Resumo Diversidade molecular, morfológica, perfil químico qualitativo e atividade antioxidante de fungos filamentosos do trato digestivo de Phylloicus sp. (Trichoptera: Calamoceratidae). Este estudo visou identificar por análises molecular, morfológica, química e por extrato antioxidante, fungos filamentosos isolados do trato digestivo de Phylloicus sp, um inseto aquático que vive entre folhagens em riachos tropicais, e participam junto com os fungos da decomposição de substratos vegetais em habitats aquáticos. Larvas de insetos de Phylloicus sp. foram coletadas em riachos no Estado do Tocantins, Brasil. Os fungos foram isolados a partir do trato digestivo das larvas após desinfecção e dissecção, depois descritos e purificados para fins de identificação e testes para atividade antioxidante. A identidade molecular foi realizada do sequenciamento ITS1 e ITS4, TUB e TEF. Os extratos fúngicos foram produzidos em solução etanólica 70% e posterior liofilização. Para análise de grupos químicos dos extratos, foi realizada cromatografia em camada delgada (CCD) em duas fases móveis e diferentes reveladores. A morfologia foi realizada por microscopia óptica corada com Azul de Toluidina e a mensuração realizada no programa ImageJ. A atividade antioxidante realizada em CCD e por método quantitativo para os radicais DPPH e peróxido de hidrogênio (H2O2). Foram identificados quatro fungos: Endomelanconiopsis endophytica, Myxospora musae, Neopestalotiopsis cubana e Fusarium pseudocircinatum. Na CCD foi evidenciado várias manchas com fase móvel acetona/clorofórmio e reveladores UV 254 nm e vapor de I2. Os extratos fúngicos demonstram ação antioxidante para redução do radical livre DPPH e em especial para H2O2 acima de 50%, E. endophytica 91.6%, M. musae 87.8%, N. cubana 89.5% e 92.3% para F. pseudocircinatum. Este estudo demonstrou que a técnica molecular por PCR foi satisfatória para identificação dos fungos, e os extratos com inúmeros grupos químicos e potentes agentes redutores. Com isso, trabalhos futuros deverão ser realizados avaliando essas quatro espécies para uso industrial.

Abstract This study aimed to identify by molecular analysis, morphology, chemistry and antioxidant extracts of filamentous fungi isolated from the digestive tract of Phylloicus sp, an aquatic insect that lives on leaf packages in tropical streams and participates together with fungi of the decomposition of plant substrates in aquatic habitats. Insect larvae of Phylloicus sp. were collected in streams in the state of Tocantins, Brazil. Fungi were isolated from the digestive tract of larvae after disinfection and dissection, then described and purified for identification purposes and testing for antioxidant activity. Molecular identity was performed of ITS1 and ITS4, TUB e TEF sequencing. Fungal extracts were produced in 70% ethanol solution and later lyophilized. For analysis of chemical groups of extracts, thin layer chromatography (TLC) was performed in two mobile phases and different developers. Morphology was performed by optical microscopy stained with Toluidine Blue and measurement performed using the ImageJ program. Antioxidant activity performed in TLC and by quantitative method for DPPH and hydrogen peroxide (H2O2) radicals. Four fungi were identified: Endomelanconiopsis endophytica, Myxospora musae, Neopestalotiopsis cubana and Fusarium pseudocircinatum. The TLC showed several spots with acetone/chloroform mobile phase and UV 254 nm developers and I2 vapor. Fungal extracts demonstrate antioxidant action to reduce the DPPH free radical and especially for H2O2 above 50%, E. endophytica 91.6%, M. musae 87.8%, N. cubana 89.5% and 92.3% for F. pseudocircinatum. This study demonstrated that the molecular technique by PCR was satisfactory for identifying fungi, and extracts with numerous chemical groups and potent reducing agents. Thus future work, should be carried out evaluating these four species for industrial use.

RESUMO As formigas têm uma distribuição mundial e representam importante papel no ecossistema. Algumas espécies são consideradas pragas para a agricultura e um risco potencial à vida humana e à saúde pública veiculando mecanicamente agentes patogênicos. Formigas como Paratrechina longicornis e Camponotus spp. têm sido encontradas em ambientes hospitalares. O foco do presente estudo foi a identificação de micobactérias em 138 amostras de formigas (137 Paratrechina longicornis e apenas uma Camponotus sp.), que tiveram acesso a áreas de laboratórios de diagnóstico de tuberculose. Essas formigas foram suspensas em solução salina estéril que foi semeada em meios de Petragnani e Stonebrink, incubadas a 37º C por até 90 dias e as estirpes de micobactérias isoladas foram identificadas pelas técnicas clássicas como micobactérias ambientais (sendo 1 Mycobacterium smegmatis, 2 Mycobacterium fortuitum peregrinum e 1 Mycobacterium tuberculosis). Esses resultados mostram que as formigas podem também se constituir vetores de dispersão de micobactérias em ambientes de risco, reforçando sua importância em saúde pública.

ABSTRACT Ants are found worldwide playing an important environmental role. Some species are considered as agricultural pests and potential risk to human life and public health acting as pathogens carriers. Ants as Paratrechina longicornis and Camponotus spp. have been found inside hospitals. The aim of this study was the research of mycobacteria in 138 samples of ants (137 Paratrechina longicornis and only one Camponotus spp.) which got into the laboratories of tuberculosis diagnosis. These ants were suspended in sterile saline solution and inoculated into Petragnani and Stonebrink media, incubated at 37° C until 90 days and the isolates were identified as environmental mycobacteria (1 Mycobacterium fortuitum peregrinum, 1 Mycobacterium smegmatis) and 1 Mycobacterium tuberculosis complex. These results showed that ants should also act as mechanical vectors of mycobacteria dissemination in risk environments, reinforcing their significance in public health.

The objectives of the present study were the subtyping of Campylobacter jejuni subsp. jejuni strains obtained from humans and different animal species using PCR-RFLP, and the detection, by means of the same technique, of strains related to serotype PEN O19:LIO 7, the main C. jejuni serotype linked to Guillain-Barré Syndrome (GBS). Seventy C. jejuni strains isolated from human feces (n=33), primates (n=15), dogs (n=5), swine (n=2), bovines (n=1), abortion material from goats (n=2) and poultry carcasses (n=12), all collected in the state of São Paulo, were subtyped by means of PCR-RFLP of fla A gene, using restriction endonucleases Hae III, Afa I and Mbo I. Seven subtypes were observed when using the enzyme Hae III; eight when using Mbo I; and seven when using Afa I. The combination of the three endonucleases led to 16 fla-RFLP subtypes, from which ten subtypes shared strains of human and animal origin. From these, seven subtypes were observed in human and broiler strains. In eight subtypes, the other animal species shared patterns with human strains. It was inferred that, besides broilers, swine, goats, dogs and primates may be sources of infection for human in São Paulo. PCR-RFLP is a highly discriminatory technique that may be applied to molecular epidemiology studies of samples from different origins. Besides, the study also enabled the detection of two human strains and two primate strains related to serotype PEN O19: LIO 7.

RESUMO Foi avaliada, em condições de laboratório, a virulência de quatro isolados de nematóides entomopatogênicos contra larvas de 3º e 4º instares de Bradysia mabiusi Lane, e a persistência de Heterorhabditis indica Poinar et al. 1992 em substratos orgânicos, dentro de casa de vegetação. No teste de virulência, foram avaliados os isolados H. indica IBCB-n05, Heterorhabditis sp. IBCB-n10, Steinernema glaseri CCA e S. carpocapsae CCA. Os nematóides foram usados na dosagem de 200 juvenis infectivos (JI)/larva. Para a avaliação de persistência, foi selecionado o nematóide H. indica IBCB-n05, sendo realizados 2 testes em casa de vegetação. Em um teste, o nematóide foi aplicado nas dosagens de 5,7 e 22,6 JI/cm2 e, em outro, nas dosagens de 10 e 50 JI/cm2. Nos dois testes, foram feitas duas avaliações, liberando-se larvas do inseto nas amostras tratadas do substrato após 24 horas e 15 dias da aplicação. O nematóide H. indica IBCB-n05 provocou 100% de mortalidade dos insetos, mas não diferiu significativamente do Heterorhabditis sp. IBCB-n10 e S. carpocapsae (96% e 83% de mortalidade, respectivamente). No estudo de persistência, o nematóide H. indica, nas dosagens de 5,7 e 22,6 JI/cm2, proporcionou, respectivamente, 67 e 80% de mortalidade corrigida das larvas (formula de Abott) após 24 horas da aplicação. Em outro teste, o nematóide, nas dosagens de 10 e 50 JI/cm2, proporcionou, respectivamente, 69% e 97% de mortalidade corrigida após 24 horas da aplicação. A persistência do nematóide nos testes em casa de vegetação foi bastante afetada já que a mortalidade do inseto, 15 dias após a aplicação, não passou de 15%.

ABSTRACT The virulence of four entomopathogenic nematodes strains against Bradysia mabiusi (Lane) 3º – 4º instar larvae in laboratory conditions and the persistence of Heterorhabditis indica Poinar et al. 1992 on organic substrates, in the greenhouse, were evaluated. For the virulence test, four nematodes strains were used: Heterorhabditis indica IBCB-n05, Heterorhabditis sp. IBCB-n10, Steinernema glaseri CCA and S. carpocapsae CCA. These nematodes were evaluated at the dosage of 200 infective juveniles (IJ)/ larvae. For the persistence study, the nematode H. indica was selected and two tests were carried out. In the first test, the nematode was applied at the dosages of 5.7 and 22.6 IJ/cm2, and in the second, at the dosages of 10 and 50 IJ/cm2. For both tests, two evaluations were done, releasing insect larvae on the treated and nontreated substrate at 24 hours and 15 days after the application. The nematode H. indica IBCB-n05 was the most virulent, causing 100% mortality of larvae, but did not differ statistically from Heterorhabditis sp. IBCB-n10 and S. carpocapsae(96% and 83% mortality, respectively). For the first persistence test, H. indica IBCB-n05 at the dosages of 5.7 and 22.6 IJ/cm2 afforded, respectively, 67 and 80% mortality of larva (corrected by Abott’s formula) 24 hours after the application. For the other persistence test, the nematode at the dosages of 10 and 50 IJ/cm2 afforded, respectively, 69 and 97% mortality (corrected by Abott’s formula) 24 hs after application. The persistence of the neiological control, Sciaridae, Steinernema sp., Heterorhabditis sp., Bradysia mabiusi.

ABSTRACT Polymerase chain reaction (PCR) with complementary primers to the polyhedrin gene region was used to diagnose B. mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV) infection. Experimental infections were performed for the standardization of the PCR assay. The PCR products were sequenced and specificity of the amplification was confirmed by comparison with BmNPV nucleotide sequences available in the GenBank. An identity level of about 99% was observed for those PCR products when compared to the known BmNPV sequences. The viral gene fragment amplification protocol proposed here is useful for early diagnosis of nucleopolyhedrosis in whole larvae, hemolymph, and infected eggs or in asymptomatic insects. Moreover, the standardized PCR can be used as a tool for surveillance and control of nucleopolyhedrosis in silkworm rearing. (PCR B (BmNPV infection assay GenBank 99 larvae hemolymph insects Moreover rearing 9

RESUMO A reação em cadeia pela polimerase (PCR) com primers complementares a uma região do gene da poliedrina foi usada para diagnosticar a infecção de B. mori pelo vírus da nucleopoliedrose (BmNPV). Infecções experimentais foram realizadas para a padronização do ensaio de PCR. Os produtos de PCR foram seqüenciados e a especificidade da amplificação foi confirmada por comparação com seqüências de nucleotídeos do BmNPV disponível no GenBank. Um grau de identidade ao redor de 99% foi observado quando tais produtos de PCR foram comparados com as seqüências de BmNPV conhecidas. O protocolo de amplificação do fragmento gênico viral proposto aqui é útil para o diagnóstico precoce da nucleopoliedrose na larva total, hemolinfa e ovos infectados ou em insetos assintomáticos. Além disso, o ensaio de PCR padronizado pode ser empregado como uma ferramenta para a vigilância e controle da nucleopoliedrose em criações de bicho-da-seda. (PCR B BmNPV. . (BmNPV) GenBank 99 conhecidas total assintomáticos disso bichodaseda. bichodaseda bicho seda. seda bicho-da-seda (BmNPV 9

ABSTRACT A sensitive and specific nested polymerase chain reaction (nested PCR) for detection of bovine leukemia virus (BLV) in blood samples was evaluated as a reliable assay for accurate diagnosis of naturally infected animals under field conditions. The standardized nested PCR relies on the identification of BLV DNA fragments of 340 or 444 bp produced by applying 2 different pairs of primers sets to the proviral env gene. This protocol was validated by testing 40 bovine blood samples from a BLV-positive dairy herd, and by comparing results with serological diagnosis provided by agar-gel immunodiffusion (AGID) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The nested PCR protocol was able to discriminate infected animals from that ones serodiagnosed as negative. This method also showed applicability for other body fluids or tissue samples. Investigation of 40 blood samples from a dairy herd showed that 37 animals were positive in ELISA, 36 in nested PCR, and only 25 in AGID. The nested PCR has demonstrated a good agreement in the results with ELISA up to 95%. These results demonstrated that nested PCR could be indicated for an early, sensitive and direct detection of BLV-infection in naturally infected cattle. Compared to the serological tests, this method proved to be the most suitable for identification of BLV-infected cattle with low, transient or without BLV-antibody titers. Moreover, this assay can be used to confirm or exclude BLV-infection in asymptomatic cattle or with doubtful serological results. This nested PCR is a valuable assay for prompt epidemiological investigations of BLV as well as for surveillance of animal health for bovine leukosis. (BLV conditions 34 44 gene 4 BLVpositive agargel agar gel AGID (AGID enzymelinked enzyme linked ELISA. . (ELISA) negative 3 95 95% early BLVinfection infection tests BLVinfected low BLVantibody antibody titers Moreover leukosis (ELISA 9

RESUMO A sensibilidade e especificidade de uma nested reação em cadeia da polimerase (nested PCR) para detecção do vírus da leucose bovina (VLB) foi avaliada em amostras de sangue bovino, como uma metodologia confiável para diagnóstico preciso de animais naturalmente infectados. O protocolo de nested PCR padronizado, baseia-se na identificação de fragmentos de 340 pb e 444 pb do DNA de VLB, produzidos pela utilização de 2 diferentes conjuntos de primers do gene env proviral. Este protocolo foi validado através de testes em 40 amostras de sangue bovino de um rebanho leiteiro VLB positivo e pela comparação dos resultados com o diagnóstico sorológico por imunodifusão em gel de ágar (IDGA) e por ensaio imunoenzimático (ELISA). O protocolo de nested PCR foi capaz de discriminar animais infectados dentre aqueles que foram diagnosticados sorologicamente como negativos. Esse ensaio mostrou ter aplicabilidade, também, a outros fluídos corporais ou amostras de tecidos. Investigações feitas em 40 amostras de sangue bovino mostraram que 37 animais foram positivos para VLB com ELISA, 36 com nested PCR e somente 25 com IDGA. O nested PCR demonstrou uma concordância nos resultados com o ELISA em até 95%. Esses resultados comprovaram que o nested PCR pode ser indicado para uma detecção precoce, sensível e direta do VLB em bovinos naturalmente infectados. Comparado com os testes sorológicos, esse método mostra-se mais adequado para a identificação de bovinos infectados possuindo títulos de anticorpo anti-VLB baixos, transientes ou ausentes. Além disso, esse ensaio pode ser usado para confirmar os resultados sorológicos duvidosos ou a infecção em bovinos assintomáticos. O nested PCR é uma metodologia valiosa para uma rápida investigação epidemiológica do VLB, assim como para a vigilância sanitária da leucose bovina. (VLB padronizado baseiase baseia se 34 44 proviral 4 IDGA (IDGA ELISA. . (ELISA) negativos aplicabilidade também tecidos 3 95 95% precoce mostrase mostra antiVLB anti baixos ausentes disso assintomáticos (ELISA 9