RESUMO A pleuropneumonia suína, causada pelo Actinobacillus pleuropneumoniae, é uma importante doença respiratória, responsável por prejuízos e queda de produtividade nas criações. Este trabalho teve como objetivo determinar a ocorrência de A. pleuropneumoniae em amostras de campo, mediante a adaptação e emprego de uma técnica de nested-PCR dirigida ao gene Apx IV. Definiu-se a sensibilidade analítica das técnicas de PCR e nested-PCR utilizando a amostra padrão A. pleuropneumoniae sorotipo III, em concentrações de DNA variando entre 30 µg/mL a 0,01 ng/ mL. Um total de trinta e sete amostras de campo encaminhadas ao Instituto Biológico entre 1995 a 2007 foram analisadas pelas técnicas de PCR e nested-PCR. A avaliação da sensibilidade analítica revelou que a PCR possui capacidade de gerar sinal a partir de 2 ng/mL de DNA extraído e a nested-PCR a partir de 0,4 ng/mL. Uma vez que a nested-PCR apresentou sensibilidade analítica cinco vezes maior se comparada à PCR para detecção de A. pleuropneumoniae em amostra padrão, o seu emprego pode minimizar a ocorrência de resultados tipo “falso-negativo”. Dentre as amostras testadas, dez foram positivas à nested-PCR, sendo observada a ocorrência de A. pleuropneumoniae em nove diferentes animais, um deles javali. A presente técnica de nested-PCR pode ser utilizada para detecção direta de A. pleuropneumoniae em amostras de campo, mesmo após congelamento da amostra por longos períodos e sem necessidade de isolamento bacteriano prévio.

ABSTRACT Porcine pleuropneumonia, caused by Actinobacillus pleuropneumoniae, is an important respiratory disease, responsible for economic losses and reduced productivity. The aim of this study was to determine occurrence of A. pleuropneumoniae in field samples, using an adapted nested-PCR reaction targeting the Apx IV gene. Different DNA concentrations (from 30 µg/mL to 0.01 ng/mL) of A. pleuropneumoniae serotype III reference strain were used to determine the level of sensitivity of first generation and nested-PCR reactions. Thirty-seven field samples sent to Instituto Biológico from 1995 to 2007 were tested by PCR and nested-PCR. Determination of the level of sensitivity showed that PCR could amplify to 2 ng/mL of extracted DNA and nested-PCR to 0.4 ng/mL. Since the nested reaction exhibited a level of sensitivity 5 times greater than the PCR reaction to detect a reference strain, using nested-PCR could minimize the occurrence of false-negative results. Among tested samples, 10 of them were nested-PCR positive, showing occurrence of A. pleuropneumoniae in 9 different animals (including one wild boar). This nested-PCR reaction can be used for direct detection of A. pleuropneumoniae in field samples, even after frozen storage for long periods, without the need for previous bacterial isolation.

Em vacas leiteiras, a disenteria de inverno (DI) é uma doença infecciosa sazonal mundialmente relatada que ocasiona uma marcada queda na produção de leite; no hemisfério Norte, onde a doença é classicamente reconhecida, o coronavirus bovino (BCoV) tem um importante papel como agente etiológico. Entretanto, no hemisfério Sul, pesquisas etiológicas aprofundadas em casos de DI nunca forma realizadas. Este estudo objetivou a pesquisa de BCoV utilizando nested-RT-PCR, rotavírus utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e ELISA, bactérias com métodos bacteriológicos clássicos e PCR para fatores de virulência e parasitas pela técnica de flutuação em açúcar em 21 amostras fecais de vacas de uma fazenda durante um surto de DI no estado de São Paulo, Sudeste do Brasil. BCoV foi encontrado em todas as 21 amostras, enquanto que rotavírus foi encontrado em duas vacas sintomáticas. Escherichia coli, Yersinia intermedia, Providencia rustigiani, Proteus penneri, Klebsiella terrigena e Enterobacter aglomerans foram encontradas tanto em amostras de vacas sintomáticas quanto assintomáticas. O estudo de fatores de virulência para E. coli revelou que as amostras isoladas eram todas apatogênicas. Cistos de Eimeria sp. e ovos de Strongyloidea foram encontrados em baixos números em quatro animais sintomáticos, com uma co-infestação. Tais resultados sugerem o BCoV como o principal agente etiológico em casos de DI no Brasil, uma conclusão que, somada aos padrões clínicos e epidemiológicos da doença aqui estudada, concordam com aqueles descritos em outras regiões. Estes achados fornecem base o desenvolvimento de medidas preventivas e também contribuem para o entendimento sobre a etiologia da DI.

Winter dysentery (WD) is a seasonal infectious disease described worldwide that causes a marked decrease in milk production in dairy cows. In the Northern hemisphere, where the disease is classically recognized, bovine coronavirus (BCoV) has been assigned as a major etiologic agent of the disease. Nonetheless, in the Southern hemisphere, an in-deep etiological survey on WD cases had not been carried out. This study aimed to survey for BCoV by nested-RT-PCR, rotavirus by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and ELISA, bacteria by classical bacteriological methods and PCR for virulence factors and parasites by sugar flotation test on fecal samples of 21 cows from a farm during an outbreak of WD in São Paulo state, Southeastern Brazil. BCoV was detected in all 21 samples, while rotavirus was detected in two symptomatic cows. Escherichia coli, Yersinia intermedia, Providencia rustigianii Proteus penneri, Klebsiella terrigena and Enterobacter aglomerans were detected in samples from both asymptomatic and healthy cows in different associations. The study of E. coli virulence factors revealed that the strains isolated were all apathogenic. Cysts of Eimeria sp. and eggs of Strongyloidea were detected at low numbers in four of the symptomatic cows, with one co-infestation. These results suggest BCoV as the main etiologic agent of the cases of WD in Brazil, a conclusion that, with the clinical and epidemiological patterns of the disease studied herein, match those already described elsewhere. These findings give basis to the development of preventive measures and contribute to the understanding of the etiology of WD.

Descreve-se a pesquisa de BCoV e rotavírus em 13 mostras fecais de vacas de surtos de disenteria utilizando uma nested PCR dirigida ao gene RdRp e PAGE, respectivamente. Todas as amostras fecais foram positivas para BCoV e nenhuma delas apresentou-se positiva para rotavírus em PAGE. O encontro de coronavírus bovino em amostras fecais de vacas com disenteria sugere que este vírus possa ser o agente primário envolvido na etiologia dos casos aqui relatados.

RESUMO Os rotavírus são importantes agentes virais envolvidos nas gastroenterite infantil e da diarréia dos animais neonatos. O objetivo deste trabalho foi otimizar o isolamento de rotavírus levando-se em conta o número de amostras, diferentes tratamentos com tripsina, número de passagens seriadas e monitoramento das mesmas através de eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE). Foram utilizadas 20 amostras fecais diarréicas, positivas para rotavírus por meio de ELISA e PAGE, oriundas de bezerros e leitões, as quais foram submetidas a quatro protocolos usando tripsina. No tratamento 1 o inóculo foi mantido e o meio de manutenção não continha tripsina; no tratamento 2 o inóculo foi dispensado e o meio de manutenção sem tripsina; no tratamento 3 o inóculo foi mantido e o meio de manutenção continha tripsina na concentração de 5 µg/mL; no tratamento 4 o inóculo foi mantido e o meio de manutenção continha tripsina na concentração de 10 µg/mL. Todos os inóculos continham tripsina na concentração de 5 mg/mL. Dentre as amostras estudadas, 15 foram isoladas com sucesso, o que representa uma eficiência de 75% (15/20). Dentre os protocolos, o tratamento 3 foi o que apresentou melhor desempenho, considerando-se o número de passagens seriadas, a ausência de citotoxidade e significância estatística (p < 0,001), quando se aplicou o teste de Freedman e o teste de Wilcoxon. neonatos levandose levando PAGE. PAGE . (PAGE) diarréicas leitões µg/mL µgmL µg mL mgmL mg mg/mL estudadas sucesso 75 15/20. 1520 15/20 (15/20) desempenho considerandose considerando p 0,001, 0001 0,001 , 0 001 0,001) Wilcoxon (PAGE 7 152 15/2 (15/20 000 0,00 00 15/ (15/2 0,0 (15/ 0, (15 (1 (

ABSTRACT Rotavirus is one of the most important etiological agents in infant gastroenteritis and diarrhea in neonatal animals. The purpose of this study was the optimization of isolation of rotaviruses in MA104 (fetal kidney Rhesus monkey) cells by the comparison of culture, taking into account the number of samples, different treatments with trypsin, number of serial passages, and positivity by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Twenty diarrheic fecal samples of calves and piglets from São Paulo, State, Brazil, all positive for rotavirus in ELISA and PAGE, were submitted to four isolation protocols: in treatment 1, the inoculum was left on the monolayer and the maintenance medium was trypsin-free; treatment 2 was the same as treatment 1 except that the inoculum was discarded; in treatment 3 the inoculum was left on the monolayer and the maintenance medium had 5 µg/mL of trypsin; treatment 4 was the same as the monolayer treatment 3, except that the maintenance medium had 10 µg/mL of trypsin. Fifteen samples were successfully isolated, representing an efficacy of 75% (15/20). Treatment 3 was the most suitable because the lower number of serial passages and lower cytotoxity to the cells, with statistical significance (p < 0.001) using Freedman's and Wilcoxon's tests. animals MA MA10 fetal monkey culture trypsin PAGE. PAGE . (PAGE) Paulo State Brazil protocols trypsinfree free trypsin-free discarded µgmL µg mL isolated 75 15/20. 1520 15/20 15 20 (15/20) p 0.001 0001 0 001 Freedmans Freedman s Wilcoxons Wilcoxon tests MA1 (PAGE 7 152 15/2 (15/20 0.00 000 00 15/ (15/2 0.0 (15/ 0. (15 (1 (

RESUMO Desenvolveu-se uma reação de "nested PCR" direcionada para o gene do ectodomínio S1 da glicoproteína S dos coronavírus para a detecção de coronavírus bovino (BCoV) em amostras fecais. Foram desenhados um par de primers externos e um par de primers internos para regiões conservadas flanqueando a região hipervariável do gene S (GenBank accession No. M31053). Os primers externos produziram um fragmento de 885pb (nn 1204 ao 2088 do gene S) e os internos um fragmento de 488bp (nn 1329 ao 1816 do gene S, interno ao produto do primeiro PCR). Temperaturas ótimas de hibridação dos primers foram testadas em um termociclador com gradiente e utilizadas no protocolo final. Os limites de detecção para os primers externos e para o protocolo "nested" final foram testados com a amostra Kakekawa de BCoV diluída em base 2, em uma suspensão de fezes livre de BCoV. O protocolo final de "nested" foi testado em 22 amostras de fezes de bezerros diarréicos e não-diarreicos e em uma amostra de uma vaca com diarréia, resultando em 10 amostras positivas entre fezes diarréicas e não-diarreicas. O nested PCR aqui relatado é uma ferramenta específica e sensível para o diagnóstico de coronavírus bovino. Desenvolveuse Desenvolveu se (BCoV fecais GenBank No M31053. M31053 M . M31053) pb nn 120 208 bp 132 181 PCR. PCR) 2 nãodiarreicos não diarreicos diarréia 1 nãodiarreicas. nãodiarreicas diarreicas. diarreicas não-diarreicas M3105 12 20 13 18 M310 M31 M3

ABSTRACT A nested PCR targeted to the S1 ectodomain gene of the spike (S) glycoprotein of coronaviruses was developed to detect bovine coronavirus (BCoV) in stool specimens from cattle. One outer and one internal pair of primers were designed to conserved regions surrounding the hypervariable region of the S gene (GenBank accession No. M31053). Outer primers produced an 885bp-long product (nn 1204 to 2088 from S gene) and the internal primers a 488bp-long product (nn 1329 to 1816 from S gene, internal to the first PCR). Optimal annealing temperatures were tested in a gradient thermocycler and used in the final protocols. Outer primers and the final nested protocol detection limits were tested with the BCoV Kakegawa strain diluted two-fold in BCoV-free stool suspension. The nested PCR assay was tested in 22 clinical stool specimens from calves with or without diarrhea and 1 sample from a diarrheic cow, resulting in 10 positive samples both from diarrheic and non-diarrheic individuals. The nested PCR reported here is a specific and sensitive tool for bovine coronavirus diagnosis. (S (BCoV cattle GenBank No M31053. M31053 M . M31053) 885bplong bplong 885bp long bp nn 120 208 488bplong 488bp 132 181 PCR. PCR) protocols twofold two fold BCoVfree free suspension 2 cow nondiarrheic non individuals diagnosis M3105 12 20 13 18 M310 M31 M3

RESUMO Rotavírus é um agente viral de diarréias neonatais de crianças e de animais jovens de várias espécies, principalmente bezerros e leitões. Este estudo teve por objetivo avaliar a ocorrência de anticorpos anti-rotavírus pela técnica da contraimunoeletroosmoforese (CIEOF) em bovinos criados no Estado de São Paulo. Duzentas amostras de soro foram colhidas em 23 fazendas pertencentes a 19 municípios. A soropositividade total encontrada foi de 77,5% e a positividade média por fazenda foi de 76,57 ± 21,73%. Uma vez que não há vacinas anti-rotavírus de uso regular no Brasil, estes resultados demonstram elevada ocorrência de infecções naturais por rotavírus no Estado de São Paulo. espécies leitões antirotavírus anti CIEOF (CIEOF Paulo 2 1 municípios 775 77 5 77,5 7657 76 57 76,5 2173 21 73 21,73% Brasil 7 77, 765 76, 217 21,73 21,7 21,

ABSTRACT Rotavirus is a worldwide occurring viral agent of neonatal diarrheas of children and the young of many species, mainly calves and piglets. This survey aimed to evaluate the occurrence of antirotavirus antibodies in cattle raised in São Paulo State by the counterimmunoelectroosmophoresis (CIEOP) test. Two hundred serum samples were collected from 23 farms in 19 counties. The total positivity found was 77.5% and the mean farm-level positivity was 76.57 ± 21.73%. Since there are no regular anti-rotavirus vaccines currently available in Brazil, these results show a high occurrence of rotavirus natural infections in São Paulo State. species piglets CIEOP (CIEOP test 2 1 counties 775 77 5 77.5 farmlevel farm level 7657 76 57 76.5 2173 21 73 21.73% anti Brazil 7 77. 765 76. 217 21.73 21.7 21.

RESUMO A disenteria de inverno é uma doença causada por coronavírus bovino (BCV) que afeta vacas adultas, já relatada na Europa, no Japão, no Canada e nos EUA. A existência de infecções entéricas de BCV em vacas, um fato ainda não relatado no Brasil, foi avaliada em 9 amostras fecais em um surto de diarréia durante o inverno, através da técnica de hemaglutinação/ inibição da hemaglutinação, quando 3 amostras foram positivas. Todas as 9 amostras foram negativas para rotavírus em PAGE. Estes resultados, a primeira descrição de BCV em vacas adultas no Hemisfério Sul, demonstram que a disenteria de inverno também ocorre em regiões tropicais e ao sul e que o BCV precisa ser considerado a partir de agora na etiologia das diarréias em bovinos adultos no Brasil. (BCV Europa Japão EUA Brasil hemaglutinação positivas PAGE resultados Sul

ABSTRACT Winter dysentery is a bovine coronavirus (BCV)-caused disease that affects cows reported Europe, Japan, Canada and in the USA. The existence of enteric BCV infections in cows in an outbreak of diarrhea during the winter, a fact not reported in Brazil, has been surveyed in 9 stool samples with hemagglutination/ hemagglutination inhibition test and three were found positive. All 9 samples tested negative for rotavirus in PAGE. These results, the first description of BCV in adult cows in the Southern Hemisphere, show that winter dysentery also occurs in Southern, tropical areas and that BCV needs now to be considered in the aethiology of diarrheas in adult cattle in Brazil. BCVcaused caused Europe Japan USA Brazil positive PAGE results Hemisphere

RESUMO Estudou-se a ocorrência dos rotavírus e dos coronavírus em propriedades de criação de gado bovino leiteiro, localizadas em diversos Municípios do Estado de São Paulo, a partir de amostras fecais diarréicas de bezerros, utilizando como provas diagnósticas a eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e hemaglutinação (HA) / inibição da hemaglutinação (HI), respectivamente para rotavírus e coronavírus. Das 72 amostras amostras fecais, 14% delas apresentaram-se positivas para os rotavírus do sorogrupo A e 39% para coronavírus. Em uma propriedade foram detectadas co-infecções de rotavírus e coronavírus em dois (3%) bezerros. Estes achados confirmaram a participação dos rotavírus e coronavírus na etiologia das diarréias de bezerros na área estudada. Estudouse Estudou se leiteiro Paulo PAGE (PAGE HA (HA HI, HI , (HI) 7 14 apresentaramse apresentaram 39 coinfecções co infecções 3% 3 (3% estudada (HI 1 (3 (

ABSTRACT The occurrence of coronavirus and rotavirus was surveyed using 72 diarrheic stool specimens from calves reared in 12 municipalities of São Paulo State, using haemagglutination (HA) / haemagglutination inhibition (HI) and Polyacrilamide Gel Electrophoresis (PAGE), respectively, for the detection of these agents. An amount of 14% of the samples were positive for serogroup A rotavirus and 39% were positive for Coronavirus. In one farm it was found a rotavirus/ coronavirus co-infection in 2 calves (3%). These results confirmed the participation of rotavirus and coronavirus in the etiology of neonatal calf diarrhea in the surveyed area. 7 1 State HA (HA HI (HI PAGE, PAGE , (PAGE) respectively agents 14 39 Coronavirus coinfection co infection 3%. 3 3% . (3%) area (PAGE (3% (3 (

RESUMO Um método de ELISA policlonal tipo “duplo-sanduíche” foi desenvolvido para a detecção de rotavírus a partir de material fecal. A amostra NCDV de rotavírus do sorogrupo A foi concentrada por ultracentrifugação utilizando-se um colchão de sacarose a 45% (v/v), e inoculada em coelhos e carneiros. Em seguida, a fração IgG oriunda dos soros dos animais foi purificada por cromatografia de troca iônica e absorvida, utilizando-se polímero de glutaraldeído, de modo a eliminar reações inespecíficas. A presença dos rotavírus foi detectada pela IgG de carneiro e revelada pela IgG de coelho, usando-se IgG de cabra anti-IgG de coelho conjugada à peroxidase. Aplicado a um painel constituído de 86 amostras fecais diarréicas de leitões obteve-se 100% de sensibilidade; 98,79% de especificidade, com uma concordância de 98,83%, tendo como prova padrão a eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE). As variâncias entre 86 repetições da mesma amostra foram 0,001 (para a amostra positiva) e 0,0002 (para a amostra negativa). Estes resultados demonstram que este ELISA constitui-se numa alternativa sensível e específica para o diagnóstico de rotavírus a partir de material fecal. duplosanduíche duplo sanduíche “duplo-sanduíche fecal utilizandose utilizando se 45 v/v, vv v/v , v (v/v) carneiros seguida absorvida glutaraldeído inespecíficas usandose usando antiIgG anti peroxidase 8 obtevese obteve 100 sensibilidade 9879 98 79 98,79 especificidade 9883 83 98,83% PAGE. PAGE . (PAGE) 0001 0 001 0,00 positiva 00002 0002 0,000 negativa. negativa negativa) constituise constitui 4 (v/v 10 987 9 7 98,7 988 98,83 (PAGE 000 00 0,0 0000 1 98, 98,8 0,

ABSTRACT There was developed a polyclonal “double-sandwich” antibody ELISA method for detection of rotavirus from stool specimens. The NCDV strain of rotavirus group A was concentrated by ultra-centrifugation using a 45% (v/v) saccharose cushion and inoculated in rabbits and sheep. After that, the IgG of serum samples of the animals was purified by ion-exchange chromatography and absorbed with whole serum of both animal species using a glutaraldehyde polymer, in order to eliminate unspecific reactions. The presence of rotavirus was detected by the sheep’s IgG and revealed by the rabbit’s IgG, using an anti-rabbit IgG peroxidase conjugate developed in goats. When applied in population of 86 fecal samples from piglets with diarrhea, the results of the ELISA were: 100% of sensivity; 98.79% of specificity, with an agreement of 98.83%, using as standard the polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE) test. The variances between 86 repetitions of the same sample were 0.001 (for one positive sample) and 0.0002 (for one negative sample). These results showed that this ELISA is a sensitive and specific alternative test for rotavirus diagnosis from fecal material. doublesandwich double sandwich “double-sandwich specimens ultracentrifugation ultra centrifugation 45 v/v vv v (v/v sheep ionexchange ion exchange polymer reactions sheeps s rabbit antirabbit anti goats 8 diarrhea 100 sensivity 9879 98 79 98.79 specificity 9883 83 98.83% PAGE (PAGE 0001 0 001 0.00 00002 0002 0.000 sample. . material 4 10 987 9 7 98.7 988 98.83 000 00 0.0 0000 1 98. 98.8 0.