Abstract Haemonchus contortus is a constraint to sheep production. Seeking to reduce the use of hosts and produce parasitic stages in large-scale, a 42-day in vitro culture protocol of H. contortus third-stage larvae was optimized using Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM). In cell-free culture, larvae were maintained at 39.6°C, in acidic media (pH 6.1) for 3 or 6 days with Δ4-dafachronic acid followed by DMEM pH 7.4 supplemented or not with Fildes’ reagent. In DMEM pH 7.4 at 37°C, supplementation with Caco-2 cells was compared to Fildes. On Day 14, fourth-stage larvae (L4) development rates in acidic media supplemented (86.8-88.4%) or not (74.4-77.8%) with Fildes and in Caco-2 cell co-culture (92.6%) were similar, and superior to DMEM pH 7.4 with Fildes (0.0%). On Day 21, Caco-2 cell co-culture resulted in higher larvae differentiation (25.0%) and lower degeneration (13.9%) compared to acidic media (1.5-8.1% and 48.6-69.9%, respectively). This is the first report of prolonged in vitro culture of H. contortus larvae using commercial media in co-culture with Caco-2 cells. Although no progression to the adult stage, Caco-2 cell co-culture resulted in morphological differentiation of H. contortus L4 and larval viability for up to 28 days. production largescale, largescale large scale, scale large-scale 42day day 42 H thirdstage third stage Dulbeccos Dulbecco s Eagles Eagle DMEM. . (DMEM) cellfree free 396C C 39 39.6°C 6.1 61 1 Δ4dafachronic Δdafachronic Δ4 dafachronic Δ 74 7 4 7. reagent 37C 37 37°C Caco2 Caco 2 Caco- 14 fourthstage fourth L (L4 86.888.4% 868884 86.8 88.4% 86 8 88 (86.8-88.4% 74.477.8% 744778 74.4 77.8% 77 (74.4-77.8% coculture co 92.6% 926 92 (92.6% similar 0.0%. 00 0.0% 0 (0.0%) 21 25.0% 250 25 (25.0% 13.9% 139 13 9 (13.9% 1.58.1% 1581 1.5 8.1% 5 (1.5-8.1 48.669.9%, 486699 48.6 69.9%, 48 69 48.6-69.9% respectively. respectively respectively) (DMEM 6. (L 888 86.888.4 86888 868 86. 884 88.4 (86.8-88.4 477 74.477.8 74477 744 74. 778 77.8 (74.4-77.8 92.6 (92.6 0.0 (0.0% 25.0 (25.0 13.9 (13.9 58 1.58.1 158 15 1. 81 8.1 (1.5-8. 669 48.669.9% 48669 486 48. 699 69.9% 48.6-69.9 86.888. 8688 88. (86.8-88. 47 74.477. 7447 77. (74.4-77. 92. (92. 0. (0.0 25. (25. 13. (13. 1.58. 8. (1.5-8 66 48.669.9 4866 69.9 48.6-69. 86.888 (86.8-88 74.477 (74.4-77 (92 (0. (25 (13 1.58 (1.5- 48.669. 69. 48.6-69 86.88 (86.8-8 74.47 (74.4-7 (9 (0 (2 (1 (1.5 48.669 48.6-6 (86.8- (74.4- ( (1. 48.66 48.6- (86.8 (74.4 (86. (74. (86 (74 (8 (7

Resumo Haemonchus contortus provoca grandes prejuízos à ovinocultura. Visando reduzir a utilização de ovinos hospedeiros e produzir estágios parasitários em larga escala, um protocolo para o cultivo in vitro por 42 dias de larvas de terceiro estádio de H. contortus foi realizado em meio Eagle, modificado por Dulbecco (DMEM). No cultivo sem células, as larvas foram mantidas a 39,6°C e incubadas em DMEM ácido (pH 6,1) por 3 ou 6 dias com 4Δ-ácido dafacrônico seguido por DMEM pH 7,4 suplementado ou não com reagente de Fildes. Em DMEM pH 7,4 a 37°C, a suplementação com células Caco-2 foi comparada à suplementação com Fildes. No Dia 14, as taxas de desenvolvimento até o quarto estádio larvar (L4) foram similares em meio ácido sem células suplementado (86,8-88,4%) ou não (74,4-77,8%) com Fildes e em co-cultura com células Caco-2 (92,6%), e superiores ao desenvolvimento em DMEM pH 7,4 com Fildes (0,0%). No Dia 21, o co-cultivo com células Caco-2 resultou em maior diferenciação (25,0%) e menor degeneração (13,9%) das larvas em comparação ao meio ácido (1,5-8,1% e 48,6-69,9%, respectivamente). Este é o primeiro relato de cultivo in vitro prolongado de H. contortus em meio comercial em co-cultivo com células Caco-2. Apesar da ausência de progressão até o estágio adulto, o co-cultivo com células Caco-2 resultou em diferenciação de L4 e manutenção da viabilidade das larvas de H. contortus por até 28 dias in vitro. ovinocultura escala 4 H Eagle DMEM. . (DMEM) 396C C 39 6,1 61 1 4Δácido Δácido 4Δ Δ 74 7 7, 37C 37 37°C Caco2 Caco 2 Caco- 14 L (L4 86,888,4% 868884 86,8 88,4% 86 8 88 (86,8-88,4% 74,477,8% 744778 74,4 77,8% 77 (74,4-77,8% cocultura co cultura 92,6%, 926 92,6% , 92 (92,6%) 0,0%. 00 0,0% 0 (0,0%) 21 cocultivo 25,0% 250 25 (25,0% 13,9% 139 13 9 (13,9% 1,58,1% 1581 1,5 8,1% 5 (1,5-8,1 48,669,9%, 486699 48,6 69,9%, 48 69 48,6-69,9% respectivamente. respectivamente respectivamente) Caco2. 2. adulto (DMEM 6, (L 888 86,888,4 86888 868 86, 884 88,4 (86,8-88,4 477 74,477,8 74477 744 74, 778 77,8 (74,4-77,8 92,6 (92,6% 0,0 (0,0% 25,0 (25,0 13,9 (13,9 58 1,58,1 158 15 1, 81 8,1 (1,5-8, 669 48,669,9% 48669 486 48, 699 69,9% 48,6-69,9 86,888, 8688 88, (86,8-88, 47 74,477, 7447 77, (74,4-77, 92, (92,6 0, (0,0 25, (25, 13, (13, 1,58, 8, (1,5-8 66 48,669,9 4866 69,9 48,6-69, 86,888 (86,8-88 74,477 (74,4-77 (92, (0, (25 (13 1,58 (1,5- 48,669, 69, 48,6-69 86,88 (86,8-8 74,47 (74,4-7 (92 (0 (2 (1 (1,5 48,669 48,6-6 (86,8- (74,4- (9 ( (1, 48,66 48,6- (86,8 (74,4 (86, (74, (86 (74 (8 (7

Resumo O objetivo deste estudo foi avaliar a soroprevalência e os fatores de risco associados à presença de anticorpos contra Toxoplasma gondii e Neospora caninum em ovinos do Paraná. A detecção dos anticorpos para T. gondii e N. caninum foi realizada, usando-se testes de ELISA indireto caseiro e comercial, respectivamente. A análise de regressão logística múltipla foi usada para verificar os fatores de risco associados à soroprevalência. Anticorpos anti-T. gondii e anti-N. caninum foram observados em 42,7% e em 17,6% dos animais, respectivamente. Os fatores de proteção associados à soropositividade foram “algum nível de confinamento (confinamento ou semiextensivo)” (OR=0,53) para T. gondii e “presença de mão de obra especializada” para N. caminum (OR=0,64). Os fatores de risco foram “presença de gatos” para T. gondii (OR=1,75) e “alimentação de cães com resíduos placentários” (OR=1,79) para N. caninum. Além de apresentar uma significante e simultânea soroprevalência para ambos os agentes (9,9% dos animais), os resultados também indicam que as deficiências em gestão e saneamento ambiental, a presença de reservatórios e os tipos de exploração favorecem a soropositividade. Dessa forma, estudos como estes podem auxiliar em programas sanitários e políticas públicas para a prevenção de T. gondii e N. caninum nos rebanhos ovinos do Paraná.

Abstract The aim of this study was to evaluate the seroprevalence and factors associated with the presence of anti-Toxoplasma gondii and anti-Neospora caninum antibodies in sheep from Paraná state. The detection of antibodies for T. gondii and N. caninum was performed by homemade and commercial indirect ELISA, respectively. Multiple logistic regression analysis was used to verify the factors associated with the seroprevalence. Antibodies anti-T. gondii and anti-N. caninum were observed in 42.7% and in 17.6% of the animals, respectively. The protective factors associated to seropositive were “some level of confinement” (full or semi-extensive confinement) (OR=0.53) for T. gondii and “use of skilled labor” (OR=0.64) for N. caninum. The risk factors were “presence of cats” (OR=1.75) for T. gondii and “feeding of dogs with sheep placental remains” (OR=1.79) for N. caninum. In addition, to presenting a significant and simultaneous seroprevalence for both agents (9.9% of the animals), the results also indicate that deficiencies in management and environmental sanitation, the presence of reservoirs, and types of exploitation enhance the seropositivity. Thus, studies like this might support sanitary programs and public policies for the prevention of T. gondii and N. caninum in the sheep herds of Paraná state.

Resumo Este estudo avaliou o status de resistência de Haemonchus contortus em rebanhos ovinos do estado de São Paulo, Brasil, através de um estudo comparativo entre o teste de redução da contagem de ovos nas fezes (TRCOF) e o teste de desenvolvimento larvar (TDL). Para o TRCOF, 35 ovinos foram selecionados em cada um dos cinco rebanhos e divididos em grupos tratados com: benzimidazol, levamisol, ivermectina, monepantel e controle. Fezes foram coletadas para OPG e coproculturas. O TDL foi realizado com tiabendazol-TBZ, levamisol-LEV, ivermectina aglicona-IVM-A e Zolvix-ZLV. Resistência a todos os fármacos foi detectada por meio do TRCOF em 100% dos rebanhos, exceto para ZLV (40% resistentes e 20% suspeitos de resistência). O LDT indicou resistência ao TBZ e IVM-A em todos os rebanhos; em 80% dos rebanhos ao LEV e 10% ao ZLV. Foi obtida concordância total entre os dois testes para TBZ e IVM (k = 1,0), enquanto para LEV (k = 0,8) e ZLV (k = 0,9) foram obtidas concordância substancial e quase perfeita, respectivamente. A concordância entre os testes foi significante, sendo possível usar o resultado do LDT para prever o do TRCOF, validando-se o primeiro como um teste diagnóstico rápido para criadores de ovinos no Brasil.

Abstract This study evaluated the resistance status of Haemonchus contortus from sheep flocks in the state of São Paulo, Brazil, through comparison between the fecal egg count reduction test (FECRT) and the larval development test (LDT). For the FECRT, 35 sheep were selected in each of five flocks and divided into groups treated with: benzimidazole, levamisole, ivermectin, monepantel and control. Feces were collected for EPG and fecal cultures. The LDT was performed using thiabendazole (TBZ), levamisole (LEV), ivermectin aglycone (IVM-A) and Zolvix (ZLV). Resistance to all drugs was detected using FECRT in 100% of the flocks, except in relation to ZLV (40% resistant and 20% suspected of resistance). LDT indicated resistance to TBZ and IVM-A in all flocks, to LEV in 80% of flocks and to ZLV in 10%. Total agreement was obtained between the two tests for TBZ and IVM (k = 1.0), while for LEV (k = 0.8) and ZLV (k = 0.9), substantial and almost perfect agreement were obtained, respectively. The concordance between the tests was significant, thus showing that it is possible to use the outcome of the LDT to predict the FECRT, and hence validating the former as a fast diagnostic test for use by sheep farmers in Brazil.

Resumo O objetivo desse estudo foi avaliar a ocorrência de anticorpos anti-Toxoplasma gondii e anti-Neospora caninum e seus fatores associados em caprinos de propriedades do Estado do Paraná, Sul do Brasil. A análise sorológica foi realizada, utilizando-se ELISA indireto em 629 amostras de soro caprino, coletadas em 32 propriedades distribuídas em cinco mesorregiões do Estado. A soropositividade foi observada em 30,7% dos animais para T. gondii, 6,3% para N. caninum e 3,0% para ambos. Os modelos finais de regressão múltipla mostraram que o uso de reprodução assistida reduziu a chance de soropositividade para T. gondii (PR=0,70), enquanto a presença no local de abate na fazenda (PR=2,03) aumentou. Para N. caninum, o fornecimento de ração concentrada (OR=4,80) e a morte dos animais no pré-desmame (OR=9,96) aumentaram a chance de soropositividade. O estudo das variáveis associadas às soropositividades sugere deficiências no saneamento e no manejo reprodutivo dos Animais. Além disso, reconhece pontos críticos para a infecção no manejo da produção animal.

Abstract The aim of this study was to determine the occurrence of anti-Toxoplasma gondii and anti-Neospora caninum antibodies and their associated factors among goats in farms from the Paraná state, South Brazil. The serological analysis was performed by indirect ELISA on 629 goat serum samples collected from 32 farms distributed in five mesorregions from the state. Seropositivity was observed in 30.7% of the animals for T. gondii, 6.3% for N. caninum, and 3.0% for both agents. Final multiple regression models showed that the use of assisted reproduction decreased the chance of seropositivity for T. gondii (PR=0.70) and the slaughtering site on the farm (PR=2.03) increased it. To N. caninum, the supplying concentrated feed to animals (OR=4.80) and animal pre-weaning death (OR=9.96) increased the chance of seropositivity. The variables associated with these seropositivities suggest deficiencies in sanitation and reproductive management. In addition, it recognizes critical points of infection for animal production management.

O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial do extrato de acácia (EA) para o controle de T. colubriformis em ovinos. Os cordeiros foram alocados em três grupos de seis animais. Dois grupos foram experimentalmente infectados com larvas infectantes de T. colubriformis, sendo um grupo mantido como controle não infectado. Trinta dias pós-infecção, os animais infectados do grupo tratado foram suplementados com EA. Durante e após o tratamento os valores de contagem de ovos por grama de fezes (OPG), número de larvas de terceiro estágio por grama de fezes (LPG), número de OPG eliminado por animal durante o período de tratamento, viabilidade dos ovos e carga parasitária foram determinados. Os animais do grupo não infectado permaneceram com número de OPG igual a zero durante todo o período experimental. A média do número de OPG total eliminado por grupo, somatória durante os 10 dias de tratamento, foi menor nos cordeiros tratados com EA (P<0,05). Os valores de viabilidade dos ovos de helmintos foram menores (P<0,05) nos dias 4, 7 e 10 pós-tratamento (p.t.). O número de LPG foi menor (P<0,05), nos dias 10 e 14p.t., no grupo tratado. O EA demonstrou potencial para sua utilização no controle de T. colubriformis em ovinos.

The aim of this study was to evaluate the potential uses of acacia extract (AE) on Trichostrongylus colubriformis control in sheep. The lambs were allocated in three groups of six animals. Two groups were experimentally infected with third-stage larvae of T. colubriformis and one was remained as non-infected control. Thirty days post-infection, the infected animals from treated group were supplemented with AE. During and after the treatment, the values of faecal eggs counts (FEC), number of third-stage larvae recovered per gram of faeces (LPG), number of FEC accumulated per animal during the treatment period, nematode egg viability, and worm burden were determined. Animals from non-infected group did not presented FEC values, during the experimental period. The average of total accumulated amount of FEC output per group, during the 10 days of the treatment was lower in AE treated lambs (P<0.05). The values of egg viability were statistically reduced (P<0.05) on days 4, 7 and 10 post treatment (p.t.). The number of LPG was lower (P<0.05), at the days 10 and 14p.t., in treated animals. AE showed potential to be used on the prophylaxis of gastrointestinal nematode infections in sheep.

No presente trabalho determinaram-se a sensibilidade e especificidade das técnicas de imunofluorescência indireta (IFAT) e aglutinação modificada (MAT) para a detecção de anticorpos anti-Toxoplasma gondii, analisando-se soros de 46 suínos experimentalmente infectados. O valor de sensibilidade foi de 95,7% (intervalo de confiança de 95%: 84,0-99,2%), de especificidade foi de 97,8% (intervalo de confiança de 95%: 87,0-99,9%), em ambas as provas. Houve ótima concordância de resultados entre IFAT e MAT evidenciado pelo teste de Kappa = 0,86. Estes resultados validam estas provas para a detecção da infecção toxoplásmica em suínos. IFAT e MAT apesar de possuírem metodologias com características e leituras diferentes apresentaram a mesma acurácia nas amostras analisadas.

The study determined the sensitivity and specificity of the indirect fluorescent antibody test (IFAT) and modified agglutination test (MAT) for anti-Toxoplasma gondii antibody detection by analyzing sera from 46 experimentally infected pigs. Values for sensitivity were 95.7% (confidence interval 95%: 84.0-99.2%) and for specificity 97.8% (confidence interval 95%: 87.0-99.9%) in both tests. There was an optimum agreement of results between IFAT and MAT evidenced by a Kappa test of 0.86. These results validate these tests for the detection of T. gondii infection in pigs. IFAT and MAT despite methodologies with different characteristics and readings have similar accuracy in pig serum samples.