Abstract The mutations of pncA gene encoding pyrazinamidase/PZase in Mycobacterium tuberculosis are often associated with pyrazinamide/PZA resistance. The H and R1 isolates showed significant phenotypic differences to PZA. The H isolate was PZA sensitive, but R1 was PZA resistant up to 100 ug/ml. The paper reports the pncA profile for both isolates and the activity of their protein expressed in Escherichia coli BL21(DE3). The 0.6 kb of each pncA genes have been subcloned successfully into the 5.4 kb pET30a vector and formed the pET30a-pncA recombinant with a size of 6.0 kb. The pncAR1 profile exhibited base mutations, but not for pncAH against to pncA from the PZA-sensitive M. tuberculosis H37RV published in Genbank ID: 888260. Three mutations were found in pncAR1, ie T41C, G419A, and A535G that subsequently changed amino acids of Cys14Arg, Arg140His and Ser179Gly in its protein level. The mutant PZase R1 that expressed as a 21 kDa protein in E. coli Bl21(DE3) lost 32% of its performance in activating PZA drug to pyrazinoic acid/POA compared to the wild-type PZase H. The mutation in the pncAR1 gene that followed by the decreasing of its PZase activity underlies the emergence of pyrazinamide resistance in the clinical isolate. Structural studies for the R1 mutant PZase protein should be further developed to reveal more precise drug resistance mechanisms and design more effective TB drugs. pyrazinamidasePZase pyrazinamidase pyrazinamidePZA R sensitive 10 ugml ug ml ug/ml BL21DE3. BL21DE3 BLDE BL21 DE3 . BL DE BL21(DE3) 06 0 6 0. 54 5 4 5. pETa pET pET30apncA pETapncA 60 6. pncAR PZAsensitive M HRV RV ID 888260 T41C TC T C G419A GA G A AG Cys14Arg CysArg Cys Arg ArgHis His SerGly Ser Gly level 2 E Bl21DE3 BlDE Bl21 Bl Bl21(DE3 32 acidPOA acid POA wildtype wild type drugs 1 BL21DE BL2 BL21(DE3 apncA 88826 Bl21DE Bl2 Bl21(DE 3 BL21(DE 8882 888 88 8
Resumo As mutações do gene pncA que codifica a pirazinamidase (PZase) no Mycobacterium tuberculosis estão frequentemente associadas à resistência à pirazinamida (PZA). Os isolados H e R1 apresentaram diferenças fenotípicas significativas em relação à PZA. O isolado H foi sensível à PZA, mas o R1 foi resistente à PZA até 100 ug/ml. O artigo relata o perfil pncA para ambos os isolados e a atividade de sua proteína expressa em Escherichia coli BL21 (DE3). Em cada gene pncA, 0,6 kb foi subclonado com sucesso no vetor pET30a de 5,4 kb, formando o recombinante pET30a-pncA com tamanho de 6,0 kb. O perfil pncAR1 exibiu mutações de base, mas não para pncAH contra pncA do M. tuberculosis H37RV sensível à PZA publicado no Genbank ID: 888260. Três mutações foram encontradas em pncAR1: T41C, G419A e A535G, que posteriormente alteraram aminoácidos de Cys14Arg, Arg140His e Ser179Gly em seu nível proteico. O mutante PZase R1, que se expressa como uma proteína de 21 kDa em E. coli Bl21 (DE3), perdeu 32% de seu desempenho na ativação do medicamento PZA para ácido pirazinoico (POA) em comparação com a PZase H de tipo selvagem. A mutação no gene pncAR1, seguida pela diminuição de sua atividade PZase, está subjacente ao surgimento de resistência à pirazinamida no isolado clínico. Mais estudos estruturais para a proteína PZase mutante R1 devem ser desenvolvidos com o objetivo de revelar mecanismos de resistência aos medicamentos mais precisos e projetar medicamentos mais eficazes para a TB. (PZase . (PZA) R 10 ugml ug ml ug/ml BL BL2 DE3. DE3 DE (DE3) 06 0 6 0, pETa pET 54 5 4 5, pET30apncA pETapncA 60 6, pncAR base M HRV RV ID 888260 T41C TC T C GA G A535G AG Cys14Arg CysArg Cys Arg ArgHis His SerGly Ser Gly proteico 2 E Bl Bl2 DE3, , 32 POA (POA selvagem clínico TB (PZA 1 (DE3 apncA 88826 3 (DE 8882 888 88 8