ABSTRACT Arboviruses are one of the leading causes of health emergencies due to their morbidity and mortality and the sanitary stress they bring about. Cuba has not been free from risk, and the response first to dengue fever and then to other arboviruses has been and still is a priority for the country's top authorities. Laboratory surveillance of dengue fever was implemented in the 1970s, though its aims and strategies have evolved in keeping with the national and regional epidemiological situation, and the available diagnostic technology. Four stages stand out in the development of dengue laboratory surveillance. The present paper summarizes the strategies developed for laboratory surveillance of dengue fever and other arboviruses in the period 1970-2017. A description is also provided of the role played by Pedro Kourí Tropical Medicine Institute (IPK) as a national reference laboratory.

RESUMEN Los arbovirus constituyen una de las principales causas de emergencia en salud por la morbilidad y mortalidad que producen y el estrés sanitario que conllevan. Cuba no ha estado excenta de riesgo, y el enfrentamiento del dengue inicialmente y de otros arbovirus después, ha sido, y es, una prioridad de las máximas autoridades del país. La vigilancia de laboratorio de dengue se estableció desde inicios de la década del 70 aunque sus objetivos y estrategias han cambiado según la situación epidemiológica nacional y regional y la tecnología de diagnóstico disponible. Se destacan cuatro etapas en su desarrollo. En este trabajo se resumen las estrategias desarrolladas para la vigilancia de laboratorio de dengue y de otros arbovirus en el periodo de 1970 a 2017. Se describe además el papel desempeñado por el Instituto de Medicina Tropical, ¨Pedro Kouri¨ (IPK) como Laboratorio Nacional de Referencia.

Rabies is a neurotropic disease that is often lethal. The early diagnosis of rabies infection is important and requires methods that allow for the isolation of the virus from animals and humans. The present study compared a modified shell vial (MSV) procedure using 24-well tissue culture plates with the mouse inoculation test (MIT), which is considered the gold standard for rabies virus isolation. Thirty brain samples (25 positive and 5 negative by the fluorescent antibody test) obtained from different animal species at the National Institute of Hygiene Rafael Rangel in Caracas, Venezuela, were studied by the MIT and MSV assays. Nine samples (36%) were positive at 24 h, 10 (40%) were positive at 48 h and six (24%) were positive at 72 h by the MSV assay. With the MIT assay, 76% were positive at six days post inoculation and 12% were positive at 12 and 18 days post inoculation. One sample that was negative according to the MSV assay was positive with MIT on the 12th day. The MSV procedure exhibited a sensitivity of 96.2%, a specificity of 100%, a positive predictive value of 100% and a negative predictive value 80%. This procedure allowed for rapid rabies virus detection. MIT can be employed as an alternative method in laboratories without tissue culture facilities.

The objective of the present study is to standardize a real-time based polymerase chain reaction system in order to detect and quantify 7 high risk human papillomavirus in different clinical samples from patients suspected of this type of infection. The validation of a 5´ exonuclease fluorescent probe real-time PCR assay (TaqMan format) for the detection and quantification of the 7 most frequent HR-HPV types (16, 18, 31, 33, 45, and 58) which account for over 87% of cervical carcinomas world-wide was carried out. Simultaneous PCR reactions are required to detect the designated HPV types. Specificity tests for each HPV type and other DNA viruses were performed. Standard external curve constructions were achieved, which allow determining the number of target DNA copies in the previously HPV tested samples. HPV 16 and 18 standard curves were obtained from purified genomic DNA of SiHa and HeLa cell lines, respectively. The pattern curves were constructed on the basis of each of the resulting standard DNA, which showed good linear correlation (r = -0, 99) and low error values. The lower detection limit was 10 copies for both HPV 16 and 18. No cross reactions between HPV types and other DNA viruses were observed. Real-Time Polymerase Chain Reaction system, standardized for 7 HPV types, proved to be a rapid, specific and highly sensitive system for better diagnosis and follow-up of patients with high grade intraepithelial lesions. In addition, this assay will allow the development of coming researches in relation with the prevalence and pathogenesis of human papillomavirus infections in different samples from Cuban patients.

El objetivo de este trabajo fue normalizar e implementar un sistema de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real, para determinar la carga viral de 7 genotipos de papilomavirus humano (PVH) de alto riesgo oncogénico. Se evaluó la especificidad del sistema y se construyeron las curvas estándar para PVH 16 y 18, que se emplearon para la cuantificación de ADN viral en diferentes muestras de pacientes identificados como positivos a PVH, mediante reacción en cadena de la polimerasa (RCP) cualitativa y secuenciación nucleotídica. Se obtuvieron dos curvas estándar para PVH 16 y 18, a partir del ADN genómico de las líneas celulares SiHa y HeLa, las que mostraron una buena correlación lineal ( r = -0,99) y valores bajos de error. El límite inferior de detección a partir del ADN de las líneas celulares fue de hasta 10 copias para ambos genotipos. No se obtuvo reacción cruzada entre los diferentes tipos de PVH ni con otros virus ADN. La reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RCP-TR) normalizada probó ser un sistema simple, rápido, específico y altamente sensible. Además, permitirá desarrollar investigaciones sobre la prevalencia de infección por PVH en Cuba, con vistas a la aplicación de las vacunas que se encuentran disponibles en el mercado internacional, así como la evaluación de otros candidatos vacunales diseñados en el futuro.

For the first time this paper defines some of the factors involved in the development of dengue hemorrhagic fever during the dengue-3 epidemic in Cuba. The secondary infection is confirmed to be the most important risk factor in that epidemic, after 24 years of the primary infection with dengue-1, in contrast to the infection sequence dengue- 2/dengue-3 that showed no relationship. Tertiary infection was also related to the development of dengue hemorrhagic fever. The neutralizing antibody titers were different for strains of dengue-3 of the same genotype in a panel of sera of late convalescent patients with both clinical epidemic conditions. Viremia was longer in the primary than in secondary infection; the first neutralizing antibodies were not detected during acute phase, while in the secondary infection the neutralizing antibodies were detected after the fifth day, coinciding with the decline of the viremia. In general, neutralizing antibodies reached lower levels in dengue fever patients, compared to those who developed dengue hemorrhagic fever.

AIM: to disseminate the indicators of associated paralytic poliomyelitis found during 44 years in children that received the oral antipoliomyelitis vaccine, which was only administered in massive vaccination campaigns from 1963 to 2006, and to report the risk of vaccine-associated paralytic poliomyelitis as regards different epidemiological aspects. METHODS: a retrospective study was undertaken in 596 cases of acute flaccid paralysis in children admitted in pediatric hospitals, based on virology researches, and on the detection of different epidemiological variables. RESULTS: 120 viral agents were isolated from 113 studied patients. 30 were identified as poliovirus. The clinical and epidemiological data from 596 cases of acute flaccid paralysis allowed to categorize 20 children affected with vaccine-associated paralytic poliomyelitis. All the cases were children under one that were exclusively administered the oral antipoliomyelitis vaccine through the strategy of the massive vaccination campaigns. 19 of them were caused by the first dose. Global risk in children vaccinated with the first dose from 1963-2006 was of one in 379 888 (7 217 866 doses administered/19 cases with vaccine-associated paralytic poliomyelitis). Cases of vaccine-associated paralytic poliomyelitis have been sporadic or in a group of 8 cases during 1989-1992. The risk of first dose in sporadic cases was of one in 612 864, and in the group of 1 in 84 670. The risk of grouped cases is 7.2 times higher than those occurred in isolated cases. Particularly, in 1992, coinciding with an outbreak of epidemic neuropathy, the risk was of one in 52 140, which represented an increase of 11.8 times compared with sporadic cases. Children aged 4-7 months old also had a higher risk of 1 in 132 812. CONCLUSIONS: there were identified epidemiological aspects that augmented the risk of vaccine-associated paralytic poliomyelitis, in which the aspects of nutritional deficiencies coincided.

OBJETIVO: divulgar los indicadores de poliomielitis paralítica asociada encontrados en 44 años en niños vacunados con oral antipoliomielítica, suministrada exclusivamente en campañas masivas de vacunación durante el período de 1963 a 2006 y reportar el riesgo de poliomielitis paralítica asociada a la vacuna con relación a diferentes aspectos epidemiológicos. MÉTODOS: se realizó un estudio retrospectivo en 596 casos de parálisis fláccida aguda en niños ingresados en hospitales pediátricos, basado en investigaciones virológicas y detección de diferentes variables epidemiológicas. RESULTADOS: de 113 pacientes estudiados se aislaron 120 agentes virales y 30 fueron identificados como poliovirus. Los datos clínicos y epidemiológicos en 596 casos de parálisis fláccida aguda permitieron categorizar a 20 niños afectados con poliomielitis paralítica asociada a la vacuna. Todos los casos se presentaron en niños menores de un año, vacunados con oral antipoliomielítica con estrategias de campañas masivas de vacunación exclusivamente y 19 fueron producidos por la primera dosis. El riesgo global en los niños vacunados con primera dosis de 1963 a 2006 fue 1 en 379 888 (7 217 866 dosis administradas/19 casos con poliomielitis paralítica asociada a la vacuna). Los casos de poliomielitis paralítica asociada a la vacuna se han presentado esporádicos o en un grupo de 8 casos en el período 1989-1992. El riesgo de primera dosis en casos esporádicos fue 1 en 612 864 y en el grupo de 1 en 84 670. El riesgo en casos agrupados es 7,2 veces mayor que los ocurridos en casos aislados. Particularmente en el año 1992, que coincidió con una epidemia de neuropatía epidémica, el riesgo fue de 1 en 52 140, lo que representó un incremento de 11,8 veces a lo ocurrido en casos esporádicos. Los niños de 4-7 meses de edad también tuvieron un riesgo mayor que fue 1 en 132 812. CONCLUSIONES: se identificaron aspectos epidemiológicos que incrementaron el riesgo de poliomielitis paralítica asociada a la vacuna, en los cuales coinciden aspectos de deficiencias nutricionales.

OBJECTIVE: To study the role of secondary infection and of certain viral infection sequences in dengue fever cases during the dengue 3 epidemics occurred in the City of Havana. METHODS: One hundred and forty one laboratory-confirmed clinical samples from dengue 3 cases were studied. According to WHO criteria, all included cases were classified as dengue fever cases; 101 of these samples were collected at the acute phase of the disease whereas 40 were collected in the late convalescence (16 to 18 months after the onset of disease). RESULTS: The late convalescence serum samples allowed identifying the viral dengue infection sequences, which in downward order were DENV-1/DENV-3, DENV-2/DENV-3 and DENV-1/DENV-2/DENV-3. CONCLUSIONS: The results confirmed that the sequence infection DENV-2 / DENV-3 was associated with Dengue Fever Cases but not with the Dengue Hemorrhagic Fever Cases and that a high percentage of studied cases proved to be secondary infection.

OBJETIVO: estudiar el papel de la infección secundaria y de la influencia de determinadas secuencias de infección virales en los casos de fiebre del dengue durante la epidemia de dengue 3, en la ciudad de La Habana, 2001-2002. MÉTODOS: se estudiaron 141 muestras clínicas de casos confirmados de dengue en la epidemia cubana dengue 3. Todos los casos incluidos fueron clasificados de acuerdo con el criterio de la OMS como casos de fiebre del dengue, 101 de estas muestras fueron colectadas en la fase aguda de la enfermedad y 40 colectadas en la fase convaleciente tardía (16-18 meses después de la enfermedad). RESULTADOS: los sueros colectados en la fase convaleciente tardía permitieron conocer las secuencias virales de infección, las cuales en orden descendiente fueron DEN-1/DEN-3, DEN-2/DEN-3 y DEN-1/DEN-2/DEN-3. CONCLUSIONES: los resultados confirman que la secuencia de infección DEN-2/DEN-3 estuvo asociada a los casos de fiebre del dengue y no a los de fiebre hemorrágica del dengue; un porcentaje elevado de los casos estudiados se correspondió con una infección secundaria.

The study of 422 non-01 Vibrio cholerae strains from nine provinces, 9 of them isolated from a water-borne disease outbreak, was performed. All the strains exhibited antimicrobial susceptibility and virulence factors. The nine strains from the outbreak were subjected to a DNA macrorestriction study based on the pulsed field electrophoresis technique. For the first time in Cuba and the Caribbean, the circulation of atypical non-01 V. Cholerae strains (resistent to vibriostatic compound 0129 and trimethoprim/sulfamethoxazole). The behavior of antimicrobial susceptibility evinced for the first time the circulation of two different resistence patterns in Cuba (ampicilline, trimethoprim/sulfamethoxazole, sulfonamide and tetracycline, trimethoprim/sulfamethoxazole, sulfonamide). The frequency of trimethoprim/sulfamethoxazole-resistent strains was similar during the whole period of study. However, resistance to ampicilline decreased whereas resistance to tetracycline increased. The main found virulence factors were gelatinase, hemolysine, elastase and adherence to Hep-2 cells. On the other hand, the outbreak strains showed higher percentages than the others due to the presence of heat-liable toxin and fimbriae. The results of the molecular and epidemiological studies allowed giving a speedy and accurate response that explained the etiology of the first food-borne disease outbreak.

Se estudiaron 422 cepas de Vibrio cholerae no-O1 procedentes de 9 provincias del país, de ellas 9 aisladas de un brote de enfermedad de transmisión hídrica. En la totalidad de las cepas se determinó la susceptibilidad antimicrobiana y la presencia de factores de virulencia. En las 9 cepas procedentes del brote, se realizó además, el estudio de macrorrestricción de ADN mediante la técnica de electroforesis de campo pulsado. Se demostró por primera vez en Cuba y el Caribe, la circulación de cepas de V. cholerae no-O1 atípicas (resistentes al compuesto vibriostático O129 y al trimetoprim-sulfametoxazol). El comportamiento de la susceptibilidad antimicrobiana demostró por primera vez la circulación en Cuba de 2 patrones diferentes de resistencia (ampicilina, trimetoprim/sulfametoxazol, sulfonamida y tetraciclina, trimetoprim/sulfametoxazol, sulfonamida). La frecuencia de cepas resistentes al trimetoprim-sulfametoxazol se mantuvo similar en todo el período de estudio. Sin embargo, se produjo un decrecimiento de la resistencia a la ampicilina y un aumento de la resistencia a la tetraciclina. Los principales factores de virulencia que se encontraron fueron la gelatinasa, la hemolisina, la elastasa y la adherencia a células HEp-2. Sin embargo, las cepas del brote mostraron mayores porcentajes que el resto, para la presencia de la toxina termoestable y la presencia de fimbrias. Los resultados de los estudios molecular y epidemiológico permitieron dar una respuesta acelerada y precisa sobre la etiología del primer brote de enfermedad de transmisión alimentaria.

A case of waterborne otitis in a patient with AIDS was report, who got infected with Vibrio fluvialis by swimming in a pool sea water. This is the first case reported in Cuba and as far as we know in the world. We describe the clinical features associated with this an unusual case and discuss its significance.

Se estudiaron las heces de 397pacientes con enfermedad diarreica aguda, y las de 121 pacientes sin diarrea que conformaron el grupo control , e n el estado de Mérida, Venezuela , entre junio de 1993 y diciembre de 1994. El género Aeromonas fue identificado en los pacientes con enfermedad diarreica aguda en 11,83 % y 5,78 % se identific ó en los pacientes del grupo control. Al estudiar los factores de virulencia descritos para Aeromonas (enterotoxina, citotoxina, hemaglutininas, hidrofobicidad celular y actividad hemolítica) en las cepas aisladas, se detectó que todas poseían al menos uno de los factores investigados asociados a la enteropatogenicidad. De las especies aisladas, Aeromonas caviae result ó ser la que se identific ó con mayor frecuencia. Todos estos resultados sugieren que las especies de Aeromonas son patógenos entéricos potenciales en e sta población.

The different behaviors of antidengue monoclonal antibodies serotype 2 (H3/6, 4G3) and antiprotein recombinant from the dengue virus sheath were described when they faced diverse strains from the serotypes 2 and 4 of this virus (D2 New Guinea C, A15 Cuban strain and A15 propagated 53 times in culture of Beagley dog kidney and D4 H-22412 prototype strain) in an immunoamplification assay dependent of antibodies. Themonoclonal antibodies have prove to be an efficient tool to explain that the neutralizatrion and increase of viral multiplicity may be carried out as separate biological functions. Only the H3/6 monoclonal antibdoy was capable of producing the amplification assay dependent phenomenon against the A15 strain with a significant rise in the viral multiplication. The 4G3 and 4B6 monoclonal antibodies were not capable of immunoamplifying the viral multiplication of the studied strains.

Se describieron los diferentes comportamientos de anticuerpos monoclonales anti-dengue serotipo 2 (H3/6, 4G3) y anti-proteína recombinante de la envoltura del virus dengue cuando fueron enfrentados a diferentes cepas de los serotipos 2 y 4 de este virus (D2 Nueva Guinea C, A15 cepa cubana y A15 propagada 53 veces en cultivo de riñón de perro Beagly y D4 H-2412 cepa prototipo) en un ensayo de inmunoamplificación dependiente de anticuerpos. Los anticuerpos monoclonales han demostrado ser una herramienta eficaz para explicar que la neutralización y el incremento de la multiplicidad viral pueden realizarse como funciones biológicas separadas. Solamente el AcM H3/6 fue capaz de producir el fenómeno amplificación dependiente de anticuerpos frente a la cepa A15 con un incremento significativo en la multiplicación viral. Los AcMs 4G3 y 4B6 no fueron capaces de inmunoamplificar la multiplicación viral de las cepas estudiadas.

Se obtuvo una nueva línea celular diploide de riñón embrionario humano mediante subcultivos seriados (Mag) a partir de un cultivo primario. Se preparó aplicando la técnica de explanto en lugar de la clásica digestión enzimática con tripsina. El proceso de estabilización de la línea diploide luego del “cultivo secundario” se alcanzó entre los pases 6 y 7. Fueron probados 3 medios de cultivo durante el proceso, demostrándose que solo el MEM fue completamente satisfactorio. Las características biológicas de la nueva línea fueron: morfología fibroblástica, medio de cultivo Eagle MEM con 10 % de SBF, split 1:2 a 1:3, cariotipo humano normal, viabilidad poscongelación de 60 %, libre de contaminantes y no tumorigénica. Los subcultivos 11-13 de Mag criopreservados fueron estudiados desde el punto de vista de su utilidad para el diagnóstico de diferentes grupos virales.

An 87 years-old female with a history of heart disease who has been presenting dysnea and fever for 2 months was evaluated. A sputum bacteriological study proved positive for Aeromonas hydrophila in the context of an existing lung cancer. The study was negative for acid fast bacilli.

Se evaluó una paciente de 87 años con antecedentes de cardiopatía que había estado presentando disnea y fiebre durante 2 meses. Un estudio bacteriológico resultó ser positivo a Aeromonas hydrophila en el contexto de un cáncer de pulmón existente. El estudio fue negativo para los bacilos ácidos rápidos.

The neutralization technique by reducing the number of plaques (NRNP) for detecting antirabic antibodies in personnel at risk was used. Serum samples from individuals at high risk and from persons with vaccination antecedents and without them were studied. The neutralization technique was compared with the biological technique in mouses and as a result of the study it was obtained a concordance of 100 %. It was found that sex does not influence on the response of the antibodies to this virus, although the direct contact and the number of times that the individual has received the vaccine act positively on the immune response. The introduction of this technique in the laboratory allows to have a useful tool for the follow-up of the personnel receiving the vaccine before and after being exposed to the rabies virus.

Se empleó la técnica de neutralización por reducción del número de placas (NRNP) para la detección de anticuerpos antirrábicos en personal de riesgo. Se estudiaron muestras de suero de individuos de alto riesgo y personas con antecedentes de vacunación y sin estos. La técnica de neutralización fue comparada con la prueba biológica en ratón y como resultado del estudio se obtuvo una concordancia de 100 %. Se encontró que el sexo no influye en la respuesta de anticuerpos a este virus, aunque el contacto directo y la cantidad de veces que el individuo ha recibido la vacuna actúan positivamente en la respuesta inmune. La introducción de esta técnica en el laboratorio permite contar con una herramienta útil, en el seguimiento del personal que recibe vacunación preexposición y posexposición al virus rábico.

The use of the immunoperoxidase technique for the titration of Dengue virus has eliminated some of the disadvantages of plaque assay in cell culture for titration, which is considered a fastidious method due to the number of factors involved in the plaque formation. The time reduction to obtain results, is the principal advantage of the immunoperoxidase technique reported in the literature, but nothing is said about its precision. Our purpose was to test the immunoperoxidase technique to titrate Dengue 1 virus in our laboratory. The procedure described for this technique was followed, modified by the fixation of infected cells after 5, 7, and 10 days of incubation and by blocking with TSF-Tween 20- SBA 1% during one hour. The working dilution for the positive human sera was 1/500 and for the polyclonal ascitic fluid (AF) against Dengue 1 obtained in mice, 1/100. The useful dilutions for the anti human and anti mouse peroxidase conjugates were 1/100 and 1/200 for the first and 1/500 and 1/1000 for the second. In these conditions, it was possible to evidence the characteristic foci produced by Dengue 1 virus and to quantify it on the 7th and 10th days, but not on the 5th. The Variation Coefficient was < 30%. The 7th day was chosen as optimum to titrate the virus, leading us to titration faster than by the plaque method. Significant differences were not found between the viral titres obtained by both techniques.

La aplicación de la técnica de inmunoperoxidasa para titular virus Dengue ha permitido eliminar algunas de las desventajas que presenta, para este mismo fin, la técnica de formación de placas en cultivos celulares, catalogada como un método fastidioso debido a los múltiples factores que influyen en la formación de las placas. En la literatura consultada se reporta la disminución del tiempo para la obtención de los resultados como la principal ventaja de la primera, pero no datos sobre su precisión. Teniendo esto en cuenta nos propusimos aplicar dicha técnica para titular virus Dengue 1. Se siguió el Procedimiento descrito para realizar la inmunoperoxidasa modificando el tiempo de fijación de las células infectadas de 5, 7 y 10 días y el bloqueo con TSF-Tween 20- SAB 1% durante una hora. La dilución de trabajo para el suero humano utilizado fue de 1/500 y para el líquido ascítico hiperinmune de ratón, contra Dengue 1 fue de 1/100; para los conjugados peroxidasa anti humano y anti ratón empleados, resultaron útiles diluciones de 1/100 y 1/200 para el primero y 1/500 y 1/1000 para el segundo. Se evidenciaron los focos de infección viral, al 7° y 10° días, pero no al 5º. Los títulos virales obtenidos por dos operadores presentaron un Coeficiente de Variación < 30%. Se seleccionó el 7º día para titular el virus, lográndose reducir el tiempo requerido para obtener los resultados con la técnica de placas. No hubo diferencias significativas entre los títulos virales calculados por ambas técnicas.