A capacidade de um recombinante do herpesvírus bovino tipo 5 com deleção no gene da timidina quinase (BoHV-5tk∆) em estabelecer e reativar infecção latente foi investigada em cordeiros. Durante a infecção aguda, o vírus recombinante replicou na mucosa nasal em títulos moderados, porém menores do que os da cepa parental. Aos 40 dias pós-infecção (pi) DNA viral latente foi detectado no gânglio trigêmeo (TG) de todos os cordeiros em ambos os grupos. No entanto, a quantidade de DNA do vírus recombinante nos TGs foi 9,7 vezes menor do que do vírus parental, segundo determinação por PCR em tempo real. Assim, a deleção do gene tk (timidina quinase) não produziu efeito aparente sobre a frequência da infecção latente, porém reduziu a colonização do TG. Após a administração de dexametasona (Dx) no dia 40pi, os cordeiros inoculados com o vírus parental excretaram partículas virais infecciosas, contrastando com a falta de infectividade nas secreções nasais dos animais inoculados com o vírus recombinante. Entretanto, alguns suabes nasais dos cordeiros do grupo do vírus recombinante foram positivos para o DNA viral por PCR, indicando baixos níveis de reativação. Assim, a atividade da enzima timidina quinase não é requerida para o estabelecimento de latência pelo BoHV-5, mas parece fundamental para reativação eficiente da infecção latente após tratamento com Dx.

The ability of thymidine kinase (tk)-deleted recombinant bovine herpesvirus 5 (BoHV-5tkΔ) to establish and reactivate latent infection was investigated in lambs. During acute infection, the recombinant virus replicated moderately in the nasal mucosa, yet to lower titers than the parental strain. At day 40 post-infection (pi), latent viral DNA was detected in trigeminal ganglia (TG) of all lambs in both groups. However, the amount of recombinant viral DNA in TGs was lower (9.7-fold less) than that of the parental virus as determined by quantitative real time PCR. Thus, tk deletion had no apparent effect on the frequency of latent infection but reduced colonization of TG. Upon dexamethasone (Dx) administration at day 40 pi, lambs inoculated with parental virus shed infectious virus in nasal secretions, contrasting with lack of infectivity in secretions of lambs inoculated with the recombinant virus. Nevertheless, some nasal swabs from the recombinant virus group were positive for viral DNA by PCR, indicating low levels of reactivation. Thus, BoHV-5 TK activity is not required for establishment of latency, but seems critical for efficient virus reactivation upon Dx treatment.

Este trabalho relata a expressão de uma forma truncada da glicoproteína E (gE) do herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) para uso em imunodiagnóstico. Um fragmento de 651 pares de bases (pb) correspondente ao terço amino-terminal (217 aminoácidos) da gE do BoHV-1 - que compartilha uma alta identidade com a gE do BoHV-5 - foi clonada como proteína de fusão com cauda 6x de histidina em um vetor de expressão em Escherichia coli. Uma proteína solúvel de aproximadamente 25 kDa purificada de lisados de E.coli foi reconhecida em Western blot (WB) por anticorpos monoclonais anti-6xHis-tag e anti-gE. Além disso, a proteína recombinante purificada foi reconhecida em WB por anticorpos presentes no soro de animais soropositivos ao BoHV-1 e BoHV-5. Um ELISA indireto utilizando a proteína recombinante como antígeno apresentou performance comparável a um ELISA gE comercial e foi capaz e diferenciar sorologicamente animais vacinados com uma cepa gE-negativa de BoHV-5 de animais infectados com o BoHV-1. Portanto, a gE truncada pode ser útil em testes sorológicos diferenciais para uso conjunto com vacinas com marcador antigênico gE para o BoHV-1 e BoHV-5.

This article describes the expression of a truncated form of bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) glycoprotein E (gE) for use as immunodiagnostic reagent. A 651 nucleotide fragment corresponding to the amino-terminal third (217 amino acids) of BoHV-1 gE - that shares a high identity with the homologous BoHV-5 counterpart - was cloned as a 6×His-tag fusion protein in an Escherichia coli expression vector. A soluble protein of approximately 25 kDa purified from lysates of transformed E. coli was recognized in Western blot (WB) by anti-6xHis-tag and anti-BoHV-1 gE monoclonal antibodies. In addition, the recombinant protein was specifically recognized in WB by antibodies present in the sera of cattle seropositive to BoHV-1 and BoHV-5. An indirect ELISA using the expressed protein as coating antigen performed comparably to a commercial anti-gE ELISA and was able to differentiate serologically calves vaccinated with a gE-deleted BoHV-5 strain from calves infected with BoHV-1. Thus, the truncated gE may be useful for serological tests designed to differentiate BoHV-1/BoHV-5 infected animals from those vaccinated with gE-negative marker vaccines.

A imunogenicidade de vacina experimental inativada, produzida com uma cepa do herpesvírus bovino tipo 5 defectiva nos genes da timidina quinase e glicoproteína E (BoHV-5 gE/TKΔ) foi avaliada em bovinos e o resultado foi comparado com a resposta induzida pela cepa parental do BoHV-5 (SV507/99). Para a formulação da vacina, cultivos de células infectados com cada um dos vírus (SV507/99 ou BoHV-5 gE/TKΔ) foram inativados com etilenamina binária. Cada dose de vacina continha aproximadamente 107,5 TCID50 de um dos vírus inativados emulsionado em adjuvante oleoso (46:54). Quarenta bezerros de raças cruzadas, com idade entre seis a nove meses, foram alocados em dois grupos de 20 animais cada e vacinados duas vezes (dia 0 e 22 pv) pela via subcutânea com uma das vacinas. Amostras de soro foram coletadas no dia 0 e a vários intervalos após vacinação para a pesquisa de anticorpos neutralizantes frente ao vírus homólogo ou frente a isolados de BoHV-5 e BoHV-1. Os testes de soroneutralização (SN) demonstraram que todos os animais soroconverteram após a segunda dose da vacina (títulos médios de 17,5 para o grupo SV507/99; 24,1 para o grupo BoHV-5 gE/TKΔ). Todos os animais mantiveram níveis de anticorpos neutralizantes até o dia 116 pv, no entanto foi observada uma redução gradual no títulos. A sorologia cruzada com amostras heterólogas do BoHV-5 e BoHV-1 indicou que ambos os grupos vacinais reagiram em níveis similares frente ao mesmo vírus, no entanto a magnitude da resposta sorológica foi maior frente a amostras de BoHV-5. Os animais vacinados com a cepa recombinante não desenvolveram anticorpos contra a gE detectáveis por um ELISA específico, o que permitiria a sua diferenciação sorológica de animais infectados naturalmente. Esses resultados demonstram que a vacina contendo antígenos inativados do vírus recombinante BoHV-5 gE/TKΔ induziu resposta sorológica em níveis satisfatórios, constituindo-se, assim, em alternativa a cepa vacinal diferencial.

The immunogenicity of an inactivated, experimental vaccine based on a bovine herpesvirus type 5 strain defective in thymidine kinase and glycoprotein E (BoHV-5 gE/TKΔ) was evaluated in cattle and the results were compared with a vaccine containing the parental BoHV-5 strain (SV507/99). To formulate the vaccines, each virus (wildtype SV507/99 and BoHV-5 gE/TK∆) was multiplied in cell culture and inactivated with binary ethyleneimine (BEI). Each vaccine dose contained approximately of 10(7.5) TCID50 of inactivated virus mixed with an oil-based adjuvant (46:54). Forty calves, 6 to 9-months-old, were allocated into two groups of 20 animals each and vaccinated twice (days 0 and 22pv) by the subcutaneous route with either vaccine. Serum samples collected at day 0 and at different intervals after vaccination were tested for virus neutralizing (VN) antibodies against the parental virus and against heterologous BoHV-5 and BoHV-1 isolates. The VN assays demonstrated seroconversion to the respective homologous viruses in all vaccinated animals after the second vaccine dose (mean titers of 17.5 for the wildtype vaccine; 24.1 for the recombinant virus). All animals remained reagents up to day 116 pv, yet showing a gradual reduction in VN titers. Animals from both vaccine groups reacted in similar VN titers to different BoHV-1 and BoHV-5 isolates, yet the magnitude of serological response of both groups was higher against BoHV-5 field isolates. Calves vaccinated with the recombinant virus did not develop antibodies to gE as verified by negative results in a gE-specific ELISA, what would allow serological differentiation from naturally infected animals. Taken together, these results indicate that inactivated antigens of BoHV-5 gE/TK recombinant virus induced an adequate serological response against BoHV-5 and BoHV-1 and thus can be used as an alternative, differential vaccine candidate.

Os herpesvírus bovino tipos 1 e 5 (BoHV-1; BoHV-5) são genética e antigenicamente muito semelhantes e por isso são indistinguíveis pela maioria dos testes diagnósticos. Como o BoHV-1 tem sido classicamente associado com doença respiratória e genital, os herpesvírus isolados dessas enfermidades têm sido provisoriamente - e às vezes definitivamente - identificados como BoHV-1. Da mesma forma, os casos de infecção neurológica por herpesvírus em bovinos têm sido atribuídos em sua totalidade ao BoHV-5. Este trabalho relata a identificação de 40 amostras de herpesvírus isoladas de diferentes casos clínicos na região Centro-Sul do Brasil, Argentina e Uruguai entre 1987 e 2006, pelo uso de um PCR capaz de diferenciar esses vírus. As amostras identificadas como BoHV-1 (n=16) foram isoladas de doença respiratória (n=3), balanopostite e/ou vulvovaginite (n=3), do sêmen de touros saudáveis (n=5) e de casos doença neurológica (n=5). As amostras virais identificadas como BoHV-5 (n=24) foram em sua maioria isoladas de doença neurológica (n=21), mas também do sêmen de touros saudáveis (n=2) e do baço de um bezerro com doença sistêmica (n=1). Esses resultados demonstram que tanto o BoHV-1 como o BoHV-5 não estão estritamente associados às suas respectivas síndromes clínicas e que podem estar freqüentemente envolvidos em casos clínicos classicamente atribuídos ao outro vírus. Esses achados também reforçam a necessidade de se identificar corretamente os isolados de herpesvírus para um melhor conhecimento da sua patogenia e epidemiologia.

Bovine herpesviruses types 1 and 5 (BoHV-1; BoHV-5) are genetically and antigenically closely related such they can not be distinguished by routine diagnostic tests. As BoHV-1 has been historically associated with respiratory and genital disease, herpesviruses isolated from these clinical syndromes have been tentatively - and sometimes definitively - diagnosed as BoHV-1. Likewise, cases of herpetic neurological infection in cattle have been generally attributed to BoHV-5. This study reports the identification of 40 herpesvirus isolates from different clinical specimens and syndromes in central-southern Brazil, Argentina and Uruguay (1987-2006) by the use of a PCR able to differentiate between BoHV-1 and BoHV-5. BoHV-1 isolates (n=16) were identified in cases of respiratory disease (n=3), vulvovaginitis and/or balanoposthitis (n=3), in semen of healthy bulls (n=5) and in cases of neurological disease (n=5). Viruses identified as BoHV-5 (n=24) were isolated predominantly from cases of neurological disease (n=21), but also from semen of healthy bulls (n=2) and from a spleen of a calf with systemic disease (n=1). These results show that both BoHV-1 and BoHV-5 are not strictly associated with their respective diseases; yet are frequently involved in clinical conditions otherwise attributed to the other virus. These findings also reinforce the need of correctly identifying the herpesvirus isolates as to better understand their pathogenesis and epidemiology.

Infecção experimental de ovinos com o herpesvírus bovino tipo 5 (BHV-5) reproduziu vários aspectos da infecção pelo BHV-5 em bovinos. Inoculação intranasal foi seguida de extensiva replicação viral na cavidade nasal, excreção e transmissão do vírus a outros animais, estabelecimento e reati-vação de latência, e o desenvolvimento de meningoencefalite clínica em um animal. Ovinos inoculados com a amostra brasileira EVI-88 apresentaram hipertermia transitória, hiperemia da mucosa nasal e corrimento nasal de seroso a muco-purulento. Os animais eliminaram vírus em secreções nasais em títulos de até 107,11DICC50/ml por até 16 dias. Um cordeiro apresentou sinais clínicos de encefalite no dia 10 pós-inoculação, sendo sacrificado in extremis no início do dia 13. Infectividade foi detectada em várias regiões do encéfalo desse animal, incluindo os hemisférios anterior e posterior, córtex dorso- e ventro-lateral, ponte, pedúnculo cerebral, cerebelo e bulbo olfatório. Alterações histológicas foram observadas em várias regiões do encéfalo, principalmente no hemisfério anterior, córtex ventro-lateral e pedúnculos cerebrais, e consistiram de meningite mononuclear, manguitos perivasculares, gliose focal, necrose e inclusões intranucleares em neurônios . Quatro ovinos mantidos como sentinelas adquiriram a infecção e eliminaram vírus a partir do final do segundo dia, até 7 dias. Ovinos inoculados com a amostra argentina A663 apresentaram apenas hiperemia e umidecimento da mucosa nasal, embora eliminassem vírus nas secreções nasais por até 15 dias. Tratamento dos animais com dexametasona a partir do dia 50 pós-inoculação provocou reativação da infecção latente e eliminação viral durante até 11 dias por 76,9% (10/13) dos animais inoculados e por 100% (3/3) dos animais sentinela. Esses resultados demonstram que ovinos são susceptíveis à infecção aguda e latente pelo BHV-5 e sugerem que infecções naturais de ovinos por este vírus podem potencialmente ocorrer. Ness sentido, uma possível participação da espécie ovina como reservatório natural desse vírus deve ser melhor investigada.

Experimental inoculation of lambs with bovine herpesvirus type 5 (BHV-5) reproduced several aspects of the BHV-5 infection in cattle. Intranasal inoculation was followed by efficient viral replication and shedding, establishment and reactivation of latency, and even the development of meningoencephalitis in one animal. Lambs inoculated with the brazilian isolate EVI-88 showed transient hipertermia, nasal hiperemia and discharge ranging from serous to muco-purulent. The animals shed virus in nasal secretions in titers up to 107.11 TCID50/ml during up to 16 days. One lamb showed clinical signs of encephalitis on day 10 post inoculation (pi), being euthanized in extremis on day 13. Infectious virus was recovered from several areas of the brain of this lamb, including anterior and posterior cerebrum, dorso- and ventro-lateral hemisphere, cerebellum, pons, midbrain and olfactory bulb. Histological changes were observed in several regions of the brain, most consistently in the anterior cerebrum, ventro-lateral cortex and midbrain, and consisted mainly of meningitis, perivascular mononuclear cuffing, focal gliosis, neuronal necrosis and intranuclear inclusions. Four lambs used as sentinels acquired the infection and shed virus starting at the 2nd day pi during up to 7 days. Lambs inoculated with the argentinian isolate A663 showed only mild respiratory signs, although they shed virus for up to 15 days. Administration of dexamethazone to the animals starting at day 50 pi was followed by reactivation of the latent infection and viral shedding during up to 11 days by 76.9% (10/13) of the inoculated lambs and 100% (3/3) of the sentinels. These results demonstrate that sheep are susceptible to BHV-5 acute and latent infection and suggest that natural infections by this virus in sheep may potentially occur. In this sense, a possible role of this species in the epidemiology of BHV-5 infections awaits further investigation.