As heparinas não fracionadas são utilizadas clinicamente como anticoagulantes. A potência biológica de 13 amostras de matérias-primas e produtos farmacêuticos foram avaliadas em relação ao 5ª Padrão Internacional de heparina pelos ensaios da inibição da coagulação do plasma ovino, tempo de tromboplastina parcial ativada, anti-fator Xa e anti-fator IIa, que forneceram potências médias de 101,15%, 96,15%, 98,15% e 99,37%, respectivamente. As amostras foram também submetidas ao teste de neutralização pela protamina que apresentou resultados entre 92-138 UI/mg. Demonstrou-se reprodutibilidade e correlação significativa do ensaio do anti-fator IIa com os farmacopeicos, constituindo-se em alternativa ao ensaio da inibição da coagulação do plasma ovino. Além disso, as análises realizadas por ressonância magnética nuclear e eletroforese capilar mostraram picos correspondentesà condroitina supersulfatada. Os resultados mostraram variações lote-a-lote e a qualidade das amostras contribuindo para aprimorar o controle de qualidade dos produtos farmacêuticos e garantir a segurança e eficácia terapêutica desses produtos biológicos.

Unfractionated heparins are used clinically as anticoagulants. The biological potency of thirteen samples of raw material and pharmaceutical formulations were assessed utilizing the 5th International Standard of heparin using the sheep plasma coagulation inhibition assay, activated partial thromboplastin time, anti-factor Xa assay, and anti-factor IIa assay, resulting in mean potencies of 101.15%, 96.15%, 98.15% and 99.37%, respectively. The samples were also evaluated by the protamine neutralization test giving results within the range of 92 - 138 IU/mg. The anti-factor IIa assay was performed showing reproducibility and significant correlation with the pharmacopoeial assays, thus demonstrating it to be a feasible alternative to the sheep plasma coagulation inhibition assay. Moreover, an analysis by nuclear magnetic resonance and capillary electrophoresis showed some peaks attributable to oversulfated chondroitin sulfate. The results show that batch-to-batch variations and the quality of samples contributed to improvements in the quality control of pharmaceutical products and to assure the safe use and clinical efficacy of this biological medicine.

Avaliaram-se os efeitos do valdecoxibe, um inibidor seletivo da cicloxigenase-2 (COX-2), sobre os parâmetros sangüíneos da coagulação em ratos Wistar utilizando-se paralelamente a aspirina. Os animais foram divididos em grupos e submetidos à administração oral diária de 10 mg/kg animal para o valdecoxib, 100 mg/kg animal para a aspirina e veículo para o grupo controle, durante quatro semanas. A coleta do sangue foi efetuada após uma, duas, três e quatro semanas, e as concentrações plasmáticas do valdecoxibe determinadas por cromatografia líquida, obtendo-se valores médios de 101,1 - 113,5 - 164 e 184,6 ng/ml, respectivamente. As amostras de plasma foram também usadas para as análises hematológicas e os resultados comparados aos dos controles. O valdecoxibe apresentou redução significativa no TTPA (18%) após duas semanas, e redução do TP (12,2%) após três semanas (P<0.05). Os efeitos observados na contagem de plaquetas e nos níveis plasmáticos de fibrinogênio não foram significativos. As atividades anti-fator Xa e anti-fator IIa apresentaram redução, porém os resultados foram significativos somente para o anti-fator Xa na terceira semana (6,7%). Os resultados experimentais com as concentrações plasmáticas alcançadas demonstram que o valdecoxibe pode induzir alterações nos parâmetros hematológicos dos ratos. Esses dados poderão contribuir para a melhor compreensão dos efeitos colaterais e uso do fármaco com segurança.

The effects of the cyclooxygenase (COX)-2 selective inhibitor, valdecoxib, on blood coagulation parameters were evaluated, along with aspirin in male Wistar rats. Groups of animals were administered a daily oral dose of 10 mg/kg rat of valdecoxib, 100 mg/kg rat of aspirin and the vehicle alone during 4 weeks. Blood samples were collected at the end of 1, 2, 3 and 4 weeks of administration period and the plasma concentrations of valdecoxib were determined by RP-HPLC giving mean values of 101.1, 113.5, 164.0 and 184.6 ng/mL, respectively. The same plasma samples were used for the analysis of hematological parameters and the results compared to the controls. Valdecoxib induced significant activated partial thromboplastin time reduction (18%) after 2 weeks and prothrombin time reduction (12.2%) after 3 weeks (P<0.05). There were no significant changes in the platelet count and fibrinogen levels. The anti-factor Xa and anti-factor IIa activities showed slight reductions, but only significant for the anti-factor Xa on the 3rd week (6.7%). The results showed that valdecoxib at the dose tested with the plasmatic concentrations induced some changes in the hemostatic function of rats, which can be helpful to understand the side effects and the safe use of the drug.

Realizou-se a comparação de metodologia para avaliação de pirogênios em produtos farmacêuticos. Otimizou-se o teste da hipertermia em coelhos elaborando a curva dose-resposta com o 2º Padrão Internacional de endotoxinas bacterianas, com base na qual determinou-se a concentração de 13,81 UE/mL por kg de peso corporal, necessária para produzir aumento de temperatura de 0,5ºC. Observou-se que o limite de 0,5ºC forneceu resultados comparáveis com as doses pirogênicas para o homem. Padronizou-se o teste do lisado de amebócitos do Limulus (LAL) com determinação do ponto final cromogênico e por geleificação, que foram utilizados para a avaliação de produtos farmacêuticos obtendo-se resultados concordantes. Avaliaram-se as respostas de reagentes LAL reativos e não-reativos a beta-glicanos, observando diferenças que poderiam reprovar amostras com base em resultados falso-positivos. Executou-se o teste de interferências, validou-se o procedimento e estabeleceu-se a máxima diluição válida para produtos farmacêuticos sem especificações farmacopéicas. Os resultados enfatizam a importância e as limitações dos ensaios preconizados para avaliação da pureza e controle da qualidade de produtos farmacêuticos parenterais, contribuindo para aprimorar as metodologias existentes no contexto da redução e substituição dos modelos animais.

A comparison of methodologies for detection of pyrogens in pharmaceutical products was performed. The rabbit pyrogen test was optimized and the dose-response curve was obtained for the 2nd International Standard for bacterial endotoxins, establishing 13.81 EU/mL/kg as the concentration of endotoxin necessary to induce a temperature rise of 0.5ºC. The 0.5ºC cut-off was shown to give results that were more compatible with the pyrogenic doses for humans. The Limulus amoebocyte lysate test (LAL) was standardized with gel-clot and chromogenic endpoints, and used for the comparative evaluation of pharmaceutical products showing good agreement. The use of beta-glucan-reactive and non-reactive LAL reagents identified some products with false-positive results. The interference test was carried out and the specifications validated for some new products as the maximum valid dilution. The results emphasized the importance and limitations of the assays recommended for the evaluation of purity and quality control of parenteral medicinal products, improving the existing methodologies in the context of reduction and replacement in the use of animal models.

Realizou-se a identificação do fator estimulador da colônia de granulócitos humanos recombinante em produtos farmacêuticos por eletroforese em gel de poliacrilamida não redutora e imunodetecção com anticorpos específicos, que apresentaram banda única na região de, aproximadamente, 19 kDa. A avaliação de potência baseada na contagem do número de neutrófilos em camundongos com neutropenia forneceu valores entre 88,4 - 122,4 % em relação à potência declarada. A precisão expressa pela ponderação, calculada nos ensaios independentes, forneceu valores entre 141 e 432. As amostras lote-a-lote cumpriram os requisitos dos testes de toxicidade e endotoxinas bacterianas. Os resultados dos ensaios biológicos e imunológicos demonstram a qualidade dos produtos farmacêuticos em uso clínico, e as especificações sugeridas contribuem para assegurar a inocuidade e eficácia terapêutica dos produtos biológicos.

The identification of rhG-CSF was carried out in pharmaceutical preparations by non-reducing polyacrylamide gel electrophoresis and western blotting with specific antibodies, showing a single band in the 19 kDa region. The potency was assessed by the neutropenia mouse bioassay giving values between 88.4 and 122.4% of the stated potency. The precision index expressed by weight was between 141 and 432 for the independent assays. Batch-to-batch, the samples met the requirements for the safety test and bacterial endotoxins test. The biological and immunological results showed the quality of the products in clinical use and the specifications established contribute to assuring the safety and efficacy of biological medicines.

Realizou-se a avaliação biológica de potência de heparinas convencionais contra o 5º Padrão Internacional de heparina suína pelos ensaios preconizados da inibição da coagulação do plasma ovino (ICPO), tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA) e anti-fator Xa. Correlacionaram-se os resultados, demonstrando que o ICPO fornece potências em média 10,72%, significativamente superiores aos outros procedimentos. Analisou-se a influência de diferentes lotes de plasma sobre o resultado do ensaio do ICPO observando-se variação de até 7,32%. Como alternativa, padronizou-se o ensaio do anti-fator IIa e efetuou-se a determinação de potência das amostras obtendo-se valores reprodutíveis, comparáveis ao método do anti-fator Xa, que demonstram a viabilidade da inclusão como ensaio harmonizado para o controle da qualidade. Os resultados de potência, fornecidos lote a lote, em geral, cumprem as especificações farmacopéicas e demonstram a qualidade que garante a segurança e eficácia clínica dos medicamentos.

The biological evaluation of unfractionated heparins was carried out against the 5th International Standard of porcine heparin using the pharmacopoeial-recommended assays: the sheep plasma coagulation inhibition assay (SPCIA), activated partial thromboplastin time (APTT) and anti-factor Xa activity. The SPCIA method gave mean potencies which were 10.72% significantly higher than the other procedures. The effect of differences in plasma batches revealed potency variations of up to 7.32%. The anti-factor IIa assay was standardized as an alternative method for the potency assessment of heparin samples. The values obtained were in good agreement with the anti-factor Xa assay results, demonstrating the feasibility of the method as a harmonized assay for the quality control of medicines. Analysis of the potency estimates showed that generally batch-to-batch variations complied with pharmacopoeial specifications, demonstrating the overall quality of the products and assuring their safety and clinical efficacy.

Realizou-se a identificação de eritropoietina humana recombinante em produtos farmacêuticos comerciais por eletroforese em gel de poliacrilamida e detecção com anticorpos específicos, demonstrando-se típica banda larga, semelhante ao padrão de rhEPO da Farmacopéia Européia. Igualmente por focalização isoelétrica e imunodetecção, observaram-se 5-6 isoformas características de acordo com o laboratório produtor. A avaliação de potência efetuada através de ensaio biológico em camundongos normocitêmicos forneceu valores entre 67,6% e 119,4% em relação à declarada. A precisão dos ensaios combinados, calculada pela ponderação, variou de 200 a 389. Os testes de endotoxinas bacterianas, toxicidade e pH apresentaram valores variáveis conforme o lote. Concluiu-se destacando a importância dos testes e ensaios de controle para assegurar a qualidade lote a lote e garantir a eficácia terapêutica dos produtos farmacêuticos.

The identification of rhEPO in pharmaceutical products was carried out by polyacrylamide gel electrophoresis and detection with specific antibodies that revealed a typical single broad band similar to that obtained with the European Pharmacopoeia Biological Reference Preparation for erythropoietin. The isoelectric focusing with immunodetection revealed extensive heterogeneity with 5-6 isoforms, characteristic according to the manufacturer. The potency was assessed by the normocythaemic mouse assay with values within 67.6% and 119.4% calculated against the stated potency. The precision evaluated by the weight was within 200 and 389, for the combined assays. The toxicity, bacterial endotoxins, and pH gave variable results according to the batch. In conclusion, we emphasize the importance of the batch-to-batch tests and assays that would guarantee the quality and therapeutic efficacy of the pharmaceutical products.