Abstract Intracytoplasmic Sperm Injection (ICSI) has increased usage in cases of stallion fertility issues, particularly for older stallions, those with reduced sperm numbers or quality, or stallions that have passed away, and only a limited amount of frozen semen is available. By manipulating the frozen semen through thawing, diluting, and refreezing or by cutting the straw under liquid nitrogen, the supply of semen for ICSI can be extended. While ICSI requires a minimal number of spermatozoa per procedure, it is important to consider sperm quality as a crucial factor affecting fertilization and embryo development. Although it is possible to produce healthy embryos and offspring from low quality sperm samples, it is preferable to process and select morphologically and functionally superior sperm to maximize the chances of successful fertilization and embryo development. Several techniques are available for selecting the spermatozoa for ICSI, such as swim-up, washing, density gradient centrifugation, microfluidic sorting, and some combinations. In this review, we will focus on semen type, handling, recent breakthroughs, stallion effects on ICSI efficiency and the prospects of this technology within the equine industry. (ICSI issues away thawing diluting nitrogen extended procedure development samples swimup, swimup swim up, up swim-up washing centrifugation sorting combinations review type handling breakthroughs industry

Resumo O objetivo desse estudo foi avaliar a influência de um diluente comercial à base de leite, comparado à um diluente preparado com de gema de ovo na qualidade do sêmen de cão, armazenado em duas diferentes temperaturas (5º C ou 15º C). O ejaculado obtido foi dividido em duas alíquotas de volumes iguais, que foram diluídas com o diluente leite ou o diluente gema de ovo, apresentando uma concentração final de 100x106 espermatozoides/mL. O sêmen diluído foi colocado em caixas de transporte, mantendo temperaturas finais de refrigeração de 5º C e 15º C. A qualidade do sêmen refrigerado foi avaliada após 12, 24 e 36h de armazenamento. O sêmen diluído com o diluente leite resultou em maior motilidade, vigor e integridade de membrana plasmática (p<0,05) dos espermatozoides que o diluído com o diluente gema de ovo. Dentro de cada grupo, não foi encontrada nenhuma influencia da temperatura de armazenamento em relação à qualidade do sêmen. A diferença observada entre os diluentes, pode ter ocorrido devido à formulação padrão do diluente comercial à base de leite, além da presença de glicose em sua composição. Em conclusão, o diluente leite apresentou superior preservação da motilidade, viabilidade e integridade de membrana plasmática do sêmen de cão refrigerado, por até 36h de armazenamento, que o diluente gema de ovo, e a temperatura de armazenamento não interferiu na qualidade seminal, sugerindo que 15º C também pode ser utilizado para a refrigeração do sêmen canino.

Abstract This study aimed to compare the effects a commercial milk-based extender and a self-made egg yolk extender had on the quality of canine semen stored at two different temperatures, 5ºC or 15ºC. The ejaculate obtained was split into two aliquots of equal volume and diluted with the milk or egg yolk extender. The final concentration was 100×106 spermatozoa/mL. Diluted semen was placed in transport containers and maintained at final storage temperatures of 5ºC and 15ºC. The quality of the chilled semen was assessed 12, 24, and 36 hours after storage. Semen diluted with the milk extender had higher motility, vigour, and plasma membrane integrity (p<0.05) of the spermatozoa than that diluted with the egg yolk extender. No difference in the semen quality was observed between the stored temperatures in both the groups. The difference observed between the extenders could be due to the standard formulation of the commercial milk extender and the presence of glucose in the mixture. In conclusion, the milk extender was better than the egg yolk extender at preserving the motility, viability, and membrane integrity of chilled canine semen for up to 36 hours. The storage temperature did not seem to affect the semen quality, suggesting that canine semen can be refrigerated at 15ºC.

Resumo Este trabalho compara a resposta superovulatória de éguas doadoras de embriões das raças Quarto de Milha (QM) e Crioula, utilizando um protocolo com baixa dose de extrato de pituitária equina (EPE). Oito éguas QM e seis éguas Crioulas foram acompanhadas durante 3 ciclos estrais consecutivos, sendo que cada ciclo corresponde a um grupo. Grupo Controle – monitoramento do crescimento folicular até a ovulação; Grupo EPE – monitoramento ultrassonográfico até que os folículos atingissem cerca de 20 mm de diâmetro e, posteriormente, administração de 7 mg de EPE, duas vezes ao dia, até a indução da ovulação com 2500UI de hCG; Grupo Pós-EPE – idem ao grupo controle. Os dados foram submetidos à análise de variância, utilizando o procedimento GLM do pacote estatístico SAS, sendo previamente testadas para normalidade dos resíduos, e as médias comparadas pelo teste de Tukey ao nível de 5%. Nas éguas Crioulas tratadas com EPE houve um aumento no número de ovulações (p=0,0534), com média de 3,33±2,06 quando comparadas aos grupos controle e pós-EPE e às éguas da raça QM (2,00±0,53). O tratamento com EPE na dose preconizada permitiu uma melhor resposta superovulatória e produção embrionária nas éguas Crioulas, quando comparadas com as éguas Quarto de Milha.

Abstract This study compared the superovulatory response of embryos donor mares of Quarter Horse (QH) and Crioula using a protocol with low dose of equine pituitary extract (EPE). Eight QH mares and six Crioula mares were monitored during 3 consecutive estrous cycles, with each cycle corresponds to a group. Control Group - monitoring of follicle growth up to the ovulation; EPE group - when the follicles reached 20 mm in diameter were administered 7 mg EPE twice daily. When the follicles achieved a diameter 35 mm, the ovulation was induced with 2500UI hCG; Post-EPE Group - idem to the control group. Data were analyzed using GLM procedure of the SAS statistical package. The variables were submitted to the Tukey’s test and least square means adjusted for multiple comparisons using the Tukey-Kramer’s test, with significance level of 5%. Values are presented as mean ± SD. In the Crioula mares treated with EPE, there was an increase in the number of ovulations (p =0.0534) with a mean of 3.33 ± 2.06 ovulations when compared to the control and post-EPE groups, and mares QM. (2.00±0.53). Treatment with EPE in the recommended dose allowed better superovulatory response and rate of embryo recovery in Crioula mares when compared to the QM mares

<title>Resumo</title><p>As biotécnicas aplicadas à reprodução animal como inseminação artificial, transferência e produção <italic>in vitro</italic> de embriões, indução e sincronização de cio e congelamento de gametas vêm sendo cada vez mais utilizadas na prática veterinária. No entanto, algumas biotécnicas ainda não alcançaram o seu total aperfeiçoamento técnico na reprodução equina, como a criopreservação de sêmen. Objetivou-se avaliar as características pós-descongelamento (motilidade total, vigor e integridade de membrana plasmática e acrosomal) dos espermatozoides de garanhões da raça Mangalarga Marchador (n=5), empregando-se três diluentes de criopreservação. Após a colheita, o sêmen foi diluído na proporção de 1:1 em meio à base de leite em pó desnatado e centrifugado a 600 G por 10 minutos. Após a centrifugação, o sobrenadante foi desprezado e o <italic>pellet</italic> obtido dividido e ressuspendido com Botucrio, FR5 ou FR6. As amostras foram envasadas em palhetas de 0,5 mL sendo a concentração ajustada para 200x10⁶espermatozoides/mL. As palhetas foram distribuídas em uma plataforma-suporte e estabilizadas a 5 ºC/60 min., em refrigerador comercial. Para o congelamento, as palhetas, posicionadas horizontalmente, foram expostas por 15 minutos ao vapor de nitrogênio líquido, em uma caixa de isopor, a 6 cm acima do nível de nitrogênio líquido. Logo em seguida, as palhetas foram imersas no nitrogênio líquido, acondicionadas em raques e estocadas em botijão criogênico a -196 ºC, para posterior avaliação. Não houve diferença para as variáveis motilidade, vigor e integridade das membranas plasmática e acrossomais quando se utilizaram diluentes que contêm a associação de amidas e glicerol (Botucrio e FR6; P>0,05). As variáveis seminais no diluente contendo apenas glicerol foram inferiores em todas as avaliações (P<0,05). A utilização de crioprotetores como a metilformamida, em associação com concentrações de 1 ou 2% de glicerol é uma alternativa para a criopreservação do sêmen de garanhões da raça Mangalarga Marchador.</p>

<title>Abstract</title><p>The techniques applied to animal reproduction such as artificial insemination, transfer and <italic>in vitro</italic> production of embryos, heat synchronization and induction, and gametes cryopreservation have been more utilized in veterinary practice each day. Nevertheless, some techniques have not achieved their full technical capacity within the equine reproduction field, such as semen cryopreservation. The aim of this study was to evaluate the characteristics of post-thawing semen (total motility, strength, plasmatic and acrosomal membrane integrity) of Mangalarga Marchador breed stallions, using three different extenders (Botucrio, FR5 and FR6). Ejaculates from five stallions were collected and the gel-free semen was diluted in a 1:1 dilution in skim milk extender, and centrifuged at 600 g for 10 minutes. After the centrifugation the supernatant was removed and sperm pellet was divided and re-suspended using three different extenders to a concentration of 200 x 10⁶ cells/mL. The samples were packed into 0.5 mL straws, placed in a stainless steel support and kept inside the refrigerator (5 ºC) for one hour. Subsequently, these straws were kept at a height of 6 cm from liquid nitrogen for 15 minutes in an isotherm box and, after that, plunged into liquid nitrogen (-196 ºC) and stored in a liquid nitrogen holding tank. There were no differences in the parameters evaluated when extenders using mixed amides and glycerol (Botucrio and FR6) were used (P > 0.05). All parameters evaluated were lower for the extender containing only glycerol (P<0.05). The use of cryoprotectants (methylformamide and dimethylformamide) in association with glycerol concentrations around 1 to 2% is an alternative for semen cryopreservation of Mangalarga Marchador breed stallions.</p>

O objetivo foi avaliar o uso da eCG na ressincronização (RS) em vacas Nelore lactantes, conhecer a interação entre dose, presença ou não de cio, presença ou não do corpo lúteo (CL) e taxa de prenhez. Foram utilizadas 775 vacas na 1ª IATF e as vazias (449) foram ressincronizadas após 30 dias. Realizou-se exame ultrassongráfico (US) antes da primeira IATF e no momento da RS para observar a presença ou não do CL. No dia 0 (D0) foi inserido dispositivo intravaginal (DIV) com 1 g de progesterona e aplicação intramuscular (IM) de 2mg de Benzoato de Estradiol. No D8 o DIV foi retirado, aplicado IM 1mg de cipionato de estradiol e 0,53mg de cloprostenol sódico. No D8 o Grupo-0 (G0) não recebeu aplicação de eCG, o G200 recebeu 200 UI e o G300 300 UI. Foi observado cio entre a retirada do DIV e a IATF. Todas as vacas foram inseminadas 48 horas após a retirada do DIV. O US foi realizado 30 dias após a IATF. Os tratamentos não alteraram a ocorrência de prenhez nas que apresentaram cio. Nas vacas que não apresentaram cio, não existe houve diferença na ocorrência de prenhez entre o G200 e o G300, mas sim com o controle. A taxa acumulada de prenhez após 40 dias da estação de monta foi de 77,54%. A taxa acumulada de prenhez em 40 dias viabiliza a RS como uma forma de otimizar o manejo reprodutivo nas fazendas de corte.

The aim was to evaluate the use of eCG in resynchronization (RS) in lactating Nelore cows, understand the interaction between dose, presence or absence of estrus, presence or absence of the corpus luteum (CL) and pregnancy rate. Were used 775 cows in first TAI and that not pregnant (449) were resynchronized 30 days after. Ultrasound (US) to observe the presence or absence of CL was performed before first TAI and when the RS. On day 0 (D0) an intravaginal device (IVD) with 1 g of progesterone and intramuscular (IM) 2 mg estradiol benzoate was administered. On D8 devices were removed and applied IM 1mg estradiol cypionate; 0.53mg of sodium cloprostenol, Group - 0 (G0) didn´t received eCG, G200 received 200 IU and G300 300 IU. Estrus was observed and insemination (AI) performed 48 hours after the removal of the IVD. US was performed 30 days after AI. The treatments didn´t affect the occurrence of pregnancy in estrus. In cows that didn´t show estrus, there´s no difference in the occurrence of pregnancy between the G200 and G300 but with G0. The cumulative pregnancy rate after 40 days of the breeding season was (77.54%). The cumulative pregnancy rate in 40 days enables the RS as a way to optimize reproductive management on beef cattle farms.

Há poucos estudos sobre aspiração folicular transvaginal guiada por ultrassom na medicina equina abordando complicações futuras na fertilidade das éguas aspiradas. Com o objetivo de avaliar o efeito da aspiração folicular na fertilidade das éguas, foram conduzidos dois experimentos. No experimento I, 15 éguas da raça Crioula foram distribuídas em três grupos de acordo com o diâmetro do folículo aspirado durante o estro: 25-29mm (n=4; grupo 1); 30-34mm (n=6; grupo 2); > 35mm (n=5; grupo 3) e grupo controle (n=15; grupo 4). No experimento II, a aspiração folicular foi realizada em 25 éguas durante o diestro quando pelo menos 4 folículos (>5mm) foram observados na ultrassonografia transretal em ambos os ovários. Foram aspirados todos os folículos visíveis, entre 4 e 8 mm. Trinta e uma éguas serviram como controle. No experimento I, a taxa de prenhez no ciclo seguinte a aspiração foi de 75% (grupo 1), 83,3% (grupo 2), 60% (grupo 3), e 73,3% (grupo 4). No experimento II foi de 76% no grupo aspirado e 77,4% no grupo controle (não aspirado). Em ambos os experimentos, as taxas de prenhez foram similares (P>0,05). Os resultados mostram que a taxa de concepção no primeiro ciclo após a aspiração folicular não é afetada pelo procedimento.

There are few studies about transvaginal ultrasound-guided follicle aspiration in equine medicine regarding potential complications to future fertility of aspirated mares. In order to evaluate the effect of follicular aspiration on subsequent fertility in mares, two experiments were conducted. In Experiment I, fifteen Criollo mares were allocated to one of three groups according to the diameter of the aspirated follicle during estrus: 25-29mm (n=4; Group 1); 30-34mm (n=6; Group 2); > 35mm (n=5; Group 3) and control group (n=15; Group 4). In Experiment II, the follicular aspiration was attempted in twenty-five mares during diestrous, when at least four follicles (> 5mm) were seen in the transrectal ultrasonography of both ovaries. All visible follicles, between 4 and 8 mm, were aspirated. Thirty-one mares served as control. In Experiments I and II, the pregnancy rates in the following cycle after aspiration were 75.0% (Group 1), 83.3% (Group 2), 60.0% (Group 3), and 73.3% (Group 4 - Control); and 76.0% in the aspirated diestrous group and 77.4% in the control group (non aspirated), respectively. On both experiments, pregnancy rates were similar (P>0.05) in treated and control mares. The results of this study show that the conception rates of the first estrus period following follicular aspiration are not affected by the procedure.

O índice de prenhez utilizando sêmen criopreservado de garanhões é variável e, além disso, algumas raças apresentam baixa congelabilidade. Foram inseminadas 104 éguas, divididas em dois experimentos, para avaliar a fertilidade do sêmen congelado de garanhões da raça Crioula (n=5), com 5% de dimetilformamida (DMF) ou 5% de glicerol (GLI), como crioprotetores. No Experimento I, as inseminações foram conduzidas pré-ovulação com sêmen fresco e criopreservado com DMF. No Experimento II, as éguas foram inseminadas pós-ovulação com sêmen fresco, DMF e GLI. As inseminações com sêmen congelado foram realizadas no ápice do corno uterino e as éguas do grupo controle foram inseminadas no corpo do útero com sêmen fresco. Para a avaliação dos índices de prenhez dos grupos, utilizou-se um ciclo estral/animal. O diagnóstico de gestação foi realizado por meio de ultrassonografia transretal no 15º dia pós-ovulação. A motilidade média pós-descongelamento foi de 40% e 20%, respectivamente, para o sêmen congelado com DMF e GLI (P<0,05). Todos os garanhões tiveram motilidade superior no pós-descongelamento quando se utilizou a DMF. No Experimento I, o índice de prenhez foi de 12% (5/42) e 62% (20/32), respectivamente, para DMF e sêmen fresco (P<0,0001). No Experimento II, o índice de prenhez foi de 70% (7/10; P<0,05) para o sêmen fresco, 40% para o congelado com DMF (4/10; P<0,05) e 10% com GLI (1/10). A inseminação com sêmen congelado realizada com controle folicular mais frequente apresentou os melhores resultados. A baixa motilidade dos espermatozoides pós-descongelamento foi atribuída ao GLI utilizado no Experimento II. A DMF pode ser utilizada como uma alternativa ao congelamento do sêmen de garanhões da raça Crioula.

Pregnancy rates using stallions's frozen semen are variable; moreover, some breeds present low freezability. One hundred and four (104) mares were inseminated and separeted into two experiments to evaluate fertility of frozen semen's of Criollo stallions (n=5), with 5% of dimethylformamide (DMF) or 5% of glycerol (GLY) as cryoprotectants. In Experiment I, the inseminations were made during pre-ovulation with fresh and frozen semen with DMF. In Experiment II, the mares were inseminated during post-ovulation with fresh semen, DMF and GL. The inseminations with frozen semen were performed deep in the uterine horn ipsilateralis to the dominant follicle. Control mares were inseminated with fresh semen in the uterus. Only one estrus period per mare was used to evaluate the pregnancy rates of the groups. Pregnancy diagnosis through ultrasonography was performed on the 15th day post-ovulation. The mean post-thawing motility was 40% and 20%, respectively, for frozen semen with DMF and GLY (P<0.05). All stallions had higher post-thawing motility when using DMF. In Experiment I, pregnancy rates were 12% (5/42) and 62% (20/32), respectively for DMF and fresh semen (P<0.0001). In Experiment II, pregnancy rates were 40% (4/10), 10% (1/10) and 70% (7/10), respectively for DMF, GLY (P<0.05) and fresh semen (P 0.0001). Insemination with frozen semen performed with more frequent follicular control showed the best results. The low sperm motility after thawing was attributed to the GLY used in experiment II. The DMF can be used alternatively to Criollos Stallion's semen feezing.