RESUMO: Este estudo teve como objetivo avaliar a diversidade genética e a suscetibilidade a antimicrobianos de cepas de Staphylococcus aureus isoladas de vacas leiteiras em Minas Gerais, Brasil. Trinta e sete cepas provenientes de cinco municípios (oito rebanhos) foram genotipadas usando a técnica multi-locus sequence typing (MLST) e a suscetibilidade a 12 antimicrobianos foi avaliada pelo método de difusão em disco. Foram detectadas altas taxas de resistência para penicilina [75,68% (28/37)], ampicilina [70,27% (26/37)] e tetraciclina [70,27% (26/37)] entre os isolados. A multirresistência foi observada em sete [18,92% (7/37)] isolados e dois foram classificados como sugestivos de Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA). Entre os 37 isolados, 33 novos sequence types (ST) e dois STs conhecidos (ST126 e ST746) foram identificados pelo MLST. Os complexos clonais mais frequentemente observados foram: CC97 [78,38%; (29/37)], CC1 [8,11%; (3/37)] e CC5 [5,40%; (2/37)]. Foi construída uma minimum‐spanning tree (MSTs) com todos isolados estudados e esta não mostrou padrão de agrupamento quando comparada com dados epidemiológicos como municípios e rebanho, do qual foi isolado, e perfis de resistência a antimicrobianos. Uma segunda MST foi construída comparando os isolados deste estudo e todas as cepas de S. aureus depositadas no banco de dados PubMLST provenientes do Brasil, que mostrou associação entre o genótipo, STs e a origem da cepa. Foi possível observar entre os isolados do estudo que, aqueles que pertenciam ao CC97, eram geneticamente mais próximos das cepas depositadas no PubMLST isoladas de leite e de produtos lácteos, enquanto aqueles que pertenciam aos CC1 e CC5 estavam mais próximos a cepas isoladas de humanos ou do ambiente de fazendas e indústrias de laticínios. Em conclusão, nossos resultados mostraram um alto índice de resistência às penicilinas e tetraciclinas e grande diversidade genética entre as cepas de S. aureus isoladas de casos de mastite bovina.

ABSTRACT: This study evaluated the genetic diversity and antimicrobial susceptibility of Staphylococcus aureus isolates from dairy cows in Minas Gerais, Brazil. Thirty-seven isolates from five municipalities (8 herds) were genotyped using multi-locus sequence typing (MLST) and susceptibility to 12 antimicrobial agents was tested using the disk diffusion method. High resistance rates for penicillin [75.68% (28/37)], ampicillin [70.27% (26/37)], and tetracycline [70.27% (26/37)] were detected. Multidrug resistance was observed in seven [18.92% (7/37)] isolates, and two were suggestive of Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Among the 37 isolates, 33 novel sequence types (ST) and two known STs (ST126 and ST746) were identified in MLST. The clonal complexes more frequently observed were: CC97 [78.38%; (29/37)], CC1 [8.11%; (3/37)] and CC5 [5.40%; (2/37)]. Minimum‐spanning tree (MST) analysis according to data from municipalities, herds, and resistance patterns for all isolates did not show any clustering pattern. However, the MST comparing all Brazilian S. aureus isolates deposited in the PubMLST database and from this study depicted an association between the genotype and strain origin (clinical sample). Isolates from this study that belong to CC97 were close to database isolates from milk and dairy products, while those that belong to CC1 and CC5 were close to database isolates from human sources and the environment of dairy farms or industries. In conclusion, our results showed a high rate of resistance to penicillins and tetracyclines and great genetic diversity among the S. aureus isolates from bovine mastitis genotyped in the present study.

A pele da teta é uma das principais fontes de contaminação microbiana do leite cru, além de ser uma fonte de infecção da glândula mamária. Este estudo comparou diferentes métodos de preparação do úbere, incluindo a participação do bezerro para estimular a descida do leite, em relação à contaminação microbiana da pele da teta. Um experimento com 36 vacas ordenhadas mecanicamente foi conduzido para comparar três procedimentos (A, B, C) de preparação do úbere. Duas tetas de cada vaca foram amostradas para contagem total de bactérias (CTB) e de coliformes, antes e após lavagem com água e secagem com papel toalha descartável (A); procedimento A, mais imersão das tetas em solução de iodo (4.000ppm) e secagem com papel toalha descartável (B); higienização com toalha de papel embebida em solução desinfetante contendo clorexidina (C). O segundo experimento incluiu 16 vacas ordenhadas manualmente, na presença do bezerro. Permitiu-se a cada bezerro mamar as quatro tetas por alguns segundos, de acordo com o manejo do rebanho. Amostras para bacteriologia de duas tetas de cada vaca foram coletadas, antes, após a mamada do bezerro, e após higienização semelhante ao procedimento C, citado acima. Os tratamentos foram analisados usando-se o teste não- paramétrico de Kruskal-Wallis, considerando-se os dados de tCTB após o uso de um dos métodos de preparação do úbere ou da mamada do bezerro. Usou-se a transformação das contagens bacterianas para a escala logarítmica em base 10, com a fórmula tCTB=log10(CTB+0,5). Para os grupos A, B e C (primeiro experimento), os valores médios de diminuição de tCTB foram 1,8, 2,2 e 2,4, respectivamente. No segundo experimento, as CTB's aumentaram significativamente (P<0,05) de 3,2 para 4,3 após a mamada do bezerro, mas houve uma redução (P<0,01) de mais de dez vezes após a aplicação do desinfetante (2,0). Os resultados indicaram que: (a) lavagem das tetas com água seguida de secagem com papel toalha reduz o número de microrganismos da superfície das tetas, mas a redução é muito maior quando se emprega um desinfetante; (b) a mamada do bezerro antes da ordenha aumenta em mais de dez vezes o número de bactérias na superfície das tetas; (c) o número de bactérias na pele das tetas pode ser reduzido em mais de 90% após a mamada do bezerro, se as tetas forem cuidadosamente desinfetadas. Nas condições dos experimentos realizados, a presença de coliformes foi insignificante.

The teat skin is one of the main sources of microbial contamination of raw milk as well as a source of mastitis infection. This study assessed the microbial load of the teat skin following the application of the different practices for preparing the udder, including the use of calf suckling to stimulate the letdown of milk. Thirty-six cows milked by machine were included in one experiment. Two teats of each cow were sampled for bacteriology before and after using one of three methods of udder preparation, as follows: rinsing with water and drying with single paper towels (A); method A plus pre-dipping with an iodine teat dip (4,000ppm) and drying with single paper towels (B); wiping teats using a commercial wet non-woven wipe pre-soaked with a solution containing chlorexidine (C). The second experiment included 16 cows milked by hand. The calf of each cow was allowed to suck the four teats for a few seconds, and then two teats per cow were sampled for bacteriology. Samples were collected before, after calf sucking and following teat pre-milking treatment (as for group C, above). Statistical analysis was conducted on transformed (log10) data with tTBC=log10(TBC+0.5) using a Kruskal-Wallis test. Each treatment was analysed considering the difference in tTBC after the use of either method of preparation of the udder or calf sucking. For groups A, B and C (first experiment), tTBC values were reduced 1.8, 2.2 and 2.4, respectively. In the second experiment, tTBC increased significantly (P<0,05) after calf sucking (from 3.2 to 4.3). After disinfection the tTBC was significantly reduced to 2.0. These results show that: (a) teat rinsing with water and wiping dry reduces the number of microorganisms on the teat skin, but the reduction is significantly higher when teats are disinfected; (b) calf sucking before milking increases significantly the number of microorganisms on teat skin; (c) the number of microorganisms on teat skin can be reduced more than 10 times after calf sucking if teats are disinfected. Very low numbers or no growth of coliforms were observed in all cases.

O "California Mastitis Test" (CMT) estima o conteúdo de células somáticas no leite e é interpretado subjetivamente, estabelecendo-se escores que, na maioria dos casos, variam de 1 a 5. O escore 1 indica uma reação completamente negativa e os de 2-5 indicam graus crescentes de resposta inflamatória do úbere, sendo normalmente considerados como indicativos de mastite subclínica. Dependendo da interpretação dos escores, o CMT pode produzir resultados falso-positivos ou falso-negativos. Esse trabalho teve o objetivo de avaliar a sensibilidade e a especificidade do CMT em relação à contagem de células somáticas (CCS). Foram utilizadas 3.012 amostras de leite provenientes de 760 vacas Holandesas ou mestiças Holandês-Zebu, pertencentes a 15 rebanhos. Todas as amostras foram submetidas ao CMT e processadas para CCS em equipamento Fossomatic 90. Os valores médios de CCS (x 1.000 células/ml) obtidos para os escores de CMT foram 1 (79,9), 2 (333,5), 3 (670,3), 4 (1.354,0) e 5 (4.455,6). Três opções de interpretação (doente/não-doente) para o CMT foram testadas, em relação aos valores de CCS, iniciando com 100.000 células/ml: (a) 1 versus 2, 3, 4, e 5; (b) 1 e 2 versus 3, 4 e 5; (c) 1, 2, 3 versus 4 e 5. As sensibilidades do CMT em identificar corretamente quartos mamários acima de 200.000 células/ml foram 79%, 61% e 34%, para as opções a, b e c, respectivamente. Para identificar corretamente contagens acima de 500.000 células/ml, as sensibilidades do CMT, para as opções a, b e c, foram, respectivamente: 93%, 82% e 54%. A sensibilidade do CMT em identificar quartos mamários com mastite subclínica foi adequada (acima de 80%) quando a interpretação do teste foi mais rigorosa (opções a e b). A interpretação da reação 3 como negativa (opção c) só alcançou sensibilidade de 80% para contagens entre 1.200.000 e 1.400.000 células/ml. As especificidades do CMT, para CCS de 200.000 e 500.000 foram, respectivamente, 90% e 80% (opção a), 97% e 90% (opção b) e 99% e 97% (opção c).

The California Mastitis Test (CMT) is a simple and widely used diagnostic tool for subclinical mastitis. It is used even in areas where laboratory facilities are available for diagnosis and monitoring program purposes. CMT usually score 1-5, where 1 indicates a completely negative reaction and 2-5 increasing degrees of inflammatory reaction of the udder. The reactions 2-5, 3-5 or 4-5 may be considered as indicative of subclinical mastitis, bever, may produce either false-positive or false-negative results. The aim of this study waecause they are related to an increase of the somatic cell count (SCC) in the milk. This variation, hows to assess the sensitivity and specificity of the CMT in comparison with SCC. A total of 3,012 quarter milk samples from 760 lactating cows were examined. CMT was evaluated at the moment of sampling at cow side and SCC in the laboratory, with a fluoro-opto-electronic method (Fossomatic 90). The average CCS (x 1,000 cells/ml) for CMT scores were: 1 (79.9), 2 (333.5), 3 (670.3), 4 (1,354.0) and 5 (4,455.6). Three options for CMT interpretation were evaluated in relation to a range of CCS, starting from 100,000 cells/ml: (a) 1 versus 2, 3, 4, and 5; (b) 1 and 2 versus 3, 4 and 5; and (c) 1, 2 and 3 versus 4 and 5. The sensitivities of CMT scoring to detect quarters with SCC >200,000/ml were 79%, 61% e 34% for options a, b and c, respectively. The sensitivities of CMT scores for SCC >500,000/ml for options a, b and c, were, respectively, 93%, 82% e 54%. The sensitivity of CMT scores to identify subclinical mastitis was satisfactory (above 80%) when options b and c were used. The interpretation of CMT score 3 as negative for subclinical mastitis was considered as adequate (sensitivity around 80%) only when CCS ranged between 1,200,000 and 1,400,000 cells/ml. The specificities of CMT scoring for CCS of 200,000 and 500,000 were, respectively, 90% and 80% (option a), 97% and 90% (option b) and 99% and 97% (option c).

Com o objetivo de verificar a utilidade da detecção de soroalbumina (BSA) e imunoglobulinas (Ig) no leite como diagnóstico da mastite subclínica, avaliou-se a relação entre a concentração dessas proteínas, o exame microbiológico e o teste "California Mastitis Test" (CMT). Amostras de leite de 172 quartos mamários previamente examinadas pelo CMT foram colhidas e levadas imediatamente ao laboratório para exames bacteriológicos. Uma alíquota de cada amostra foi congelada a -20°C e posteriomente testada para a presença de BSA e Ig, por meio da técnica de imunodifusão radial simples. Das amostras testadas, 111 apresentaram níveis fisiológicos de BSA (< 0,2mg/ml) e de Ig (< 0,5 mg/ml), 22 apresentaram níveis elevados de ambas proteínas e 39 apresentaram níveis elevados de Ig, mas níveis fisiológicos de BSA. Concentrações de BSA e Ig acima dos limites fisiológicos foram observadas mais frequentemente em amostras onde o CMT apresentou reação de maior severidade (+++) e naquelas onde foram isoladas Streptococcus spp. e Staphylococcus aureus. Entre as 88 amostras positivas no exame bacteriológico, níveis de BSA e Ig acima do limite fisiológico foram observados em 10 e 35, respectivamente. Em amostras onde não se isolou bactérias (84 das 172 examinadas), níveis fisiológicos de BSA e Ig foram observados em 72 e 58 delas, respectivamente. A detecção de BSA e Ig nas amostras de leite forneceu informações adicionais sobre o grau de lesão tecidual, mas não pode ser considerada como um indicador sensível para detecção precoce da reação inflamatória.

This work aimed to evaluate the feasibility of milk serum albumin (BSA) and immunoglobulin (Ig) detection for the diagnosis of subclinical mastitis. Bacteriological examinations and concentrations of BSA and Ig were determined in 172 milk samples. The samples were also examined by the California Mastitis Test (CMT). Immediately after collection, the samples were taken to the laboratory and bacteriologically examined. An aliquot of each sample was kept at -20°C and later, concentrations of BSA and Ig were determined by radial immunodiffusion. A total of 111 milk samples had physiological levels of BSA (< 0.2 mg/ml) and Ig (< 0.5mg/ml). Twenty-two samples had higher levels of both proteins and 39 samples had higher levels of Ig and physiological levels of BSA. Concentrations of BSA and Ig above the physiological levels were more frequently observed in quarters samples with severo (+++) CMT reaction and udder infection caused by Streptococcus spp and Staphylococcus aureus. In bacteriologically positive quarters (88 out of 172), increased levels of BSA and Ig were found in 10 and 35 samples, respectively. In the bacteriologically negativo quartors (84 out of 172), physiological levels of BSA and Ig were found in 72 and 58 samples, respectively. Although BSA and Ig measurements in milk samples gave further information about udder tissue damage, they can not be used as a sensitive parameter to detect early inflammatory reaction.