Ensaios foram conduzidos para verificar a presença, o número de cópias e de sítios de integração de pAN7-1 no genoma de mutantes de M. grisea I-22 com patogenicidade alterada em arroz. Foram analisados T41, T93, T251 (gerados por mutagênese REMI) e T108 (oriundo de mutagênese convencional), os quais exibiram diferentes fenótipos mutantes. O DNA total desses mutantes foi submetido à reação em cadeia de polimerase (PCR) e às análises de hibridização com o vetor (Southern blot). A presença de pAN7-1 no genoma de todos os mutantes foi confirmada por PCR. Segundo as análises de Southern blot, T41 exibiu duas integrações do vetor, ambas na forma de cópia única. No genoma de T93 também foram detectados dois sítios de inserção de pAN7-1, um dos quais envolvendo múltiplas cópias do vetor. Os resultados indicaram a presença de apenas uma cópia do vetor em um único sítio nos genomas de T108 e T251. O padrão de integração em T251 foi o único a sugerir a ocorrência de evento REMI. As diferenças quanto ao tamanho dos fragmentos com homologia a pAN7-1 refletiram a possível aleatoriedade dos eventos de integração no genoma de M. grisea. Os resultados evidenciaram o potencial de REMI para a mutagênese insercional de M. grisea, quando conduzida com pAN7-1 e HindIII

Experiments were conducted to investigate the presence, number of copies and integration site of pAN7-1 in the genome of mutants of Magnaporthe grisea impaired in pathogenicity to rice. The mutants T41, T93, T251 (obtained by REMI) and T108 (obtained by conventional mutagenesis) exhibiting different alterations in pathogenicity were analyzed. Polymerase chain reaction (PCR) and Southern blot analyses were conducted with total DNA of mutants. The presence of pAN7-1 in genome of mutants was confirmed by PCR. Based in Southern blot analyses, two single-copy integration of vector were detected in T41. Two insertion sites of pAN7-1 were detected in the genome of T93, including an event of tandem integration. The results indicated the presence of a single-copy vector in single location in T108 and T251 genomes. Only T251 showed integration pattern of pAN7-1 suggesting the occurrence of REMI event. The difference in size of hybridizing band indicated the possible randomness of integration events in M. grisea genome. The potential of REMI to mutagenesis in M. grisea, using pAN7-1 and HindIII, was evidenced.

A produção de pectinases de 40 isolados de Colletotrichum gloeosporioides, obtidos de Stylosanthes spp. em diferentes regiões produtoras, foi estimada por meio de difusão enzimática em meio específico e mensuração do halo de degradação de pectina. Em todos os isolados havia atividade pectinolítica, sendo divididos em cinco grupos distintos. Na maior parte dos isolados notou-se moderada atividade de pectinases. Em geral, isolados de Camapuã-MS tiveram menor diversidade genética para a produção de enzimas pécticas. Com base na atividade pectinolítica, isolados do patógeno foram selecionados e inoculados em genótipos de S. capitata (GC1081, GC1084, GC1086 e GC1094), S. scabra (GC1496) e S. macrocephala (GC1511), visando analisar a influência das pectinases na agressividade ao hospedeiro. Inicialmente, instalou-se ensaio de agressividade com os isolados CG656, CG657, CG687, CG706 e CG707, sendo constatada agressividade diferenciada apenas quando inoculados em S. scabra. Enquanto CG657, CG706 e CG707 foram os mais agressivos, CG656 foi o menos agressivo. Outro teste de agressividade avaliou os isolados CG768, CG769, CG772, CG775, CG779 e CG781. Estes se diferenciaram quanto à agressividade ao S. capitata (GC1081 e GC1094) e S. macrocephala (GC1511). Em geral, CG768 comportou-se como pouco agressivo, enquanto que CG772, CG775 e CG781 como os mais agressivos. Para ambos, nos ensaios de agressividade, não se evidenciou aumento da severidade da antracnose com o aumento da atividade pectinolítica. Nas condições analisadas, a agressividade de C. gloeosporioides ao estilosantes não foi influenciada pelas enzimas pécticas.

Pectinolytic activity of 40 isolates of Colletotrichum gloeosporioides obtained from Stylosanthes spp.lesions, in distinct producing regions, was estimated through the enzymatic diffusion in pectin-medium free of glucose, and measured by pectin degradation. All isolates showed pectinolytic activity, and were divided in five groups. Moderate production of pectic enzymes was evidenced in the majority of the isolates. In general, isolates from Camapua-MS presented low genetic diversity for the production of pectinases. Taking into account the activity of pectinases, isolates of the pathogen were selected and inoculated in S. capitata (GC1081, GC1084, GC1086 and GC1094), S. scabra (GC1496) and S. macrocephala (GC1511). Thus, the enzyme influence on aggressiveness to the host was evaluated. Initially, aggressiveness test was installed with the isolates CG656, CG657, CG687, CG706 and CG707. Differences in aggressiveness were observed only when the isolates were inoculated in S. scabra. The isolates CG657, CG706 and CG707 were the most aggressive, and CG656 was the least aggressive. Another aggressiveness test was established to evaluate the isolates CG768, CG769, CG772, CG775, CG779 and CG781. These isolates showed differences in their aggressiveness when inoculated in S. capitata (GC1081 and GC1094) and S. macrocephala (GC1511). In general, CG768 exhibited the lowest while, CG772, CG775 and CG781 the highest aggressiveness. In both aggressiveness tests, there were no evidences for a direct correlation of anthracnose increase in severity with the of the pectinolytic activity. For the conditions evaluated, the pectic enzymes did not influence the aggressiveness of C. gloeosporioides to the stylo.

Objetivou-se estudar os potenciais dos tratamentos térmico e químico em sementes de Brachiaria brizantha cv. Piatã, preconizados como eficientes na superação da dormência física das mesmas, na redução do inóculo de carvão (Ustilago operta). Amostras de sementes foram expostas ao ácido sulfúrico por tempo variando de 0 a 10 min, ou imersas em água à temperatura variável (27 a 60 ºC) por 5 ou 10 min. Avaliaram-se os efeitos dos tratamentos no número de teliósporos de U. operta remanescentes e na freqüência de germinação das sementes tratadas. À medida que se prolongou a escarificação química das sementes se evidenciou decréscimo do inóculo de carvão. Menor número de teliósporos foi observado nas sementes submetidas à quimioterapia por 10 min. Em geral, a exposição das sementes ao H2SO4 não levou ao decréscimo da capacidade germinativa das mesmas. Os resultados da termoterapia não foram tão evidentes como os observados para a quimioterapia, sejam na redução do número de teliósporos ou na superação da dormência. É provável que o tempo de exposição das sementes não tenha sido o suficiente. Paralelamente, verificou-se a eficiência da aplicação de fungicidas na parte aérea das plantas no controle da incidência do carvão. Foram testados os fungicidas: 1 - tiofanato metílico + chlorothalonil; 2 - mancozeb; 3 - tebuconazole; 4 - triadimenol; 5 - azoxystrobin + cyproconazole; 6 - pyraclostrobin + epoxyconazole; 7 - trifloxystrobin + cyproconazole; 8 - carboxin + thiram; 9 - tiofanato metílico + flutriafol; 10 - carbendazin, e 11 - difenoconazole. Mesmo com a ocorrência de baixa incidência de carvão na área experimental (máximo de 15%), observaram-se diferenças entre os fungicidas quanto ao controle da doença. O fungicida tebuconazole e as formulações pyraclostrobin + epoxyconazole e trifloxystrobin + cyproconazole foram os mais promissores.

This work investigated the potentials of the thermal and chemical treatments in seeds of Brachiaria brizantha cv. Piatã, which have been described as efficient strategies to overcome the physical dormancy of seeds, in the reduction of smut (Ustilago operta). Samples of seeds were immersed in sulfuric acid for 0 to 10 min, or in hot water (27 to 60 ºC) for 5 or 10 min. The effects of the treatments in the number of remaining teliospores of U. operta and in the germination of treated seed have been evaluated. A decrease of inoculum was observed as the time of chemical scarification of seeds was increased. The reduction on the number of teliospores was superior with 10 min of chemotherapy. In general, the exposition to H2SO4 did not result in a decrease of the germinative power of the seeds. The results of the thermotherapy were not as evident as those observed for the chemotherapy. Reductions on the number of teliospores or on the overcoming of the physical dormancy were less apparent, maybe, because the seeds were not immersed in hot water during enough time. In parallel, the efficiency of the application of fungicides on the aerial part of the plants for the control of the smut incidence was verified. The fungicides tested were as follow: 1 - methylic tiofanato + chlorothalonil; 2 - mancozeb; 3 - tebuconazole; 4 - triadimenol; 5 - azoxystrobin + cyproconazole; 6 - pyraclostrobin + epoxyconazole; 7 - trifloxystrobin + cyproconazole; 8 - carboxin + thiram; 9 - methylic tiofanato + flutriafol; 10 - carbendazin, and 11 - difenoconazole. Although the smut incidence observed in the experimental area was low (maximum of 15%), a differentiation among the fungicides was possible. The tebuconazole, pyraclostrobin + epoxyconazole and trifloxystrobin + cyproconazole were the most promising fungicides.

Verificou-se a eficiência de uma ou duas aplicações de Piraclostrobin + Epoxiconazole, Mancozeb, Triadimenol, Azoxistrobin + Ciproconazole, Trifloxistrobin + Ciproconazole ou Tebuconazole no controle da mela-das-sementes de Brachiaria brizantha cvs. Marandu e Xaraés, durante a safra 2004-05. Também foram avaliados os indutores de resistência Acibenzolar-S-Metil e Silicato de Potássio (via aérea ou solo). Triadimenol, com uma ou duas aplicações, Piraclostrobin + Epoxiconazole, Azoxistrobin + Ciproconazole, Trifloxistrobin + Ciproconazole ou Tebuconazole, com duas aplicações, foram promissores no controle da mela-das-sementes do capim-marandu. Já para a cv. Xaraés, melhor controle foi alcançado com o Piraclostrobin + Epoxiconazole, independente do número de aplicações, Triadimenol, Trifloxistrobin + Ciproconazole ou Tebuconazole, com duas aplicações. Não houve correlação entre os dados de produção de sementes puras e a intensidade da mela. Com relação ao progresso da mela-das-sementes de B. brizantha cvs. Marandu e Xaraés, constatou-se que a doença manifestou-se em períodos frios associados à umidade relativa alta. Na cv. Marandu a doença ocorreu na fase final da cultura, enquanto que na cv. Xaraés, a mela foi detectada na fase de intenso florescimento. Foram constatados aumentos na intensidade da doença em ambas as cultivares. A mela-das-sementes ocorreu em 64% das panículas da cv. Marandu e em 81% das panículas da cv. Xaraés; cerca de 20% e 18% das flores/sementes, respectivamente, foram afetadas. Os resultados demonstraram existir correlação positiva entre os valores de incidência e severidade da mela.

The efficiency of one or two applications of Pyraclostrobin + Epoxyconazole, Mancozeb, Triadimenol, Azoxystrobin + Cyproconazole, Trifloxystrobin + Cyproconazole or Tebuconazole in the control of honeydew in seeds of Brachiaria brizantha cvs. Marandu and Xaraes was verified during crop 2004-05. The inductors of resistance Acibenzolar-S-Methyl and Potassium Silicate (applied in aerial part or in soil) were evaluated. Triadimenol, with one or two applications, Pyraclostrobin + Epoxyconazole, Azoxystrobin + Cyproconazole, Trifloxystrobin + Cyproconazole or Tebuconazole, with two applications, were the fungicides most promising in the control of disease in marandu grass. About cv. Xaraes, better control was reached with Pyraclostrobin + Epoxyconazole, independent of number of applications, Triadimenol, Trifloxystrobin + Cyproconazole or Tebuconazole, with two applications. Correlation between production of pure seeds and of disease intensity was not detected. With regard to the progress of honeydew in seeds of B. brizantha cvs. Marandu and Xaraes, observed the disease occurred in cold periods with high humidity. In cv. Marandu the pathogen occurred in final phase of culture, while in cv. Xaraes the honeydew was detected in phase of intense bloom. Constant increases of disease intensity were observed in two genotypes. The honeydew occurred in 64% of panicles of cv. Marandu and in 81% of panicles of cv. Xaraes; about 20% and 18% of flowers/seeds, respectively, was affected. The results verified high positive correlation between the values of incidence and severity of disease.

Transformantes de Magnaporthe grisea resistentes a higromicina, obtidos principalmente por procedimentos REMI (Restriction Enzyme-Mediated Integration), foram avaliados quanto à habilidade em causar doença em arroz. A partir de testes de patogenicidade envolvendo 125 transformantes foi possível selecionar cinco mutantes com alterações consistentes na patogênese. Dois desses mutantes, T108 e T93, causaram poucas lesões em folhas de arroz, enquanto o mutante T251 não foi patogênico. A alteração na patogenicidade de T108 foi acompanhada pela menor capacidade de desenvolvimento in vitro. Quando inoculado em plantas de arroz, o mutante T41 apresentou agressividade reduzida, caracterizada por lesões arredondadas de tamanho limitado. Por sua vez, o período de incubação para o mutante T72 foi maior que o do isolado selvagem. Além disso, atraso considerável na germinação de conídios e formação de apressórios foi detectado em T72. Todos os mutantes cresceram em meio mínimo, indicando que as mutações não foram associadas à auxotrofia. Os mutantes T93 e T251 apresentam fenótipos semelhantes quando em cultura, caracterizados pela pigmentação marrom.

Hygromycin-resistant transformants of Magnaporthe grisea, generated mainly by REMI (Restriction Enzyme-Mediated Integration), were screened for their ability to infect rice plants. Out of 125 transformants five showed changes in pathogenicity. The T108 and T93 mutants caused few lesions in rice leaves, while the T251 mutant was non-pathogenic. The alteration in pathogenicity of T108 was accompanied by reduced development in culture. The T41 mutant caused small and limited round lesions. The incubation period of the T72 mutant was longer than that of the wild type. Furthermore, late germination and appresorium formation was detected in the T72 mutant. All mutants grew in minimum medium, suggesting that there were no auxotrophic-associated mutations. The T93 and T251 mutants presented similar phenotypes in culture, characterized by a brown-pigmented colony.

O objetivo deste trabalho foi identificar e quantificar a nematofauna fitopatogênica de sementes de forrageiras, destinadas aos mercados interno e externo. Examinaram-se sementes de Brachiaria brizantha (cvs. Marandu e Xaraés), B. decumbens cv. Basilisk, Panicum maximum (cvs. Massai, Mombaça e Tanzânia) e Stylosanthes capitata e S. macrocephala, componentes da cultivar Estilosantes Campo Grande. As extrações foram realizadas por flotação centrífuga, em solução de sacarose com caulim. Nas gramíneas, encontraram-se os gêneros Aphelenchoides e Ditylenchus. O maior número de espécimes de Aphelenchoides spp. foi observado nas sementes de 'Marandu', e, em seguida, nas sementes de 'Xaraés', 'Basilisk' e 'Tanzânia'. Quanto à densidade populacional de Ditylenchus spp., os maiores valores foram observados nas sementes de 'Marandu', 'Xaraés' e 'Basilisk'. Os resultados sugerem que pelo menos duas espécies de Aphelenchoides e Ditylenchus estão associadas às sementes de gramíneas forrageiras, destinadas ao mercado interno. Fitonematóides não são detectados em sementes de 'Estilosantes Campo Grande', tampouco nas cultivares Marandu, Mombaça e Tanzânia, destinadas à exportação.

The objective of this work was to identify and quantify the phytopathogenic nematofauna of forage seeds destined for internal and external markets. Seeds of Brachiaria brizantha (cvs. Marandu and Xaraés), B. decumbens cv. Basilisk, Panicum maximum (cvs. Massai, Mombaça and Tanzania), and Stylosanthes capitata and S. macrocephala, components of cv. Estilosantes Campo Grande, were examined. The extractions were made by centrifugal flotation in solution of sucrose with kaolin. Aphelenchoides and Ditylenchus genera were detected in forage grasses. The highest number of Aphelenchoides spp. specimens was observed in seeds of cv. Marandu, followed by seeds of cvs. Xaraés, Basilisk, and Tanzania. Regarding Ditylenchus spp. population density, higher values were detected in seeds of cvs. Marandu, Xaraés, and Basilisk. The results suggest that two or more species of Aphelenchoides and Ditylenchus are associated to forage grass seeds destined for Brazilian market. Phytopathogenic nematodes are not detected in Estilosantes Campo Grande seeds, neither in seeds of cvs. Marandu, Mombaça and Tanzania destined for exportation.

As atividades amilolítica e pectinolítica de 45 isolados de Alternaria solani, provenientes de diferentes hospedeiros, foram estimadas por meio da difusão enzimática em meio sólido específico e mensuração do halo de degradação do substrato. Todos os isolados degradaram pectina. Apenas 17 isolados apresentaram atividade amilolítica, sendo nove isolados provenientes de batateira. Somente o isolado AS18 se destacou como bom produtor de ambas as enzimas. Uma vez que a atividade pectinolítica foi mais evidente, avaliou-se a influência de pectinases na agressividade de A. solani ao tomateiro. Para isso, cinco isolados (2 de berinjela, 2 de tomateiro e 1 de batateira) contrastantes quanto à produção de pectinases foram selecionados para testes em folíolos destacados e plantas inteiras. Quatro isolados foram utilizados no teste em folíolos destacados (AS6, AS7, AS12 e AS26), e constatou-se haver variabilidade patogênica. A correlação obtida entre o tamanho das lesões e a atividade pectinolítica foi de r = 0,963 (P = 0,087). Cinco isolados (AS6, AS7, AS12, AS25 e AS26) foram inoculados em plantas inteiras de tomate. Os isolados não diferiram quanto ao número de lesões/cm² de área foliar, porém variaram em agressividade. Houve correlação (r = 0,916; P = 0,042) entre a atividade de pectinases e o índice de doença, sugerindo possível papel para as enzimas pécticas durante a infecção de A. solani em tomateiro. É provável que as diferenças no perfil enzimático dos isolados estejam associadas ao hospedeiro original de onde os mesmos foram obtidos. Os resultados reforçaram evidências de especificidade por hospedeiro em populações de A. solani.

Amilolytic and pectinolytic activities of 45 isolates of Alternaria solani from distinct hosts were investigated. Enzyme secretion was evaluated in glucose-free medium amended with pectin or starch as carbon source. All isolates degraded pectin. Only 17 isolates had amilolytic activity, and nine of these isolates were isolated from potato. Only AS18 had good amilolytic and pectinolytic activities. The role of pectinases produced by A. solani in its aggressiveness on tomato was examined. Five isolates showing substantial differences regarding the ability to produce pectic enzymes were selected, two from eggplant, two from tomato plants, and one from potato plant. Four isolates (AS6, AS7, AS12, and AS26) were inoculated on detached leaflets of tomato and pectinolytic activity was correlated with lesion size (r = 0.963; P = 0.087). Pathogenicity test with five isolates (AS6, AS7, AS12, AS25, and AS26) was conducted in tomato plants. Variation in the number of lesions per cm² of leaf area was not detected, but isolates varied in aggressiveness. Pectinolytic activity and aggressiveness were correlated (r = 0.916; P = 0.042). In general, pectinases-producing isolates caused larger lesions on tomato plants. It is possible that enzymatic profile differences are associated with the host origin. The results contribute to cumulative evidences of host specificity in populations of A. solani.

Protoplastos são ferramentas biológicas importantes para pesquisas em fungos filamentosos, sendo empregados intensamente em transformação genética. O isolamento de protoplastos de Magnaporthe grisea foi facilitado com Novozym 234, contudo, este complexo enzimático encontra-se indisponível no mercado. Assim, objetivou-se comparar a eficiência de enzimas líticas disponíveis comercialmente na obtenção de protoplastos de M. grisea. Paralelamente, analisaram-se estabilizadores osmóticos, tempos de digestão e freqüência de regeneração. Maior produção de protoplastos foi obtida com o uso simultâneo de Lysing Enzymes e Cellulase Onozuka R-10. O uso de 10 ou 15 mg de cada complexo enzimático, em 3 mL de estabilizador osmótico, resultou em maior liberação de protoplastos. O melhor estabilizador osmótico foi MgSO4 1,2 M / NaH2PO4 0,01 M, pH 5,8, seguido por MgSO4 0,8 M / NaH2PO4 0,01 M, pH 5,8. O isolamento de protoplastos foi monitorado a cada 60 minutos, atingindo o máximo após incubação por 3 a 6 horas. No entanto, maior freqüência de regeneração (19,4%) foi registrada para protoplastos obtidos após 3 horas de hidrólise enzimática.

Protoplasts are important biological tools in filamentous fungi research. Fungal protoplasts have been extensively used in experiments with genetic transformation. Protoplastization of Magnaporthe grisea was accomplished with Novozym 234, however, this enzymatic complex is no commercially available for purchase. Thus, the efficiency of several other commercial enzymes in M. grisea protoplasts preparation was investigated. At the same time, osmotic buffer, digestion time and regeneration rate were also analyzed. The highest protoplasts production was obtained with Lysing Enzymes plus Cellulase Onozuka R-10. The use of 10 or 15 mg of each enzymatic complex in 3 mL of osmotic buffer was most effective for the protoplasts yields. The best osmotic buffer was MgSO4 1.2 M / NaH2PO4 0.01 M, pH 5.8, followed by MgSO4 0.8 M / NaH2PO4 0.01 M, pH 5.8. The M. grisea protoplasts yield, evaluated at each 60 min, increased with 3 to 6 hours of incubation. However, the highest regeneration frequency (19.4%) was recorded for protoplasts obtained with 3 hours of enzymatic hydrolyse.