RESUMO Conservantes naturais, como exemplo as enterocinas, têm sido foco de diversos estudos para uso na indústria de alimentos. No entanto, os meios comerciais utilizados para obtenção de enterocinas ainda são onerosos, sendo a grande desvantagem para produção em larga escala. Neste estudo foram desenvolvidas quatro formulações de meios de cultura contendo farinha de soja para obtenção de enterocina por Enterococcus durans MF5. A atividade antilisterial da enterocina MF5 obtida em meio soja e MRS (controle) foi testada contra Listeria monocytogenes CLIP2032 e L. innocua CLIP12612. O crescimento de E. durans (UFC/mL) foi significativamente afetado pelo tempo de incubação nos meios soja e MRS (p<0,05), porém a composição do meio não afetou o desenvolvimento celular do microrganismo produtor de enterocina. Ao avaliar os genes que codificam a síntese de enterocina, foram obtidos resultados positivos para enterocina A, B, P e X. Quando tratada com enzimas proteolíticas (α-quimotripsina, protease e proteinase-K), a enterocina foi inativada, confirmando seu caráter proteico. A atividade antilisterial das enterocinas obtidas em meio de soja foi de até 6.400 AU mL-1. Enterocina produzida nos meios de soja M1 e M2 apresentaram atividade antibacteriana na concentração de 1 mg/mL após 6 h de incubação. Assim, mostramos que meios de cultura formulados com farinha de soja são substratos promissores para a produção de enterocinas que permitiriam a expansão do protocolo em larga escala.

ABSTRACT Natural preservatives, such as enterocins, have been the focus of several studies for use in the food industry. However, the commercial media used to obtain enterocins are still expensive, presenting a disadvantage for large-scale production. In this study was developed four formulations of culture media containing soybean flour for obtaining Enterococcus durans enterocins. The antilisterial activity of E. durans MF5 enterocins obtained in soybean and MRS media (control) was characterized, with Listeria monocytogenes CLIP2032 and L. innocua CLIP12612 as the bacterial strains. The growth of E. durans (CFU/mL) was significantly affected by the incubation time in the soybean and MRS media (p <0.05), but the composition of the media did not affect the cell development of the enterocin-producing microorganism. When evaluating the genes encoding enterocin synthesis, positive results were obtained for enterocin A, B, P, and X. When treated with proteolytic enzymes (α-chymotrypsin, protease, and proteinase-K), enterocin was inactivated, confirming its protein character. The antilisterial activity of the enterocins obtained in soybean media was up to 6,400 AU mL-1. Enterocins from soybean media M1 and M2 showed antibacterial activity at a concentration of 1 mg/mL after 6 h incubation. Thus, we show that culture media formulated with soybean flour are promising substrates for enterocin production that would allow the protocol to be expanded on a large scale.

Resumo A natureza ubíqua dos enterococos e sua capacidade de colonizar diferentes habitats são responsáveis pela sua fácil disseminação pela cadeia alimentar. No presente estudo, avaliamos a distribuição e a susceptibilidade antimicrobiana de isolados de Enterococcus provenientes de produtos cárneos. Cem produtos (carne de frango cru, carne de porco crua e carne cozida) foram adquiridos e cultivados para a presença de Enterococcus spp. No total, 194 amostras foram avaliadas, com taxas de contaminação de 63,6% nas amostras de frango, 31% na carne de porco crua e 1,4% nas amostras de carne cozida. A amplificação por PCR foi realizada para confirmar a presença de Enterococcus spp. (95/96), E. faecalis (66/96), E. faecium (30/96) E. casseliflavus/E. flavescens (3/96). Resultados de susceptibilidade mostraram que 100% dos isolados foram resistentes a pelo menos um antibiótico, sendo 100% de E. faecium resistentes a vancomicina, estreptomicina, ciprofloxacina, norfloxacina, eritromicina e tetraciclina. E. casseliflavus / E. flavescens resistentes a gentamicina, estreptomicina, ciprofloxacina, norfloxacina, eritromicina e tetraciclina. E. faecalis foram resistentes a ciprofloxacina, tetraciclina e eritromicina (92%), norfloxacina (83%), vancomicina e estreptomicina (50%). Na genotipagem, foram detectados os genes tetL e vanB. A presença desses microrganismos resistentes aos antimicrobianos nos alimentos pode causar problemas para a saúde pública.

Abstract The ubiquitous nature of enterococci and their ability to colonize different habitats account for their easy spread throughout the food chain. Here, we evaluated the distribution and antimicrobial susceptibility of Enterococcus isolates from meats obtained from different supermarkets. We acquired and cultured 100 products (raw chicken meat, raw pork, and boiled meats) to screen for the presence of Enterococcus spp. In total, 194 isolates were recovered from the samples, with contamination rates of 63.6% in the chicken samples, 31% in the raw pork meat, and 1.4% in the boiled meat samples. PCR amplification with specific primers was performed to screen the DNA of Enterococcus spp. (95/96), E. faecalis (66/96), E. faecium (30/96), and E. casseliflavus/E. flavescens (3/96). The antimicrobial susceptibility tests showed that all the isolates were resistant to at least one of the antibiotics. All E. faecium isolates were resistant to vancomycin, streptomycin, ciprofloxacin, norfloxacin, erythromycin, and tetracycline. The E. casseliflavus/E. flavescens isolates were resistant to gentamicin, streptomycin, ciprofloxacin, norfloxacin, erythromycin, and tetracycline. E. faecalis isolates were resistant to ciprofloxacin, tetracycline, and erythromycin (92%), norfloxacin (83%), vancomycin, and streptomycin (50%). The resistance genes tetL and vanB were detected by genotyping. The presence of these antimicrobial-resistant microorganisms in food might pose problems for public health.

RESUMO: Escherichia coli, produtora de toxina Shiga-like (STEC), apresenta riscos à saúde humana, constituindo uma importante fonte de contaminação na indústria de alimentos. Diversos processos industriais eliminam esse microrganismo, contudo podem alterar as características do produto. Métodos alternativos de conservação tem sido uma opção para controlar esse microrganismo de alimentos. O objetivo desta pesquisa foi avaliar a ação de bacteriocinas produzidas por Enterococcus durans MF5 em células de E. coli STEC. Foram utilizados sobrenadante livre de células (CFS) contendo enterocina, nos tempos 6, 18 e 24 horas de incubação. A enterocina presente no CFS bruto apresentou inibição contra E. coli STEC em todos os tempos testados. Na observação da integridade celular utilizando iodeto de propídio e observação em microscópio de fluorescência, observou-se que em 6h da célula em contato com a enterocina, já havia considerável morte celular, estendendo até os tempos de 18 e 24 horas. Os resultados obtidos mostraram que a enterocina produzida pelo isolado MF5 apresenta uso potencial no controle de E. coli STEC.

ABSTRACT: Shiga-like toxin-producing Escherichia coli (STEC) is an important source of food contamination that presents risks to human health. Several industrial food processes eliminate this microorganism; however, these processes can alter the characteristics of the product. Alternative methods of preservation have been identified as an option to control these foodborne pathogens. The purpose of this study was to evaluate the action of bacteriocins produced by Enterococcus durans MF5 in STEC cells. Cell-free supernatant (CFS) containing enterocins from the MF5 isolate was tested over different time points (6, 18, and 24 h). Enterocins present in the crude CFS showed inhibition against STEC at all time points. In the investigation of cell integrity, using propidium iodide and fluorescence microscopy, considerable cell death was observed within 6 h of the cells being in contact with the enterocins, which was also observed at the 18 and 24 h time points. These results showed that the enterocins produced by the MF5 isolate have potential use in the control of STEC.

Resumo Bacteriocinas são peptídeos antimicrobianos sintetizados nos ribossomos, tendo sido descrita uma grande diversidade de bacteriocinas, as quais diferem entre si quanto a composição de aminoácidos, biossíntese, transporte e modo de ação. Nos alimentos, as bacteriocinas podem ser encontradas naturalmente como produtos da microbiota normal ou introduzida (cultura starter ou probióticos). Devido às suas aplicabilidades frente a organismos patogênicos contaminantes em alimentos, vários estudos têm sido publicados, tornando o uso destes peptídeos uma alternativa aos conservantes químicos tradicionais. Considerando-se as propriedades das bacteriocinas e sua potencial aplicação como bioconservadores de alimentos e alternativa aos antibióticos, o presente estudo busca acercar-se de uma visão geral das bacteriocinas quanto aos aspectos históricos, sistemas de classificação, biossíntese e transporte, modo de ação, abordando também algumas de suas aplicações na indústria de alimentos.

Summary Bacteriocins are antimicrobial peptides synthesized in the ribosomes. A wide variety of bacteriocins have been described, which differ in their amino acid composition, biosynthesis, transport and mode of action. Bacteriocins can be found naturally in foods as products of normal or added (starters or probiotics) microbiota in several preparations. Due to their applicability against pathogenic contaminants in food, various studies have been published making the use of these peptides an alternative to traditional chemical preservatives. Considering the properties of bacteriocins and their potential application as bio-preservatives in foods and alternatives to antibiotics, this study presents an overview of bacteriocins with respect to their historical aspects, classification systems, biosynthesis and transport and mode of action, also presenting some applications in food industries.

Os enterococos são cada vez mais responsáveis por infecções hospitalares em todo o mundo. Este estudo foi realizado para comparar a identificação e perfil de suscetibilidade entre o sistema automatizado MicrosScan e a técnica molecular de PCR em espécies de Enterococcus spp. Foram avaliados 30 isolados clínicos de Enterococcus spp. Os isolados foram identificados pelo sistema MicrosScan® e pela técnica de PCR. A detecção de genes de resistência a antibióticos (vancomicina, gentamicina, tetraciclina e eritromicina) foi determinada por PCR. Suscetibilidades antimicrobianas à vancomicina (30 µg), gentamicina (120 µg), tetraciclina (30 µg) e eritromicina (15 µg), foram testados pelos métodos automatizados e pelo disco difusão, de acordo com as orientações do CLSI. No que diz respeito à identificação de Enterococcus em geral entre os dados obtidos pelo método de PCR e pelo sistema automático foi de 90,0% (27/30). Para todos os isolados de E. faecium e E. faecalis observamos concordância de 100%. Freqüências de resistência foi maior em E. faecium do que em E. faecalis. As taxas de resistência obtidas foi maior para eritromicina (86,7%), vancomicina (80,0%), tetraciclina (43,35%) e gentamicina (33,3%). A correlação entre a técnica de disco difusão e automação revelou-se de acordo para maioria dos antibióticos com taxas > 80%. O gene van(A) foi detectado em 100% dos Enterococcus resistentes á vancomicina. O ensaio baseado em PCR é de simples realização e de confiança para identificação de enterococos clinicamente relevantes. Os dados obtidos reforçam a necessidade de melhoria no sistema automatizado para identificar alguns enterococos.

Enterococci are increasingly responsible for nosocomial infections worldwide. This study was undertaken to compare the identification and susceptibility profile using an automated MicrosScan system, PCR-based assay and disk diffusion assay of Enterococcus spp. We evaluated 30 clinical isolates of Enterococcus spp. Isolates were identified by MicrosScan system and PCR-based assay. The detection of antibiotic resistance genes (vancomycin, gentamicin, tetracycline and erythromycin) was also determined by PCR. Antimicrobial susceptibilities to vancomycin (30 µg), gentamicin (120 µg), tetracycline (30 µg) and erythromycin (15 µg) were tested by the automated system and disk diffusion method, and were interpreted according to the criteria recommended in CLSI guidelines. Concerning Enterococcus identification the general agreement between data obtained by the PCR method and by the automatic system was 90.0% (27/30). For all isolates of E. faecium and E. faecalis we observed 100% agreement. Resistance frequencies were higher in E. faecium than E. faecalis. The resistance rates obtained were higher for erythromycin (86.7%), vancomycin (80.0%), tetracycline (43.35) and gentamicin (33.3%). The correlation between disk diffusion and automation revealed an agreement for the majority of the antibiotics with category agreement rates of > 80%. The PCR-based assay, the van(A) gene was detected in 100% of vancomycin resistant enterococci. This assay is simple to conduct and reliable in the identification of clinically relevant enterococci. The data obtained reinforced the need for an improvement of the automated system to identify some enterococci.

INTRODUÇÃO: Neste estudo objetivamos a identificação de isolados de Candida obtidos de sangue, urina, secreção traqueal e de lesões de unha/pele, de casos atendidos no Hospital Universitário de Londrina num período de três anos. Avaliamos também a suscetibilidade dos isolados ao fluconazol. MÉTODOS: Os isolados de Candida foram identificados pela reação em cadeia da polimerase (RCP) usando oligonucleotídeos iniciadores espécie-específicos. O teste de suscetibilidade in vitro ao fluconazol foi realizado segundo o procedimento de referência EUCAST-AFST. RESULTADOS: Isolados foram obtidos de urina (53,4%), sangue (19,2%), secreção traqueal (17,8%) e lesões de unha/pele (9,6%). Considerando as amostras de urina, a prevalência foi similar em mulheres (45,5%) e em homens (54,5%) e foi alta no grupo de idade > 61 anos do que em grupos mais jovens. Para amostras de sangue a prevalência foi alta em neonatos (35%) e idades avançadas (22,5%). Para amostras de unha e pele a prevalência foi maior em mulheres (71,4%) do que em homens (28,6%). Candida albicans foi a mais frequentemente isolada no hospital, mas outras espécies de Candida corresponderam a 64% dos isolados, incluindo predominantemente Candida tropicalis (33,2%) e Candida parapsilosis (19,2%). A tendência de Candida não-albicans como espécie predominante foi observada para todas as amostras clínicas, exceto para amostras de urina. Todos isolados de Candida foram considerados suscetíveis, in vitro, ao fluconazol com exceção dos isolados pertencentes às espécies intrinsecamente menos suscetíveis C. glabrata. CONCLUSÕES: Espécies de Candida não-albicans foram mais frequentemente isoladas no hospital. Resistência ao fluconazol foi rara no nosso estudo.

INTRODUCTION: In this study, we aimed at identifying Candida isolates obtained from blood, urine, tracheal secretion, and nail/skin lesions from cases attended at the Hospital Universitário de Londrina over a 3-year period and at evaluating fluconazole susceptibilities of the isolates. METHODS: Candida isolates were identified by polymerase chain reaction (PCR) using species-specific forward primers. The in vitro fluconazole susceptibility test was performed according to EUCAST-AFST reference procedure. RESULTS: Isolates were obtained from urine (53.4%), blood cultures (19.2%), tracheal secretion (17.8%), and nail/skin lesions (9.6%). When urine samples were considered, prevalence was similar in women (45.5%) and in men (54.5%) and was high in the age group >61 years than that in younger ones. For blood samples, prevalence was high in neonates (35%) and advanced ages (22.5%). For nail and skin samples, prevalence was higher in women (71.4%) than in men (28.6%). Candida albicans was the most frequently isolated in the hospital, but Candida species other than C. albicans accounted for 64% of isolates, including predominantly Candida tropicalis (33.2%) and Candida parapsilosis (19.2%). The trend for non-albicans Candida as the predominant species was noted from all clinical specimens, except from urine samples. All Candida isolates were considered susceptible in vitro to fluconazole with the exception of isolates belonging to the intrinsically less-susceptible species C. glabrata. CONCLUSIONS: Non-albicans Candida species were more frequently isolated in the hospital. Fluconazole resistance was a rare finding in our study.

O objetivo deste estudo foi avaliar a produção de proteases dos tipos subtilisina [Pr1] e tripsina [Pr2] por duas linhagens do fungo entomopatogênico Nomuraea rileyi e a correlação entre a atividade de Pr1 e a patogenicidade contra Anticarsia gemmatalis. O crescimento do fungo foi realizado em meio mínimo contendo nitrato e suplementado com a cutícula ou exúvia de A. gemmatalis, ou com substrato não cuticular caseína. Em meio contendo nitrato, nenhuma atividade de Pr1 foi detectada nos sobrenadantes das culturas. Entretanto, as duas linhagens de N. rileyi produziram Pr1 em meio suplementado com fonte exógena de nitrogênio, e alta atividade foi verificada na presença da cutícula do inseto. A atividade de Pr2 foi inferior à atividade de Pr1. A análise de correlação entre a atividade de Pr1 da linhagem NR458 e mortalidade de A. gemmatalis sugere uma correlação positiva para essas variáveis. A avaliação da atividade de enzimas em diferentes condições pode ajudar na compreensão do processo infeccioso de N. rileyi em A. gemmatalis.

Nomuraea rileyi represents an important natural control agent of Anticarsia gemmatalis preventing populations from reaching economic threshold levels in soybean. During the processes of host infection, entomopathogenic fungi produce extracellular proteases, which degrade the host cuticle and are suggested to be virulence determinants. It was examined the production of subtilisin-like (Pr1) and trypsin-like (Pr2) proteases in two strains (NR458 and CG434) of N. rileyi and its possible role in the process of pathogenicity to this caterpillar. Fungal growth was performed in a mineral medium containing nitrate, and supplemented with the cuticle or exuviae from A. gemmatalis, or with the non-cuticular substrate casein. In medium containing nitrate as sole nitrogen source, no detectable Pr1-like activity occurred in the culture supernatants of the two fungal strains. However, both strains of N. rileyi produced Pr1-like protease in all medium amended with exogenous nitrogen source, and it was highly expressed in the presence of insect cuticle. Pr2-like activity was significantly inferior to Pr1-like activity and it was detected only in some of the media culture and incubation periods tested. In the NR458 culture supernatant the highest activity was observed in medium containing nitrate as nitrogen source. Correlation analysis between the percentage of A. gemmatalis mortality in bioassays and Pr1-like protease activity of strain NR458 suggests a positive correlation for these variables.

INTRODUÇÃO: Leveduras do gênero Candida são responsáveis pela maioria das infecções fúngicas em humanos. Candida tropicalis tem sido uma das mais comumente isoladas dentre as espécies não-albicans. O objetivo foi analisar a hemólise in vitro promovida por isolados clínicos de C. tropicalis provenientes de sangue e outras amostras clínicas de pacientes internados no Hospital Universitário da UEL, PR-Brasil. MÉTODOS: Foi avaliada a hemólise promovida por 28 isolados clínicos de C. tropicalis, sendo os isolados agrupados em classes de acordo com os níveis de hemólise. RESULTADOS: A maioria dos isolados de sangue apresentou hemólise fraca (+), enquanto as classes de hemólise forte (+++) e muito forte (++++) foram as predominantes nos isolados de outras amostras clínicas como urina, lesão de unha e secreção traqueal, embora não tenham sido detectadas diferenças estatísticas (p>0,05). CONCLUSÕES: Isolados de C. tropicalis, obtidos de diferentes amostras clínicas, apresentam capacidade de promover hemólise in vitro.

INTRODUCTION: Yeasts belonging to the genus Candida are responsible for the majority of fungal infections in humans. Candida tropicalis has been one of most commonly isolated non-albicans species. To analyze in vitro hemolysis promoted by clinical isolates of C. tropicalis obtained from blood and other clinical samples from hospitalized patients at the University Hospital of Londrina State University, Paraná, Brazil. METHODS: The hemolysis promoted by 28 clinical isolates of C. tropicalis was evaluated, and the isolates were grouped into classes according to the hemolysis levels. RESULTS: The majority of the blood isolates showed weak hemolysis (+), while the classes of strong hemolysis (+++) and very strong hemolysis (++++) predominated among isolates from other clinical samples such as urine, nail lesions and tracheal secretions. However, no statistical differences were detected (p> 0.05). CONCLUSIONS: Isolates of C. tropicalis obtained from different clinical samples showed a capacity to promote in vitro hemolysis.

Algumas espécies pertencentes ao gênero Aspergillus possuem potencial para produção de Ocratoxina A (OA), uma micotoxina de efeitos nefrotóxicos, imunossupressivos, teratogênicos e carcinogênicos. Com o objetivo de identificar as espécies de Aspergillus que contaminam o interior de grãos de café, foram coletadas amostras em diferentes estádios de maturação do produto, em 16 propriedades produtoras do norte do estado do Paraná. Um total de 108 isolados de Aspergillus spp. foram identificados ao nível de espécie, pelo sequenciamento dos espaços internos transcritos (ITS1-5,8S-ITS2) do DNA ribossomal (rDNA). Os resultados revelaram a presença de espécies potencialmente ocratoxigênicas em 82% das regiões analisadas, sendo dentre estas, Aspergillus niger a espécie mais freqüentemente detectada,seguida por A. ochraceus, e A. carbonarius. É relatada pela primeira vez a presença de A. carbonarius em frutos de café coletados na árvore.

Some species belonging to the genus Aspergillus are potential producers of ochratoxin A (OA), a mycotoxin with nephrotoxic, immunosuppressive, teratogenic and carcinogenic effects. The aim of the present study was to identify the species of Aspergillus that contaminate the inside of coffee beans collected in the stage of maturation and drying, from 16 producing areas located in the northern region of the State of Paraná, in the South of Brazil. A total of 108 isolates of Aspergillus spp. was identified at the species level, by sequencing the internal transcribed spacer (ITS1-5.8S-ITS2) of ribosomal DNA (rDNA). The results revealed the presence of potentially ochratoxigenic species in 82% of the geographic regions studied, among which Aspergillus niger was the species most frequently detected, followed by A. ochraceus and A. carbonarius. The presence of A. carbonarius in immature coffee fruits harvested from trees is reported for the first time.

As análises de RAPD (Polimorfismo de DNA Amplificado ao Acaso) e ITS (Sequências Internas Transcritas) foram utilizadas para investigar a variabilidade molecular entre isolados de Paecilomyces e para identificar cinco isolados morfologicamente atípicos, obtidos a partir de mosca branca no Norte do Estado do Paraná, que possuíam alguma semelhança com P. fumosoroseus. O produto da amplificação com os primers ITS4 e ITS5 apresentou 700 pares de bases para todos os isolados investigados. Os cinco isolados não identificados deram origem a padrões de restrição idênticos a todas as linhagens de P. fumosoroseus utilizadas como referência. A variabilidade observada nos perfis de RAPD foi suficiente para discriminar todos os isolados. A similaridade genética entre os isolados não identificados e as linhagens de P. fumosoroseus foi maior do que aquela observada entre as linhagens referência desta espécie. Este fato permitiu concluir que os isolados CNPso-P77, CNPso-P78, CNPso-P80, CNPso-P85 and CNPso-P91 pertencem à espécie P. fumosoroseus.

ITS and RAPD analyses were used to investigate molecular variations within samples of Paecilomyces isolates and to resolve five morphologically atypical isolates resembling P. fumosorosus, obtained from whitefly in Northern Paraná State. The ITS4-ITS5 amplicon was 700 base pairs (bp) long in all isolates. The five isolates of Paecilomyces not assigned to species produced restriction profiles identical to all the reference strains of P. fumosoroseus. The extent of fingerprint variability observed by RAPD was sufficient to discriminate all the isolates. The genetic similarity among unidentified isolates and strains of P. fumosoroseus was even higher than that observed among reference strains of this species, allowing us to conclude that isolates CNPso-P77, CNPso-P78, CNPso-P80, CNPso-P85 and CNPso-P91 are P. fumosoroseus.