA3 (ácido giberélico), sob fotoperíodo de 16 horas. Desenvolvimento de gemas adventícias foi obtido a partir dos calos, sendo estas alongadas e enraizadas no mesmo meio de cultura, após periódicas repicagens, e aclimatadas em casa de vegetação.

In vitro regeneration of plantlets was obtained from Passiflora suberosa leaf discs. Leaves from plants germinated in the greenhouse were collected and immersed in commercial sodium hypochlorite solution (3:1), during 20 minutes. Leaf discs (0.5 cm in diameter) were obtained and placed with the adaxial side in contact with the culture medium in petri dishes. Organogenesis was obtained when MS medium was supplemented with 0.5 or 1.0 mg L-1 BAP (6-benzylaminopurine), after four to eight weeks, callus proliferated from the edge of the discs. After induction, calli were transferred to modified MS media supplemented with1.0 mg L-1 GA3, under 16-hour photoperiod. Development of adventitious shoots was obtained from the callus tissues and the shoots were elongated and rooted in the same culture medium and acclimatized in the greenhouse.