RESUMO: O objetivo deste trabalho foi caracterizar a população folicular ovariana pré-antral em cutias (D. leporina) estimando o número de folículos em cada categoria de desenvolvimento, e também descrever a morfometria e as características específicas do folículo e oócito usando microscopia de luz e eletrônica de transmissão. O comprimento de cada ovário foi medido utilizando um paquímetro, seccionados longitudinalmente em duas metades e ambos foram imediatamente fixados para realizar a estimativa da população folicular e análise ultraestrutural. A média (±S.E.M.) da população folicular por par de ovário foi estimada em 4419,8±532,26 e 5397,52±574,91 nos ovários direito e esquerdo, respectivamente, mas não foram observadas diferenças entre eles. Os diâmetros dos folículos, oócito e núcleos, respectivamente, foram: 18,62±3,40μm, 12,28±2.37μm e 6,10±0,93μm para primordial, 23,75±5,70μm, 14,22±3,00μm e 6,70±1,24μm para primário e 88,55±17,61μm, 52,85±17,56μm e 22,33±17,61μm de folículos secundários. A maioria dos folículos encontrados pertencia à categoria primordial (86,63%), seguido pelo primário (13,01%) e um secundário (0,35%). Adicionalmente, os folículos poliovulares foram observados em todos os animais e representavam 7,51% do total de folículos contados. A análise ultra-estrutural mostrou que o oócito apresentou núcleos centrais e regulares, exibindo uma massa homogênea. Dentre as organelas, as mitocôndrias foram as mais abundantes e o aparelho de Golgi do oócito foi raramente observado. Em conclusão, este trabalho mostra pela primeira vez a caracterização da população de folículos pré-antrais do ovário da Dasyprocta leporina. Essas informações serão úteis para o desenvolvimento e adaptação de biotécnicas, como a criopreservação de germoplasma e manipulação de gametas in vitro.

ABSTRACT: The aim of this study was to characterize the preantral ovarian follicular population in agoutis (D. leporina) by estimating the number of follicles at each developmental category, and also describe the morphometry and the specific features of the follicle and the oocyte by using light and transmission electron microscopy. The length of each ovary was measured using a caliper rule, longitudinally sectioned into two halves and both were immediately fixed to perform the estimation of follicular population and ultrastructural analysis. The mean (±S.E.M.) population of follicular per pair of ovary was estimated at 4419.8±532.26 and 5397.52±574.91 for right and left ovaries, respectively, but no differences were observed between them. The diameters for follicles, oocyte and nuclei were: 18.62±3.40μm, 12.28±2.37μm and 6.10±0.93μm for primordial, 23.75±5.70μm, 14.22±3.00μm and 6.70±1.24μm for primary and 88.55±17.61μm, 52.85±17.56μm and 22.33±17.61μm for secondary follicles, respectively. The most of the follicles found belonged to the primordial category (86.63%), followed by primary (13.01%) and secondary (0.35%) one. Additionally, polyovular follicles were observed in all the animals and they represented 7.51% of the total follicles counted. The ultrastructural analysis showed that the oocyte presented a central and regular nuclei, displaying a homogenous mass. Among the organelles, the mitochondria were the most abundant and the oocyte Golgi apparatus was rarely observed. In conclusion, this work shows for the first time the characterization of the population of preantral follicles in the ovary of Dasyprocta leporina. Those information will be useful for further development and adaptation of biotechniques such as germplasm cryopreservation and in vitro gametes manipulation.

Resumo: O objetivo deste estudo foi criopreservar o sêmen de tatus-peba (Euphractus sexcinctus) em diluente Tris-gema e glicerol, e determinar os danos causados pelo processo de congelação-descongelação, utilizando marcadores fluorescentes e análise ultraestrutural. As amostras de sêmen (n=11) coletadas de 4 tatus-peba adultos por eletroejaculação foram criopreservadas em diluente Tris acrescido de 20% de gema de ovo e 3% de glicerol, em curva rápida de congelação. A análise clássica das amostras foi realizada após a diluição, refrigeração e descongelação, seguida por análise de fluorescência, utilizando uma combinação de sondas fluorescentes para avaliar a integridade da membrana (Iodeto de Propídio - PI e Hoechst - H342), e a atividade mitocondrial (CMXRos - Mito Tracker RED®). Foi também utilizada a análise ultraestrutural para verificar possíveis alterações morfológicas causadas pela crioinjúria. Quando comparadas com as amostras a fresco, verificou-se uma queda significativa em todos os parâmetros seminais dos tatus após a descongelação, em que apenas 6,1% de espermatozoides móveis foram encontrados. No entanto, o percentual de espermatozoides que permaneceu com membrana viável (13%) e funcional (24,7%) após a descongelação sugere que algumas células podem estar vivas, mas imóveis. Análises utilizando marcadores fluorescentes revelaram que as mitocôndrias dos espermatozoides de tatus são altamente sensíveis ao protocolo de congelação e os achados através da análise ultraestrutural comprovaram esta afirmação. Além disso, as imagens obtidas por microscopia eletrônica de transmissão revelaram que espermatozoides congelados-descongelados apresentaram membranas plasmáticas danificadas, modificações nucleares como alterações na cromatina, e alterações acrossomais relativas à capacitação espermática. Em conclusão, este estudo é a primeira tentativa de criopreservação de sêmen em uma espécie de tatu, e nos auxiliou a identificar pontos críticos no processo de congelação-descongelação, a fim de melhorar o protocolo.

Abstract: The aim of the study was to cryopreserve the semen of six-banded armadillos (Euphractus sexcinctus) in Tris-yolk and glycerol diluent, and to determine the damage caused by the freezing-thawing process, using fluorescent markers and ultrastructural analysis. Semen samples (n=11) collected from 4 adult six-banded armadillos by electroejaculation were cryopreserved in Tris diluent plus 20% egg yolk and 3% glycerol, in a fast freezing curve. Classical analysis of samples was performed after dilution, refrigeration and thawing, followed by fluorescence analysis, using a combination of fluorescent probes to assess membrane integrity (propidium iodide - PI and Hoechst - H342), and mitochondrial activity (CMXRos - Mito Tracker Red®). We also used the ultrastructural analysis to verify possible morphological alterations caused by cryoinjuries. When compared with fresh samples, we verified a significant decline in all the armadillos' semen parameters after thawing, in which only 6.1% motile sperm were found. However, the percentage of sperm which remained with viable (13%) and functional (24.7%) membranes after thawing suggests that some cells could be live but immotile. Analysis using fluorescent markers revealed that the mitochondria of armadillos' sperm is highly sensible to the freezing protocol and the findings through ultrastructure analysis proved this statement. Additionally, the images obtained by transmission electron microscopy revealed that frozen-thawed sperm presented damaged plasma membrane, nuclear modifications as changes in chromatin and acrossomal changes relative to sperm capacitation. In conclusion, this study is the first attempt to cryopreserve the semen of an armadillo species, and to help us to identify critical points on the freezing-thawing procedure in order to improve the protocol.

O objetivo deste estudo foi monitorar o ciclo estral em cutias (Dasyprocta leporina) criadas em cativeiro no semiárido brasileiro. Durante 70 dias, cinco cutias foram diariamente submetidas a citologia esfoliativa vaginal, e o monitoramento ultrassonográfico ovariano foi realizado a cada três dias. Um total de 8 ciclos estrais foi completamente monitorado, com duração de 28,2±0,7 dias, variando de 24 a 31 dias. Pela citologia esfoliativa vaginal, houve uma predominância de células superficiais nas fases de proestro e estro (P<0,05), seguida da predominância de células intermediárias no metaestro (P<0,05) e de células parabasais no diestro (P<0,05). Por ultrassonografia, não houve diferenças na morfologia ovariana durante as diferentes fases do ciclo estral (P>0,05). Os folículos foram identificados durante as fases estrogênicas (proestro e estro), com diâmetro médio de 1±0,5mm. Em apenas 12,5% das fases luteais, corpos lúteos medindo 1,4±0,9mm foram identificados. Conclui-se que a associação da citologia vaginal e da ultrassonografia ovariana constitui uma alternativa viável para o monitoramento de ciclos estrais e identificação das fases estrogênicas em cutias da espécie Dasyprocta leporina

The objective of the study was to monitor the estrous cycle in agoutis (Dasyprocta leporina) bred in captivity in Brazilian semiarid. During 70 days, five agoutis were daily subjected to vaginal exfoliative cytology, and the ovarian ultrasound monitoring was conducted every three days. A total of 8 estrous cycles were completely monitored, lasting 28.2±0.7 days, ranging from 24 to 31 days. By vaginal exfoliative cytology, there was predominance of superficial cells at proestrus and estrus phases (P<0.05), followed by the predominance of intermediate cells in the metestrus (P<0.05) and parabasal cells in diestrus (P<0.05). By ultrasound, there were no differences in ovarian morphology during the different phases of the estrous cycle (P>0.05). Follicles during the estrogenic phases (proestrus and estrus) were identified, with an average diameter of 1±0.5mm. In only 12.5% of luteal phases, corpora lutea measuring 1.4±0.9mm were identified. We conclude that the association of vaginal cytology and ovarian ultrasonography is a useful alternative for monitoring the estrous cycle and identifying the estrogenic phases in Dasyprocta leporina

O objetivo deste estudo foi comparar diferentes métodos de coloração para avaliação da morfologia espermática por microscopia de luz e também descrever a morfometria completa de espermatozoides de catetos (Pecari tajacu). Sêmen de 10 machos foi obtido por eletroejaculação e avaliado quanto à motilidade espermática, vigor e concentração. Foram preparados por três diferentes métodos de coloração: Rosa de Bengala, Azul de Bromofenol e Eosina-Nigrosina. Os esfregaços foram avaliados por microscopia de luz, e determinado o percentual das alterações morfológicas. Ainda, a análise da morfometria espermática foi realizada por microscópio de luz acoplado a um softwere de análise de imagens. Os esfregaços corados com Rosa de Bengala apresentaram melhores resultados de visualização da cauda, peça intermediária e cabeça dos espermatozoides. O uso do corante Eosina-Nigrosina não permitiu uma adequada impregnação e alguns dos espermatozoides apresentaram pouco contraste com o fundo da lâmina. Uma maior incidência de cauda fortemente enrolada foi verificada com o uso do corante Azul de Bromofenol (P<0.05). Através da avaliação morfométrica foi observada que a cauda ocupa a maior proporção (89%) do espermatozoide, e a cabeça apresenta-se discretamente alongada. De acordo com os resultados, o uso do corante Rosa de Bengala é recomendado para a avaliação morfológica de espermatozoides de catetos.

The aim of this study was to compare different staining methods for the evaluation of sperm morphology by light microscopy and also to describe the morphometry of the entire sperm in collared peccaries (Pecari tajacu). Semen from 10 males was obtained by electroejaculation and evaluated for sperm motility, vigor, and concentration. Semen smears were prepared through three different staining methods: Bengal rose, brome-phenol blue, and eosin-nigrosin. Smears were evaluated under light microscopy and sperm morphologic alterations were determined in percentage. In addition, sperm morphometric analysis was conducted by light microscopy coupled to image analyzer software. The smears stained with Bengal Rose provide the best results for the visualization of the sperm tail, midpiece, and head. The use of eosin-nigrosin stain did not allow an adequate impregnation, and some sperm presented a few contrasts with the background. A higher incidence of bent coiled tails was verified in the use of brome-phenol blue staining (P<0.05). Through morphometric evaluation, it was observed that the tail occupies the greatest proportion (89%) of the sperm which presents a discretely elongated head. According to the results, the use of the Bengal Rose stain is recommended for the morphologic evaluation of the collared peccary sperm.