Abstract (Objective) Trypanosoma cruzi, a causal agent of Chagas’ disease, is a parasite whose life cycle alternates between an invertebrate (triatomine) and a vertebrate (mammal) host. Various studies have shown that in T. cruzi, HSP83 (a homolog of HSP90) is essential for cell division and control of the response to thermal stress. This investigation focused on studying the cloning, bioinformatic characterization, and expression of the heat shock protein HSP83 T. cruzi gene for further cell signaling studies. (Methodology) RNA was extracted from T. cruzi epimastigotes (EPm6 clone, MHOM/VE/2007/ 6c) using a commercial kit. The cDNA encoding HSP83 was determined using RT-PCR on extracted mRNA, for which the primers were designed based on the HSP83 sequence of T. cruzi strain CL Brener. Cloning was performed using pGEM®T-Easy and subcloned into the expression vector pQE30. Sequence and bioinformatic characterization were performed. The gene was expressed, and the recombinant protein was purified using affinity chromatography and identified through immunoblotting. (Results) Sequence analysis showed similarity to the gene encoding HSP83 from Trypanosoma cruzi, and HSP domains and B epitopes in the sequence were also observed. After 3 hours of induction with IPTG, a recombinant protein with an approximate weight of 83 kDa was obtained. The immunoblotting reaction with hyperimmune anti-T. cruzi epimastigote serum helped detect a single band with a molecular weight of nearly 83 kDa. (Conclusions) All results indicate that the cloning and characterization of HSP83 from Trypanosoma cruzi was achieved.

Resumen (Objetivo) Tryapanosoma cruzi, un agente causal de la enfermedad de Chagas, es un parásito que presenta una alternancia en su ciclo de vida entre un hospedador invertebrado (triatomino) y uno vertebrado (mamífero). Varios estudios han demostrado que en T. cruzi, HSP83 (homólogo de HSP90) es esencial para la división celular y el control de la respuesta al estrés térmico. Esta investigación se concentró en el estudio de la clonación, la caracterización bioinformática y la expresión del gen de la proteína de choque térmico HSP83 de T. cruzi para estudios posteriores sobre señalización. (Metodología) El ARN fue extraído de epimagostigotes T. cruci (clon EPm6/MOHM/VE/2007/ 6c), utilizando un kit comercial. El ADNc que codifica HSP83 se obtuvo utilizando RT-PCR, a partir del ARNm extraído, para lo cual se diseñaron los cebadores con base en la secuencia HSP83 de la cepa T. cruzi CL Brener. La clonación se realizó usando pGEM®T-Easy y se subclonó en el vector de expresión pQE30. Se efectuó la caracterización bioinformática y de secuencias. El gen se expresó y la proteína recombinante se purificó por cromatografía de afinidad, igual que se identificó por inmunotransferencia. (Resultados) El análisis de secuencia mostró similitud con el gen HSP83 de Trypanosoma cruzi y se observaron dominios HSP, así como epítopos B en la secuencia. Después de 3 horas de inducción con IPTG, se obtuvo una proteína recombinante con un peso aproximado de 83 kDa. La reacción de inmunotransferencia con suero hiperinmune anti-epimastigote de T. cruzi permitió la detección de una sola banda con un peso molecular de aproximadamente 83 kDa. (Conclusiones) Todos los resultados indican que se logró la clonación y caracterización de HSP83 de Trypanosoma cruzi.

Resumo (Objetivo) O Tryapanosoma cruzi, agente causador da doença de Chagas, é um parasita que apresenta uma alternância em seu ciclo de vida entre um hospedeiro invertebrado triatomíneo) e um vertebrado(mamífero). Vários estudos demonstraram que, no T. cruzi, a HSP83 (homóloga da HSP90) é essencial para a divisão celular e o controle da resposta ao estresse térmico. Esta pesquisa concentrou-se no estudo da clonagem, caracterização bioinformática e expressão do gene da proteína de choque térmico HSP83 do T. cruzi para estudos adicionais de sinalização. (Metodologia) O RNA foi extraído de epimastigotas de T. cruzi (clone EPm6/MOHM/VE/2007/ 6c) usando um kit comercial. O cDNA que codifica a HSP83 foi obtido por meio de RT-PCR a partir do mRNA extraído, para o qual os primers foram projetados com base na sequência da HSP83 da cepa T. cruzi CL Brener. A clonagem foi realizada com o pGEM®T-Easy e subclonada no vetor de expressão pQE30. Foi realizada a caracterização bioinformática e de sequência. O gene foi expresso e a proteína recombinante foi purificada por cromatografia de afinidade e identificada por imunotransferência. (Resultados) A análise da sequência mostrou similaridade com o gene HSP83 do Trypanosoma cruzi e os domínios HSP, bem como os epítopos B, foram observados na sequência. Após 3 horas de indução com IPTG, foi obtida uma proteína recombinante com peso aproximado de 83 kDa. A imunotransferência com soro hiperimune antiepimastigota de T. cruzi permitiu a detecção de uma única banda com peso molecular de aproximadamente 83 kDa. (Conclusões) Todos os resultados indicam que a clonagem e a caracterização da HSP83 do Trypanosoma cruzi foram alcançadas.

Resumen Los cisticercos de Taenia solium causan cisticercosis, y la neurocisticercosis (NCC) es la principal patología. La caracterización de genes es fundamental para el conocimiento de la biología del parásito, la relación parásitohospedador y la identificación de posibles dianas de diagnóstico, tratamiento y protección. El objetivo de este trabajo fue la caracterización molecular y bioinformática, de tres ADN complementarios (ADNc) (TsTF10, TsAAP8 y TsrGAP8), obtenidos por cribado por PCR de una genoteca de Taenia solium. Las secuencias se compararon con las de las bases de datos de ácidos nucleicos y proteínas (GenBank, EMBL) y se analizaron mediante programas bioinformáticos (CDD-Search del Centro Nacional de Información Biotecnológica, Interpro del Instituto Europeo de Bioinformática, Motif scan y Sistema de Análisis de Proteínas del Instituto Suizo de Bioinformatica). Teniendo en cuenta las altas identidades con moléculas similares de helmintos relacionados (Taenia asiatica, Echinococcus granulosus, E. multilocularis e Hymenolepis diminuta) y los dominios funcionales encontrados, los genes de Taenia, TsTF10, TsAAP8 y TsrGAP8 podrían actuar como un factor de transcripción nuclear gamma, una supuesta proteína asociada a ATPasa vacuolar de membrana y una proteína activadora de Rho GTPasa, respectivamente. Aunque pocos epítopos B pudieron predecirse en las secuencias, podría ser relevante valorarlos como posibles candidatos para diagnóstico y protección en cisticercosis. La caracterización y análisis de estas secuencias y la predicción de su posible utilidad como antígenos, vacunas o dianas terapéuticas ayudan al diseño y planificación de estudios futuros.

Resumo Os cisticercos da Taenia solium causam cisticercose, e a neurocisticercose (NCC) é a principal patologia. A caracterização dos genes é fundamental para o conhecimento da biologia do parasita, da relação parasitahospedeiro e da identificação de possíveis alvos de diagnóstico, tratamento e proteção. O objetivo deste trabalho foi a caracterização molecular e bioinformática de três DNA complementar (cDNA) (TsTF10, TsAAP8 e TsrGAP8), obtidos pela triagem de PCR de uma biblioteca de DNA de Taenia solium. As sequências foram comparadas com as dos bancos de dados de ácidos nucleicos e proteína (GenBank, EMBL) e analisadas por meio de programas de bioinformática (CDD-Search do Centro Nacional de Informações Biotecnológicas, Interpro do Instituto Europeu de Bioinformática, Motif scan e Sistema de Análise de Proteínas do Instituto Suíço de Bioinformática). Considerando as altas identidades com moléculas semelhantes de helmintos relacionados (Taenia asiatica, Echinococcus granulosus, E. multilocularis e Hymenolepis diminuta) e os domínios funcionais encontrados, os genes de Taenia, TsTF10, TsAAP8 e TsrGAP8 poderiam atuar como um fator de transcrição nuclear gama, uma suposta proteína associada à ATPase vacuolar de membrana ATPase e uma proteína ativadora de Rho GTPase, respectivamente. Embora poucos epítopos B pudessem ser previstos nas sequências, poderia ser relevante avaliá-los como possíveis candidatos ao diagnóstico e à proteção em cisticercose. A caracterização e análise dessas sequências e a previsão de sua possível utilidade como antígenos, vacinas ou alvos terapêuticos ajudam no desenho e planejamento de estudos futuros.

Abstract Cysticerci or metacestodes of Taenia solium cause cysticercosis, being the neurocysticercosis (NCC) the main pathology. The characterization of genes is essential for the knowledge of parasite biology, the understanding of the parasite-host relationship, and the identification of possible targets for diagnosis, treatment, and protection. The objective of this work was the molecular and bioinformatic characterization of three news cDNAs (TsTF10, TsAAP8, and TsrGAP8), obtained by spliced leader-PCR screening of a Taenia solium cDNA library. The sequences of the three cDNA were compared with the sequences in the nucleic acid and protein databases (GenBank, EMBL) and analyzed by bioinformatic programs (CDD-Search of the National Center for Biotechnology Information, Interpro of the European Bioinformatics Institute, Motif scan and Expert Protein Analysis System of the Proteomics Server from Swiss Institute of Bioinformatics). Considering the high identities with similar molecules of related helminths (Taenia asiatica, Echinococcus granulosus, Echinococcus multilocularis, and Hymenolepis diminuta) and the functional domains found, the TsTF10, TsAAP8, and TsrGAP8 genes of Taenia could act as a nuclear transcription factor gamma, a putative vacuolar ATPase membrane sector associated protein and a Rho GTPase activating protein, respectively. Although few B epitopes could be predicted in the sequences, it could be relevant to evaluate them as possible candidates for diagnosis and protection in cysticercosis. The characterization and analysis of these sequences and the prediction of their possible usefulness as antigens, vaccines, or therapeutic targetscontribute to the designing and planning of future studies.

ABSTRACT The objective of this study was to determine ocular manifestations of toxocariasis in schoolchildren. A study was conducted in two schools in the Anzoátegui state in Venezuela in 2019. The ELISA test was used to determine IgG antibodies against Toxocara spp. The families completed a questionnaire, and the children were clinically evaluated by pediatricians and ophthalmologists. 118 children participated, 18.6% presented anti-Toxocara spp. The clinical manifestations with a statistically significant association were allergic reactions, epiphora, and decreased visual acuity. The ophthalmological evaluation found keratitis, uveitis, iritis, retinal granuloma, endophthalmitis, amaurosis, leukocoria, retinal detachment and endotropia. The findings show a high frequency of eye disease in children with toxocariasis from a state of Venezuela.

RESUMEN El objetivo de este estudio fue determinar manifestaciones oculares de la toxocariasis en escolares. Se realizó un estudio en dos escuelas del estado Anzoátegui en Venezuela en el 2019. Se empleó la prueba de ELISA para determinar los anticuerpos IgG contra Toxocara spp. Las familias completaron un cuestionario y los niños fueron evaluados clínicamente por pediatras y oftalmólogos. Participaron 118 niños, el 18,6% presentó anticuerpos anti-Toxocara spp. Las manifestaciones clínicas con asociación estadísticamente significativa fueron las reacciones alérgicas, epífora y disminución de la agudeza visual. En la evaluación oftalmológica se encontró queratitis, uveítis, iritis, granuloma retiniano, endoftalmitis, amaurosis, leucocoria, desprendimiento de retina y endotropía. Los hallazgos muestran una alta frecuencia de enfermedad ocular en niños con toxocariasis de un estado de Venezuela.

ABSTRACT The objective of this study was to determine ocular manifestations of toxocariasis in schoolchildren. A study was conducted in two schools in the Anzoátegui state in Venezuela in 2019. The ELISA test was used to determine IgG antibodies against Toxocara spp. The families completed a questionnaire, and the children were clinically evaluated by pediatricians and ophthalmologists. 118 children participated, 18.6% presented anti-Toxocara spp. The clinical manifestations with a statistically significant association were allergic reactions, epiphora, and decreased visual acuity. The ophthalmological evaluation found keratitis, uveitis, iritis, retinal granuloma, endophthalmitis, amaurosis, leukocoria, retinal detachment and endotropia. The findings show a high frequency of eye disease in children with toxocariasis from a state of Venezuela.

RESUMEN El objetivo de este estudio fue determinar manifestaciones oculares de la toxocariasis en escolares. Se realizó un estudio en dos escuelas del estado Anzoátegui en Venezuela en el 2019. Se empleó la prueba de ELISA para determinar los anticuerpos IgG contra Toxocara spp. Las familias completaron un cuestionario y los niños fueron evaluados clínicamente por pediatras y oftalmólogos. Participaron 118 niños, el 18,6% presentó anticuerpos anti-Toxocara spp. Las manifestaciones clínicas con asociación estadísticamente significativa fueron las reacciones alérgicas, epífora y disminución de la agudeza visual. En la evaluación oftalmológica se encontró queratitis, uveítis, iritis, granuloma retiniano, endoftalmitis, amaurosis, leucocoria, desprendimiento de retina y endotropía. Los hallazgos muestran una alta frecuencia de enfermedad ocular en niños con toxocariasis de un estado de Venezuela.

ABSTRACT Introduction To know the natural infestation by triatominae and their infection by Trypanosoma cruzi (T. cruzi) in Acrocomia Aculeata (A. aculeata) or coyol palm in the state of Anzoátegui, Venezuela. Materials and Methods Triatominic infestation and its infection by T. cruzi was studied in non-affected A. aculeata in phytosanitary campaigns. The presence of the parasite was determined by microscopy and PCR-kDNA, and its characterization was made by means of molecular markers. Results Fourteen palm trees with triatominic infestation were found; 48.8% of the individuals corresponded to Rhodnius prolixus and 48.2% to Maculata Triatoma, with ontogenetic development towards adult. The parasitology and molecular tests, their typical morphology and the infection in the murine model revealed the presence of T. cruzi in an average of 54,8%, for both species of triatominae, with circulation of the TcI genotype of T. cruzi. Conclusions The infestation of coyol palm trees with Rhodnius prolixus and Maculata Triatoma was reported for the state of Anzoátegui in Venezuela, as well as the presence of TcI sub-populations of T. cruzi, being this palm tree the peridomicilar habitat of the triatominae-T. cruzi binomial and possible bioindicador of risk of infection for surrounding human populations.

RESUMEN Objetivos Conocer la infestación natural por triatominos y su infección por Trypanosoma cruzi (T. cruzi) en Acrocomia aculeata (A. aculeata) o palma corozo en el estado Anzoátegui, Venezuela. Materiales y métodos Se estudió la infestación triatomínica y su infección por T. cruzi en A. aculeata desafectadas en campañas fitosanitarias. La presencia del parásito se determinó por microscopia y PCR-kDNA, y se realizó su caracterización mediante marcadores moleculares. Resultados Se encontraron 14 palmeras con infestación triatomínica, el 48,8 % de los ejemplares correspondieron a Rhodnius prolixus y el 48,2 % a Triatoma maculata, con desarrollo ontogénico hacia el adulto. Las pruebas parasitológicas y moleculares, su morfología típica y la infección en el modelo murino revelaron la presencia de T. cruzi en 54,8 % en promedio, para ambas especies de triatominos, con circulación del genotipo TcI de T. cruzi. Conclusiónes Se reportó para el estado Anzoátegui en Venezuela, la infestación de palma corozo con Rhodnius prolixus y Triatoma maculata y la presencia de subpoblaciones TcI de T. cruzi, siendo esta palma el hábitat peridomiciliar del binomio triatominos-T. cruzi y posible bioindicador de riesgo de infección para poblaciones humanas circunvecinas.

Introduction. To know the natural infestation by triatominae and their infection by Trypanosoma cruzi (T. cruzi) in Acrocomia Aculeata (A. aculeata) or coyol palm in the state of Anzoátegui, Venezuela. Materials and Methods. Triatominic infestation and its infection by T. cruzi was studied in non-affected A. aculeata in phytosanitary campaigns. The presence of the parasite was determined by microscopy and PCR-kDNA, and its characterization was made by means of molecular markers. Results. Fourteen palm trees with triatominic infestation were found; 48.8% of the individuals corresponded to Rhodnius prolixus and 48.2% to Maculata Triatoma, with ontogenetic development towards adult. The parasitology and molecular tests, their typical morphology and the infection in the murine model revealed the presence of T. cruzi in an average of 54,8%, for both species of triatominae, with circulation of the TcI genotype of T. cruzi. Conclusions. The infestation of coyol palm trees with Rhodnius prolixus and Maculata Triatoma was reported for the state of Anzoátegui in Venezuela, as well as the presence of TcI sub-populations of T. cruzi, being this palm tree the peridomicilar habitat of the triatominae-T. cruzi binomial and possible bioindicador of risk of infection for surrounding human populations.

Objetivos. Conocer la infestación natural por triatominos y su infección por Trypanosoma cruzi (T. cruzi) en Acrocomia aculeata (A. aculeata) o palma corozo en el estado Anzoátegui, Venezuela. Materiales y métodos. Se estudió la infestación triatomínica y su infección por T. cruzi en A. aculeata desafectadas en campañas fitosanitarias. La presencia del parásito se determinó por microscopia y PCR-kDNA, y se realizó su caracterización mediante marcadores moleculares. Resultados. Se encontraron 14 palmeras con infestación triatomínica, el 48,8 % de los ejemplares correspondieron a Rhodnius prolixus y el 48,2 % a Triatoma maculata, con desarrollo ontogénico hacia el adulto. Las pruebas parasitológicas y moleculares, su morfología típica y la infección en el modelo murino revelaron la presencia de T. cruzi en 54,8 % en promedio, para ambas especies de triatominos, con circulación del genotipo TcI de T. cruzi. Conclusiónes. Se reportó para el estado Anzoátegui en Venezuela, la infestación de palma corozo con Rhodnius prolixus y Triatoma maculata y la presencia de subpoblaciones TcI de T. cruzi, siendo esta palma el hábitat peridomiciliar del binomio triatominos-T. cruzi y posible bioindicador de riesgo de infección para poblaciones humanas circunvecinas.

BACKGROUND The transmission routes for American cutaneous leishmaniasis (ACL) are in flux, so studies examining its transmission in humans, mammalian hosts, and sand fly vectors are urgently needed. OBJECTIVES The aim of this work was understand the epidemiological cycles of Leishmania spp., which causes ACL in the Andean Region of Venezuela, by identifying the Leishmania and the sand fly species involved in human and dog infections. METHODS Thirty-one biopsies from patients in Mérida and Táchira states with suspected ACL were studied by both parasitological tests (cultures and hamster inoculation) and a molecular test [Internal transcribed spacer 1 (ITS1) nested polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP)]. We also conducted a survey to detect Leishmania infection in dogs (Immunifluorescence antibody test and ITS1 nested PCR-RFLP) and sand flies (ITS1 nested PCR-RFLP) from El Carrizal, a highly endemic focus of ACL in Venezuela. FINDINGS Three different Leishmania species were identified in the clinical samples from humans (Leishmania braziliensis, L. guyanensis, and L. mexicana) and dogs (L. guyanensis and L. mexicana). The predominant sand fly species found were those from the Verrucarum group (infected with L. mexicana) and Lutzomyia migonei (infected with L. guyanensis and L. mexicana). MAIN CONCLUSIONS We show that Lu. migonei may be the putative vector in two ACL epidemiological cycles, involving L. guyanensis and L. mexicana. We also report for the first time the presence of L. guyanensis in domestic animals.

Resumen Introducción. La cisticercosis es causada por las larvas de Taenia solium, las cuales se localizan principalmente en el sistema nervioso central y causan neurocisticercosis. En Venezuela se han hecho pocos estudios epidemiológicos de esta enfermedad. Objetivo. Determinar la seroprevalencia y los factores de riesgo de la cisticercosis en dos comunidades rurales del estado Anzoátegui, Venezuela. Materiales y métodos. Se hizo una encuesta para recolectar datos sobre los posibles factores de riesgo y los signos y síntomas de la enfermedad, y se tomaron 182 muestras de los habitantes de las comunidades de Boquerón y Punto Lindo. Se determinaron los anticuerpos IgG contra cisticercos de T. solium mediante ensayo inmunoenzimático (ELISA). Resultados. En Boquerón, se presentó una seroprevalencia de 3,3 %; debido al bajo número de muestras positivas no se pudo hacer el análisis estadístico. Sin embargo, las tres personas positivas tenían conocimiento de la enfermedad, antecedentes de tenencia de cerdos no confinados, consumo de carne de cerdo semicruda y cefalea frecuente. En Punto Lindo, la seroprevalencia fue de 28,9 %. No hubo diferencias estadísticamente significativas en cuanto al sexo y la edad, sin embargo, se encontró mayor frecuencia en menores de 20 años. Con respecto a los factores de riesgo y los signos y síntomas, se encontró asociación significativa con el consumo de carne de cerdo semicruda (odds ratio, OR=18; IC95% 5,78-55,9), cefalea frecuente (OR=3,6; IC95% 1,15-11,4), convulsiones (OR=18,9; IC95% 2,15-166,5) y problemas de visión (OR=5,7; IC95% 2,13-15,34). Conclusión. Los resultados demostraron que había poca transmisión de cisticercosis en Boquerón, pero mucha en Punto Lindo, sobre todo en niños, lo cual sugeriría que se trata de transmisión reciente.

Abstract Introduction: Cysticercosis is caused by Taenia solium cysticerci, which are located mainly in the central nervous system causing neurocysticercosis. In Venezuela, few epidemiological studies on this disease have been conducted. Objective: To determine the seroprevalence and risk factors for cysticercosis in two rural communities in Anzoátegui state. Material and methods: We conducted a survey to collect data on possible risk factors and signs and symptoms of the disease, and we took 182 samples in two communities, Boquerón and Punto Lindo. Detection of IgG antibodies against T. solium cysticerci was performed by ELISA. Results: Seroprevalence in Boquerón was 3.3%; due to the low number of seropositives the statistical analysis was not possible. However, the three seropositive persons had knowledge of the disease, and a history of consumption of undercooked pork meat, and presence of headache. In Punto Lindo, seroprevalence was 28.9%. There were no significant differences by sex or age; however, we found more seropositives among individuals younger than 20 years. With regard to risk factors and signs and symptoms, significant associations were found with consumption of undercooked pork (OR=18; 95% CI: 5.78 to 55.9), headaches (OR=3.6; 95% CI: 1.15 to 11.4), seizures (OR=18.9; 95% CI: 2.15 to 166.5) and visual problems (OR=5.7; 95% CI: 2.13 to 15.34). Conclusions: The results showed low transmission of cysticercosis in Boquerón, and high in Punto Lindo, where the high prevalence in children suggests recent transmission.

Las infecciones por virus Dengue (DENV) representan un grave problema de salud pública debido a las altas tasas de morbilidad y mortalidad que causan, además no cuentan con tratamiento clínico específico, ni vacuna. Con el fin de reforzar el diagnóstico de laboratorio para los sistemas de vigilancia epidemiológica en países tropicales con recursos económicos limitados, se optimizó una metodología utilizando papel de filtro para la recolección de muestras y el subsiguiente diagnóstico molecular de los serotipos de DENV. Se emplearon cepas controles correspondientes a todos los serotipos virales, así como 35 muestras de sangre total dispensadas en papel de filtro que fueron mantenidas a temperatura ambiente por 36 meses. Las muestras fueron analizadas mediante RT-PCR para la amplificación de la región del genoma correspondiente a 5´UTR-C de los DENV. Los resultados mostraron la amplificación de los mencionados fragmentos en 88,6% de las muestras analizadas, así como de las cepas controles. Estos resultados evidenciaron la utilidad del papel de filtro para conservación de muestras obtenidas de pacientes con sospecha clínica de dengue ubicados en zonas donde no es posible realizar análisis de laboratorio de forma inmediata, así como su uso para el diagnóstico molecular. De este modo se reforzaría la vigilancia en áreas, donde no hay laboratorios con capacidad para confirmar casos de DENV.

Dengue virus infections (DENV) are a severe public health problem due to the high rates of morbidity and mortality involved, and the fact that no clinical treatment or vaccines are available. In order to strengthen the laboratory diagnosis for surveillance systems in tropical countries with low resources, we report an optimized method using filter paper for blood spotting and subsequent molecular diagnosis of DENV serotypes. Control strains of all serotypes, as well as 35 whole blood patient samples dispensed on filter paper, were stored at room temperature for as long as 36 months. RT-PCR of 5’UTR-C fragment was amplified through adapted protocols to diagnose all dengue serotypes. Results showed amplification for all four viral serotypes, including control viral strains and 88.6 % of the samples. These results allowed determining the utility of filter paper for the preservation of samples regularly obtained from patients with clinical suspicion of dengue in settings where low resources do not permit an immediate analysis of the samples. Likewise, this study evidence the possibility of molecular diagnosis of DENV from multiple areas of the world where there are no laboratories with the capacity to confirm DENV cases.

ABSTRACT The purpose of the study was to obtain a positive control to validate molecular techniques (reverse transcription- polymerase chain reaction [RT-PCR]) used in the diagnosis and research of viral infections. From strains of Chikungunya virus (CHIKV), Zika virus, and Dengue virus (DENV-1, DENV-2, DENV- 3, and DENV-4) viral RNAs were extracted to obtain complementary DNA using RT-PCR from the nsP4 (CHIKV), NS5 (Zika virus), C/prM-M, and 5′UTR-C (DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4) sequences, which were cloned into pGEM®-T Easy. Cloning was confirmed through colony PCR, from which plasmid DNA was extracted for fragment cloning verification. Cloning of cDNA corresponding to nsP4, NS5, C/prM-M, and 5′UTR-C of the different viral agents was achieved. In conclusion, recombinant plasmids were obtained with each of the sequences specified for further assessment as positive controls in molecular techniques in an effort to avoid the use of cell cultures, which can be costly, time-consuming, and potentially dangerous.

RESUMEN El objetivo de la investigación fue obtener controles positivos para la validación de técnicas moleculares (RT-PCR) utilizadas en diagnóstico e investigación de infecciones virales. A partir de cepas de CHIKV, Zika, DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4, se extrajeron ARN virales para obtener por RT-PCR los ADN complementarios (ADNc) de las secuencias nsP4 (CHIKV), NS5 (virus Zika), C/prM-M y 5´UTR-C (DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4) que fueron clonados en pGEM®-T Easy. La clonación se confirmó mediante PCR de colonias, de las cuales se extrajo el ADN plasmídico para la verificación de la clonación de los fragmentos. Se logró la clonación de ADNc correspondientes a nsP4, NS5, C/prM-M y 5´UTR-C de los distintos agentes virales. En conclusión se obtuvieron los plásmidos recombinantes con cada una de las secuencias especificadas para su posterior valoración como controles positivos en técnicas moleculares, evitando el uso de cultivos celulares que pueden resultar costosos, laboriosos y potencialmente peligrosos.

The purpose of the study was to obtain a positive control to validate molecular techniques (reverse transcription- polymerase chain reaction [RT-PCR]) used in the diagnosis and research of viral infections. From strains of Chikungunya virus (CHIKV), Zika virus, and Dengue virus (DENV-1, DENV-2, DENV- 3, and DENV-4) viral RNAs were extracted to obtain complementary DNA using RT-PCR from the nsP4 (CHIKV), NS5 (Zika virus), C/prM-M, and 5′UTR-C (DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4) sequences, which were cloned into pGEM®-T Easy. Cloning was confirmed through colony PCR, from which plasmid DNA was extracted for fragment cloning verification. Cloning of cDNA corresponding to nsP4, NS5, C/prM-M, and 5′UTR-C of the different viral agents was achieved. In conclusion, recombinant plasmids were obtained with each of the sequences specified for further assessment as positive controls in molecular techniques in an effort to avoid the use of cell cultures, which can be costly, time-consuming, and potentially dangerous.

El objetivo de la investigación fue obtener controles positivos para la validación de técnicas moleculares (RT-PCR) utilizadas en diagnóstico e investigación de infecciones virales. A partir de cepas de CHIKV, Zika, DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4, se extrajeron ARN virales para obtener por RT-PCR los ADN complementarios (ADNc) de las secuencias nsP4 (CHIKV), NS5 (virus Zika), C/prM-M y 5´UTR-C (DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4) que fueron clonados en pGEM®-T Easy. La clonación se confirmó mediante PCR de colonias, de las cuales se extrajo el ADN plasmídico para la verificación de la clonación de los fragmentos. Se logró la clonación de ADNc correspondientes a nsP4, NS5, C/prM-M y 5´UTR-C de los distintos agentes virales. En conclusión se obtuvieron los plásmidos recombinantes con cada una de las secuencias especificadas para su posterior valoración como controles positivos en técnicas moleculares, evitando el uso de cultivos celulares que pueden resultar costosos, laboriosos y potencialmente peligrosos.

La enfermedad de Chagas es causada por el parásito Trypanosoma cruzi y comprende una fase aguda, seguida de una fase crónica, con una parasitemia escasa y una clínica que va desde la ausencia de síntomas hasta una cardiopatía severa. El diagnóstico presenta limitaciones, debido a la baja sensibilidad de las técnicas parasitológicas y la baja especificidad de las inmunológicas. Las técnicas moleculares, especialmente la PCR, que detecta secuencias específicas de ADN del parásito, es una alternativa. Se han descrito varias dianas de amplificación, siendo las más utilizadas, por su alta sensibilidad y especificidad, las PCR que amplifican el ADN satélite y el ADN de minicírculo de kinetoplasto de T. cruzi. Aunque la técnica de PCR también tiene algunas limitaciones en cuanto a costo, infraestructura necesaria y sensibilidad en fase crónica de la enfermedad, tiene muchas ventajas especialmente en casos agudos, en Chagas congénito, en inmunodeficiencias y resultan adecuadas en la evaluación y seguimiento del tratamiento. Se han desarrollado algunas variantes más avanzadas como PCR a tiempo real, la amplificación isotérmica y la detección de los productos de PCR mediante tiras cromatográficas. Lo más adecuado sería combinar el uso de las técnicas parasitológicas, inmunológicas y moleculares de acuerdo a la fase de la enfermedad que se sospecha y las características del paciente. En Venezuela, las técnicas moleculares para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas, solo se utilizan en laboratorios de investigación, sería recomendable su incorporación al grupo de pruebas diagnósticas de la enfermedad de Chagas en el país.

Chagas disease is caused by the parasite Trypanosoma cruzi and includes an acute phase followed by a chronic phase, with low parasitemia and clinical manifestations range from no symptoms to severe heart disease. Diagnosis has limitations due to the low sensitivity of the parasitological techniques and the low specificity of immunological ones. Molecular techniques, especially PCR, that detects specific DNA sequences of the parasite, is an alternative. Several targets have been described for amplification, the most used because of its high sensitivity and specificity are the PCR that amplified satellite DNA and minicircle kinetoplast DNA of T. cruzi. Although the PCR technique also has some limitations in terms of cost, infrastructure needed and sensitivity in the chronic phase of the disease, has many advantages, especially in acute cases, congenital Chagas, in immunodeficiencies and are appropriate in the evaluation and monitoring of treatment. More advanced variants have been developed, such as; real time PCR, isothermal amplification and detection of PCR products by chromatographic strips. It would be appropriate to combine the use of parasitological, immunological and molecular techniques according to the suspected phase of the disease and patient characteristics. In Venezuela, the molecular techniques for diagnosis of Chagas disease are only used in research laboratories. It would be advisable to incorporate the molecular diagnostic tests to the group of techniques.for diagnosis of Chagas disease in the country.

La leishmaniasis es una enfermedad con diversidad clínica y epidemiológica, producida por varias especies de protozoarios parásitos del género Leishmania. Estos parásitos infectan una amplia variedad de hospedadores mamíferos y son transmitidos por insectos del género Lutzomyia, en nuestro país. Los caninos han sido implicados como posibles reservorios del parásito. Para el diagnóstico de leishmaniasis se utilizan técnicas parasitológicas que generalmente tienen baja sensibilidad e inmunológicas, con pobre especificidad. Debido a las limitaciones en el diagnóstico, y lo difícil de la obtención, transporte y almacenamiento de las muestras, en este trabajo se planteó estandarizar de una técnica de PCR anidada (Leishmania nested PCR, Ln-PCR) para la detección de ADN de Leishmania sp. en muestras de sangre de caninos colectadas en papel de filtro. Para ello se titularon las concentraciones de reactivos de la PCR para la amplificación del ADN del parásito y se determinó la sensibilidad analítica y la especificidad de la técnica. Se evaluaron 36 muestras de sangre de caninos (6 infectados y 30 no infectados). Las condiciones óptimas de reacción fueron 0,2 mM de dNTPs, 0,4 µM de cada cebador y 1 U de Taq polimerasa. La sensibilidad analítica de Ln-PCR fue de 10 fg y la especificidad fue de 100% en la detección de ADN de Leishmania sp., ya que no se observó amplificación con ADN de otros parásitos, ni con ADN humano, ni de perro. De las muestras de caninos evaluadas los seis controles infectados todos amplificaron por la PCR, mientras que los 30 no infectados, en ninguno se observó amplificación. La extracción de ADN de muestras de sangre colectadas en papel de filtro fue eficiente para la amplificación por la PCR, técnica que puede ser muy útil para el diagnóstico de leishmaniasis en animales y su implicación como posibles reservorios.

Leishmaniasis is a disease with clinical and epidemiological diversity, caused by several species of protozoan parasites of the genus Leishmania. These parasites infect a wide variety of mammalian hosts, and are transmitted by insects of the genus Lutzomyia in our country. Canines have been implicated as potential reservoirs of the parasite. For the diagnosis of leishmaniasis, parasitological techniques generally with low sensitivity and immunological techniques, with poor specificity, are used. Because of limitations in the diagnosis, and the difficulty to obtain, transport, and store samples, the aim of this research was to standardize a Leishmania nested PCR test (Ln-PCR), for the detection of Leishmania sp. DNA in blood samples from dogs collected in filter paper. For that purpose, concentrations of the PCR reagent for DNA parasite amplification were titrated and the analytical sensitivity and specificity of the technique were determined. A total of 36 canine blood samples (6 infected and 30 uninfected) were evaluated.  The optimal reaction conditions were: 0.2 mM dNTPs; 0.4 µM of each primer; and 1 U of Taq polymerase. The analytical sensitivity of the Ln-PCR was 10 fg and the specificity was 100% in detecting Leishmania sp. DNA, since no amplification was observed with DNA from other parasites, human DNA or canine DNA. The six samples from infected canines evaluated amplified Leishmania sp. DNA by PCR, whereas in none of the 30 samples from uninfected canines the amplification was observed. The DNA extraction from blood samples collected in filter paper was efficient for the PCR amplification, a technique that can be very useful for the diagnosis of leishmaniasis in animals and their involvement as potential reservoirs.

La neurocisticercosis es una enfermedad neurológica causada por la presencia de cisticercos de Taenia solium en el sistema nervioso central. La clonación de genes del parásito es importante para la identificación y estudio de moléculas claves en la biología del parásito, en diagnóstico, protección y en las relaciones parásito-hospedador. En T. solium, ocurre un mecanismo alternativo en el procesamiento de algunos ARNm, denominado trans-splicing, en el cual una pequeña molécula de ARN (Spliced Leader, SL) es añadida al extremo 5´ de una molécula de pre-ARNm, formando diferentes ARNm maduros que contienen un extremo 5´ común. El objetivo de este trabajó fue realizar el análisis de las secuencias de algunas moléculas que utilizan este procesamiento, para conocer mejor este mecanismo en T. solium. Para ello, se realizó un cribado mediante PCR de genotecas de expresión de cisticerco de T. solium utilizando como cebador directo SL y como reverso ZAP-3´UP, oligonucleótido que hibrida con la secuencia del vector. Se obtuvieron diferentes ADN complementarios (ADNc), que fueron clonados en el plásmido pGEM-T-easy, secuenciados y comparados con las bases de datos (GenBank). Un total de 14 moléculas diferentes fueron obtenidas, las cuales muestran similitud principalmente con proteínas de T. solium, Echinococcus sp. e Hymenolepis sp. Se obtuvieron transcriptos completos que codifican una variedad de proteínas que forman parte de la biología propia de organismos vivos, tales como; enzimas, transportadores, proteínas estructurales, entre otras. Aunque no fue posible determinar si existen grupos específicos de ADNc (con funciones comunes), escogidos para llevar a cabo esta modificación post-transcripcional, se pudo observar que el proceso de trans-splicing ocurre en una gran variedad de ARN que codifican diferentes proteínas de importancia biológica para T. solium.

Neurocysticercosis is a neurological disease caused by the presence of Taenia solium cysticerci in the central nervous system. T. solium uses an alternative mechanism for processing some mRNAs, known as trans-splicing, in which a small RNA molecule (Spliced Leader, SL) is added to the 5' end, of one pre-mRNA molecule, leading to the formation of different mature mRNAs that all contain a common 5' end. The aim of this study was to analyze the sequences of some of the molecules that undergo this type of post-transcriptional processing in order to learn more about this mechanism in T. solium. Expression libraries of T. solium cysticerci were screened using PCR with SL as the forward primer and ZAP 3' UP, an oligonucleotide that hybridizes to the vector sequence, as the reverse primer. Different cDNAs were obtained which were cloned in the pGEM-T-easy plasmid, sequenced and then compared with sequences in databases (GenBank). A total of 14 different molecules showing similarities to T. solium, Echinococcus sp. and Hymenolepis sp. proteins were obtained. Complete transcripts encoding a variety of proteins that are part of the biology of living organisms, such as enzymes, transporters and structural proteins, were also identified. Although we could not determine whether specific cDNA groups (with common functions) are selected to carry out this post-transcriptional modification, we were able to observe that the process of trans-splicing occurs in a variety of RNAs that code for several proteins biologically important for T. solium.

La enfermedad de Chagas y leishmaniasis pertenecen al grupo de las Enfermedades Tropicales Desatendidas, son zoonosis consideradas problemas de salud pública en Venezuela, presentes en zonas rurales, suburbanas y urbanas. La transmisión de ambas se da por procesos complejos, en los cuales se modifica el medio ambiente favoreciendo la infección con estos dos grupos de protozoarios, tienen un hospedador susceptible común, el humano, muchos de sus focos geográficos coinciden y pueden existir además, prácticas y actitudes que unidas al desconocimiento de las formas de transmisión de estas enfermedades, pudiesen favorecer el encuentro y la infección/coinfección. Para el estudio de estas se propone el enfoque de Ecosalud, el cual permite identificar interacciones entre los sistemas sociales y ecológicos, que se conecta con el pensamiento complejo, con una mirada desde sus principios fundamentales: 1) pensamiento sistémico, 2) investigación transdisciplinaria 3) participación social, 4) sostenibilidad social y ambiental, 5) equidad de género y social, y 6) el acercamiento de la brecha entre conocimiento y acción, los cuales podrían aportar datos importantes de gran ayuda para proponer políticas públicas de salud, que fortalezcan los programas de control para estas enfermedades.

Chagas disease and leishmaniasis belong to the group of Neglected Tropical Diseases are zoonosis considered as a public health problem in Venezuela, present in rural, suburban and urban areas. The transmission of both is given by complex processes, which modifies the environment favoring infection with these two groups of protozoa have a common susceptible host, human, many of their geographical foci coincide and can also exist, practices and attitudes linked to ignorance of the modes of transmission of these diseases could encourage contact and infection /coinfection. To study these the Ecohealth approach, which allows to identify interactions between social and ecological systems, which connects to the complex thought, with a view from its fundamental principles proposed: 1) systems thinking, 2) transdisciplinary research 3) social participation, 4) social and environmental sustainability 5) gender equality and social, and 6) the approach of the gap between knowledge and action, which could provide important information of great help to propose public health policies, to strengthen the control programs for these diseases.